Annona muricata L. - Jurnal Fakultas Kedokteran Universitas

ISSN 2337-3776
The Chemopreventive Effects of Extracts Compare with Infuse of Soursop
Leaves (Annona muricata L.) in Breast Tissue of Female Sprague-Dawley
Rats Induced by Dmba
Setiyadi B, Susantiningsih T, Apriliana E, Windarti I
Faculty of Medicine University of Lampung
Abstract
Breast cancer is a malignancy derived from epithelial ducts and lobules. The breast
cancer is the second most common cancer in Indonesia after cervical cancer.The medical
treatment of cancer still has a lot of side effects. this can be minimized by using
chemopreventive agents of soursop leaf infusion and extract which works selectively
attacking cancer cells. This study is an experimental study with Post Test Only With
Control Group Design, using 24 female Sprague-Dawley Rats and simply randomized
into 4 groups. Group K (negative control) had 1 cc of aquadest every day; Group 1
(positive control) had induced DMBA 20 mg/kg 2 times a week, and were given
Aquadest; Group 2 (extraction) had DMBA induced and soursop leaf extract dose of 40
mg / kg; Group 3 (infusion) had DMBA induced and soursop leaf infusion dose of 0.2 g /
ml. Each treatment is given by using a sonde orally for 4 weeks . From the results, the
average of epithelial hyperplasia are K(0.03), 1(2,2), 2(0.7), and 3(1.03). With KruskallWallis and continued with post-hoc test, there are significantly difference between groups
(p<0,05).
Key words : Soursop leaves , extract , infuse , DMBA
Perbandingan Efek Kemopreventif Pemberian Ekstrak dan Infusa Daun
Sirsak (Annona muricata L.) terhadap Gambaran Mikroskopis Jaringan
Payudara Tikus Betina Galur Sprague Dawley yang Diinduksi Dmba
Abstrak
Kanker payudara merupakan keganasan yang berasal dari epitel duktus dan lobulus.
Angka kejadian kanker payudara menempati urutan kedua di Indonesia setelah kanker
serviks. Upaya pengobatan dengan kemoterapi masih banyak menimbulkan efek samping.
Efek samping ini dapat diminimalisir dengan penggunaan agen kemopreventif dalam
infusa dan estrak daun sirsak yang bekerja secara selektif dalam menyerang sel kanker.
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan Post Test Only With Control Group
Design, menggunakan 24 ekor tikus putih betina galur sprague dawley yang diacak
kedalam 4 kelompok. Kelompok K(kontrol negatif) hanya diberi aquadest 1 cc setiap
hari; Kelompok 1(kontrol positif) diinduksi DMBA 20 mg/kg BB 2 x seminggu, dan
diberi aquadest; Kelompok 2(ekstraksi) diinduksi DMBA dan diberi ekstrak daun sirsak
dosis 40 mg/kg BB; Kelompok 3(infusa) diinduksi DMBA dan diberi infusa daun sirsak
dosis 0,2 gr/ml. Masing–masing perlakuan diberikan dengan sonde oral selama 4 minggu.
Dari hasil penelitian didapatkan rerata hiperplasia epitel kelompok K(0,03), 1(2,2),
2(0,7), dan 3(1,03). Dengan menggunakan uji statistik Kruskall-Wallis yang dilanjutkan
dengan uji post hoc Mann-Whitney didapatkan perbedaaan yang signifikan (p<0,05).
Kata kunci : Daun sirsak, ekstrak, infusa, DMBA
39
ISSN 2337-3776
Pendahuluan
Kanker payudara merupakan keganasan yang berasal dari epitel duktus dan
lobulus. Angka kejadian kanker payudara menempati urutan kedua setalah kanker
serviks dengan insidensi sebanyak 8.227 kasus atau sebesar 16,85% pada tahun
2007 di Indonesia (Fitricia dkk., 2012).
Pengobatan dengan menggunakan obat-obatan/ Kemoterapi yang sekarang
diterapkan, seperti taxol, klorambusil, alkaloid indo seperti vinblastin, dan
vinkristin, bekerja dengan cara mempengaruhi metabolisme asam nukleat
terutama DNA atau biosintesis protein secara tidak selektif, sehingga bersifat
toksik tidak hanya pada sel kanker tetapi juga pada sel normal, terutama sel
normal yang memiliki kecepatan proliferasi yang tinggi seperti sum-sum tulang
belakang (Siswandono, 2000). Penghambatan proliferasi sel-sel sum-sum tulang
belakang akan mengakibatkan penurunan jumlah leukosit sehingga menyebabkan
pasien rentan terhadap infeksi akibat menurunnya sistem imun. Dosis obat
sitostatik yang tinggi juga bisa menyebabkan terjadinya resistensi. Oleh karena
itu, diperlukan pendekatan terapi kanker yang lebih efektif dan selektif. Terapi
kanker menggunakan agen kemopreventif lebih menjanjikan daripada obat
antikanker konvensional (Hanahan & Weinberg, 2000).
Salah satu jenis tanaman yang dapat yang memiliki aktivitas sebagai agen
kemopreventif adalah sirsak, terutama pada daunnya. Zat aktif dalam tanaman
sirsak yang mampu berperan sebagai antikanker adalah Annonaceous acetogenins.
Acetogenins merupakan inhibitor kuat dari kompleks I mitokondria atau NADH
dehidrogenase. Zat ini akan mengakibatkan penurunan produksi ATP yang akan
menyebabkan kematian sel kanker, lalu kemudian memicu terjadinya aktivasi
jalur apoptosis serta mengaktifkan p53 yang dapat menghentikan siklus sel untuk
mencegah terjadinya proliferasi tak terkendali. Selain itu, senyawa triterpenoid
dan flavonoid di dalam daun sirsak juga memiliki efek antikarsinogenesis
(Retnani, 2011). Pada penelitian yang dilakukan Retnani (2011) telah terbukti
ekstrak daun sirsak dapat menghambat proses onkogenesis. Namun, yang
sekarang digunakan oleh masyarakat Indonesia secara umum adalah rebusan atau
infusa daun sirsak. Sehingga perlu dibandingkan, apakah penggunaan infusa daun
40
ISSN 2337-3776
sirsak dengan dosis optimal sama baiknya dengan penggunaan ekstrak daun sirsak
dengan dosis optimal dalam menghambat onkogenesis (Hatim, 2012).
Dari latar belakang di atas, maka peneliti bermaksud untuk mengetahui efek
kemopreventif pemberian ekstrak dan infusa daun sirsak (Annona muricata L. L.)
terhadap perubahan gambaran mikroskopis jaringan payudara tikus putih (Rattus
norvegicus)
betina
galur
Sprague
Dawley
yang
diinduksi
7,12
Dimethylbenz(a)anthracence (DMBA). Serta mengetahui perbandingan antara
keduanya.
Metode
Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan Post Test Only
With Control Group Design. Sampel dalam penelitian ini adalah Tikus putih
betina galur Sprague Dawley yang didapat dari IPB (Institut Pertanian Bogor)
dengan berat 100-200 berumur 5-7 minggu. Jumlah sampel adalah 24 ekor yang
diacak kedalam 4 kelompok perlakuan.
Waktu penelitian adalah 5 minggu. Satu minggu pertama masing-masih
kelompok dilakukan aklimatisasi/ pengadaptasian dengan tempat penelitian dan
makanan, 4 minggu berikutnya, Kelompok K (kontrol negatif) hanya diberi
aquadest 1 cc setiap hari; Kelompok 1 (kontrol positif) diinduksi DMBA 20
mg/kg BB 2 x seminggu selama 4 minggu, dan diberi aquadest 1 cc setiap hari;
Kelompok 2 (ekstraksi) diinduksi DMBA 20 mg/kg BB 2 x seminggu dan diberi
ekstrak daun sirsak dosis 40 mg/kg BB sekali sehari; Kelompok 3 (infusa)
diinduksi DMBA 20 mg/kg BB 2 x seminggu dan diberi infusa daun sirsak dosis
0,2 gr/ml sekali sehari. Masing–masing perlakuan diberikan dengan menggunakan
sonde oral selama 4 minggu.
Setelah minggu ke-6, jaringan payudara hewan coba diambil dan
kemudian dilakukan pembuatan preparat di Laboratorium Patologi Anatomi FK
Unila, lalu dilakukan pengamatan hiperplasia epitel duktus payudara dalam 5
lapang pandang. Kemudian pengamatan dikategorikan sesuai grade hiperplasia
yang didapatkan dengan memodifikasi penelitian Ting et al (2007), yaitu: grade 0
apabila gambaran mikroskopis normal; grade 1 apabila didapatkan hiperplasia
41
ISSN 2337-3776
ringan (2-4 lapis epitel yang mengalami hiperplasia); grade 2 apabila didapatkan
hiperplasia berat (>4 lapis epitel yang mengalami hyperplasia); grade 3 apabila
terdapat hiperplasia dengan atipia; grade 4 apabila mengalami karsinoma duktal
in situ; dan grade 5 apabila terjadi karsinoma duktal yang invasif.
Data hasil pengamatan diuji analisis menggunakan software statistik. Uji
yang pertama dilakukan adalah uji normalitas (uji Shapiro-Wilk). Apabila sebaran
data normal, dilakukan uji one way ANOVA. Tetapi bila sebaran data tidak
normal atau varians data tidak sama, dilakukan uji alternatif yaitu uji KruskalWallis. Uji ini bertujuan untuk mengetahui paling tidak terdapat perbedaan antara
dua kelompok perlakuan. Apabila pada uji tersebut didapatkan hasil bermakna
(p<0,05) maka dilakukan uji post-hoc. Uji post-hoc untuk one way ANOVA
adalah LSD sedangkan untuk uji Kruskal-Wallis adalah Mann Whitney.
Hasil
Rata-rata grade epitel dari tikus yang dihitung pada kelompok K (kontrol
negatif) yaitu sebesar 0,03 ± 0,81, kelompok 1 (kontrol postif) sebesar 2,2 ± 0,21,
kelompok 2 (ekstrak) sebesar 0,7 ± 0,10, dan kelompok 3 (infusa) sebesar 1,03 ±
0,15.
Kelompok
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
2,2 ± 0,21
1,03 ± 0,15
0,7 ± 0,10
0,03 ± 0,81
K
1
2
3
Gambar 1. Grafik perbandingan rerata gambaran epitel antar kelompok.
Data ini kemudian diolah dengan menggunakan program komputer.
Pertama, dilakukan uji normalitas data dengan menggunakan uji normalitas
42
ISSN 2337-3776
Shapiro-Wilk, uji ini dipilih karena jumlah sampel yang digunakan kurang dari
50. Setelah dilakukan uji normalitas, didapatkan hasil bahwa seluruh data tidak
memiliki distribusi yang normal dengan p<0,05 sehingga uji analisis yang
digunakan untuk data penelitian ini adalah uji alternative one way ANOVA, yaitu
Kruskall-Wallis.
Tabel 1. Hasil uji Kruskall-Wallis
Rerata Hiperplasia
Kelompok
N
Mean±SD
p
K
1
6
6
0,03 ± 0,81
2,2 ± 0,21
0,000
2
6
0,7 ± 0,10
3
6
1,03 ± 0,15
Setelah dilakukan Kruskal-Wallis diperoleh tingkat siginifikansi atau p pada
ketiga kelompok perlakuan adalah <0.05. Hal ini menunjukan bahwa minimal
terdapat dua kelompok yang memilik perbedaan yang signifikan. Untuk
mengetahui pengukuran mana yang berbeda, analisis data kemudian dilanjutkan
dengan uji post-hoc. Hasil uji Kruskal-Wallis dijelaskan pada Tabel 1 sedangkan
hasil uji post-hoc dijelaskan pada Tabel 2.
Tabel 2. Uji beda antar kelompok
p
Kelompok K vs Kelompok 1
0,002
Kelompok K vs Kelompok 2
0,002
Kelompok K vs Kelompok 3
0,003
Kelompok 1 vs Kelompok 2
0,003
Kelompok 1 vs Kelompok 3
0,003
Kelompok 2 vs Kelompok 3
0,004
Berdasarkan Tabel 2 hasil uji post-hoc, diperoleh data bahwa perbedaan
yang bermakna terjadi pada semua pengukuran. Terdapat perbedaan yang
bemakna antara kelompok K (kontrol negatif) dengan kelompok 1 (Kontrol
43
ISSN 2337-3776
positif) Perbedaan yang bermakna juga terdapat kelompok K (kontrol negatif)
dengan kelompok 2 (ekstrak daun sirsak), dan antara kelompok K (kontrol
negatif) dengan kelompok 3 (infusa daun sirsak),. Selain itu, perbedaan yang
bermakna juga terjadi antara kelompok 2 (ekstrak daun sirsak) dengan Kelompok
3 (infusa daun sirsak. Besarnya perbedaan pada setiap kelompok menghasilkan
nilai p<0,005.
Pembahasan
Dalam penelitian ini, digunakan agen kemopreventif alami yang berasal dari
ekstrak dan infusa daun sirsak yang mengandung bahan aktif yaitu acetogenin,
flavonoid, triterpenoid (Retnani, 2011). Menurut Retnani (2011) Acetogenins
merupakan inhibitor kuat dari kompleks I mitokondria atau NADH dehidrogenase.
Zat ini akan mengakibatkan penurunan produksi ATP yang akan menyebabkan
kematian sel kanker, lalu kemudian memicu terjadinya aktivasi jalur apoptosis
serta mengaktifkan p53 yang dapat menghentikan siklus sel untuk mencegah
terjadinya proliferasi tak terkendali. Flavonoid akan meningkatkan ekspresi enzim
gluthation S-transferase yang dapat mendetoksifikasi karsinogen sehingga cepat
dieliminasi oleh tubuh. Senyawa triterpenoid menstabilkan benang-benang spindel
pada fase mitosis sehingga proses mitosis terhambat. Triterpenoid juga
menginhibisi enzim topoisomerase yang akan menginduksi apoptosis dan
menghentikan siklus sel. Pada penelitian ini kemungkinan dapat terjadi hal yang
sama pada payudara tikus yang diinduksi DMBA yang telah diberikan ekstrak
serta infusa daun sirsak.
Dosis Ekstrak dan Infusa yang dibandingkan pada penelitian ini adalah
dosen potensial masing-masing. Pada penelitian Hermawan dan Laksono (2013)
dosis ekstrak daun sirsak yang paling berpengaruh dilihat dari kadar fenolnya
adalah dosis 40 mg/kgbb. Fenol merupakan salah satu gugus dari acetogenins.
Dosis untuk infusa sebagai kemopreventif menurut Syariefa (2011) dosis optimal
yang digunakan pada manusia adalah 8 gram daun sirsak dalam 3 gelas air. Dosis
ini lah yang akan digunakan untuk dikonversikan dari dosis manusia ke dosis
tikus dengan menggunakan rumus konversi Laurence dan Bacharach (1964).
44
ISSN 2337-3776
Dengan faktor konversi dosis dari manusia (70 kg) ke tikus (200gr) adalah 0,018,
maka dosis yang akan diberikan kepada tikus adalah 70/50 x 8 x 0,018 = 0,2 mg
dalam 2 ml.
Pada penelitian ini, didapatkan bahwa daun sirsak memiliki efek
kemopreventif dalam mengendalikan hiperplasia epitel pada jaringan payudara
tikus yang diinduksi DMBA. Hal ini terlihat dari pada uji Kruskall-Wallis yang
menunjukan bahwa paling tidak terdapat dua kelompok data yang mempunyai
perbedaan rerata yang bermakna. Lalu kemudian dilanjutkan dengan analisis post
hoc Mann Whitney. Hasil analisis post hoc menunjukan bahwa terdapat
perbedaan bermakna antara masing-masing kelompok. Hal ini berarti setiap
kelompok terdapat perbedaan rerata hiperplasia epitel yang bermakna.
Pada tabel 4 terlihat hasil rata-rata hiperplasia epitel pada gambaran
mikroskopis jaringan payudara. Rerata gambaran epitel pada kelompok K (kontrol
negatif) adalah 0,03. Persentase ini menunjukan bahwa dari semua lapang
pandang hanya 1 lapang pandang yang terlihat adanya gambaran hiperplasia, yaitu
hiperplasia ringan. Hal ini menunjukan bahwa epitel jaringan payudara kelompok
K normal. Pada kelompok 1 (kontrol positif), rerata hiperplasia epitel sebesar
1,86. Dari semua lapang pandang, selalu terlihat adanya hiperplasia, mulai dari
hiperplasi ringan hingga hiperplasia berat dengan atipia. Kelompok 2 (ekstraksi
daun sirsak) mengalami penurunan rerata hiperplasia epitel sebesar 0,7 sedangkan
kelompok 3 (infusa daun sirsak) terjadi penurunan rerata hiperplasia epitel sebesar
1,03.
Pada kelompok K (kontrol negatif) yaitu tikus yang hanya diberi aquadest
tanpa perlakuan lain, didapatkan hasil
yang normal. Pada
gambaran
mikroskopisnya, secara umum tidak ditemukan adanya hiperplasia epitel. Hal ini
karena aquadest yang diberikan bukan merupakan bahan karsinogen yang dapat
mempengaruhi gambaran mikroskopis jaringan payudara.
Pada kelompok 1 (kontrol positif) yang diberi perlakuan DMBA 20 mg/kg BB
2 x seminggu, secara umum ditemukan perubahan gambaran mikroskopis jaringan
payudara dengan rerata nilai 2,2 ± 0,21. Dari 6 tikus pada kelompok 1 di tiap
lapang pandang, rata-rata memiliki grade ke 2 dan ke 3. Dalam pemeriksaan
45
ISSN 2337-3776
mikroskopis terlhat hiperplasi epitel duktus, dan terdapat athypia. Perubahan
gambaran I dikarenakan pemberian DMBA 20 mg/kgBB Aktivitas karsinogenik
dari DMBA terjadi melalui aktivitas enzim sitokrom P450 membentuk proximate
carcinogen dan ultimate carcinogen (Dandekar et al., 2006). Sitokrom P-450
dan microsomal epoxide hydrolase (mEH) memetabolisme DMBA menjadi dua
metabolit yaitu metabolit elektrofilik dan metabolit yang mampu membentuk
DNA adduct (DNA yang mampu berikatan dengan senyawa karsinogenik).
Sitokrom P-450 CYP1B1 mengoksidasi DMBA menjadi 3,4-epoxides yang
diikuti dengan hidrolisis epoxides oleh mEH membentuk metabolit proximate
carcinogenic dan DMBA-3,4-diol. Metabolit ini nantinya dioksidasi oleh
CYP1A1 atau CYP1B1 menjadi metabolit ultimate carcinogenic (DMBA-3,4diol-1,2-epoxide) (Smith, 2000).
Pada kelompok perlakuan yang diberi ekstrak dan infusa terdapat penurunan
yang bermakna jika dibandingkan dengan kelompok yang hanya diberi DMBA
saja. Hal ini disebabkan oleh aktivitas metabolit zat aktif yang dimiliki oleh daun
sirsak. Acetogenins akan mengakibatkan penurunan produksi ATP yang akan
menyebabkan kematian sel kanker, lalu kemudian memicu terjadinya aktivasi
jalur apoptosis serta mengaktifkan p53 yang dapat menghentikan siklus sel untuk
mencegah terjadinya proliferasi tak terkendali. Flavonoid akan meningkatkan
ekspresi enzim gluthation S-transferase yang dapat mendetoksifikasi karsinogen
sehingga cepat dieliminasi oleh tubuh. Senyawa triterpenoid menstabilkan
benang-benang spindel pada fase mitosis sehingga proses mitosis terhambat.
Triterpenoid juga menginhibisi enzim topoisomerase yang akan menginduksi
apoptosis dan menghentikan siklus sel (Retnani, 2011).
Rerata dari Kelompok 2 (Ekstraksi) mengalami penurunan rerata tingkatan
hiperplasia epitel yang lebih baik jika dibandingkan dengan kelompok 3 (Infusa).
Hal ini dikarenakan metode ekstraksi dengan cara maserasi dapat menyerap zat
aktif lebih baik dibandingkan dengan metode infusa. Pada metode infusa, zat-zat
aktif yang tertarik dapat mengendap kembali ketika larutan disimpan. Kemudian,
ada zat-zat aktif yang terkandung yang tidak tahan panas lama, seperti senyawa
flavonoid, sehingga menyebabkan terjadinya kerusakan zat aktif. Flavoid
46
ISSN 2337-3776
merupakan golongan senyawa yang tidak tahan panas, dan mudah teroksidasi
pada suhu tinggi, sehingga kandungan zat-zat/ metabolit aktif pada ekstrak dengan
metode maserasi akan lebih baik dibanding dengan zat-zat pada metode infusa
(Rahayu, 2009).
Simpulan
Gambaran mikroskopis jaringan payudara yang diinduksi ekstrak daun
sirsak lebih baik dibandingkan yang diinduksi oleh infusa daun sirsak.
Daftar Pustaka
Dandekar S, Sukumar S, Zarbl H, Young L, Cardiff, R. 2006. Spesific activation of the cellular
Harvey-ras oncogene in dimethylbenzathracene-induced mouse mammar tumors. Moll
Cell Biol. 3 (6) : 4104-4108.
Fitricia I, Winarni D, Pidada R. 2012. Pengaruh pemberian tomat (Solanum lycopensicum l.)
Terhadap
histologi
kelenjar
mammae
mencit
yang
diinduksi
7,12dimetilbenz(a)antrasena (DMBA). Jurnal Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Airlangga. 2 (15) : 9.
Hanahan D dan Weinberg RA. 2000. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (2) : 57-70.
Hatim N. 2012. Aktivitas antikanker ekstrak etanol daun surian (Toona sinensis) pada tikus betina
sprague dawley yang diinduksi 7,12- dimetilbenz(a)antrasena (DMBA). Departemen
Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor:
Bogor.
Hermawan GP dan Laksono H. 2013. Ekstraksi daun sirsak (Annona muricata l.) Menggunakan
pelarut etano. Jurnal Teknologi Kimia dan Industri Universitas Diponegoro. 2 (2) : 111115.
Laurence J dan Bacharach M. 1964. Analytical Toxicology. Philadelphia: CRC Press. pp. 125-127
Rahayu L. 2009. Isolasi dan identifikasi senyawa flavonoid dari biji kacang tunggak (Vigna
unguiculata L.). Skripsi. Universitas Brawijaya: Malang.
Retnani V. 2011. Pengaruh suplementasi ekstrak daun Annona muricata terhadap kejadian
displasia epitel kelenjar payudara tikus sprague dawley yang diinduksi 7,12dimetilbenz(a)antrasena (DMBA). Skripsi. Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro:
Semarang
Smith, AD. 2000. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. Revised Ed.
London : Oxford University Pr. pp. 345.
Siswandono SB. 2000. Kimia Medisinal, Ed ke-2. Airlangga University. hlm. 56-57.
Syariefa E. 2011. Daun Sirsak: Olah Tepat dan Dosis Aman. Trubus. 2(498) : 10-27.
Ting AY., Kimler BF., Fabian CJ., dan Petroff BK. 2007. Characterization of A Preclinical Model
of Simultaneous Breast and Ovarian Cancer Progression. Carcinogenesis Journal. 1(28):
130–135.
47