Kultur Artikel 3. Overall, 300 clinical specimens from dogs with pyoderma or abscesses (n=58), otitis (n=59), and suspected bladder infection (n=183) were ana lyzed from May 2019 to July 2020. The specimens were non-duplicate and they were presumed to be epidemiologically non-related since they came from different animals, different families, presented dif ferent sampling dates, and originated from different locations. Samples were cultivated aerobically on 5% sheep blood agar and MacConkey agar at 36°C for 24-48 h. A sample was considered positive if the bac terial growth was significant, both as pure culture or mixed microbial flora with dominance of one bacte rial species. Subcultures of the positive samples were obtained using tryptone soya agar, then bacteria were Gram-stained and tested for catalase and oxidase. Confirmation of P. aeruginosa isolates was performed using a commercial biochemical identification system (API® 20 NE, BioMerieux, France). Artikel 6. lonies were Gram stained and inspected according to their macroscopic and microscopic morphology. Alongside, biochemical tests such as catalase, oxidase, lactose fermentation, coagulase, indole, methyl red, Voges-Proskauer, citrate, urease, oxidation/fermentation tests were performed to identify genus and species. Cystine-Lactose-Electrolyte Deficient (CLED) Agar (Oxoid CM0301) was also used as a differential agar for the identification of pyocyanin formation of P. aeruginosa. Isolates were identified at the genus and species level using staining, biochemical tests and differential. Isolat diwarnai dengan pewarnaan Gram dan diperiksa berdasarkan morfologi makroskopik dan mikroskopiknya. Selain itu, uji biokimia seperti katalase, oksidasi, fermentasi laktosa, koagulase, indol, metil merah, Voges-Proskauer, sitrat, urease, uji oksidasi/fermentasi dilakukan untuk mengidentifikasi genus dan spesies. Agar Cystine-Lactose-Electrolyte Defi cient (CLED) (Oxoid CM0301) juga digunakan sebagai agar diferensial untuk identifikasi pembentukan piosianin P. aeruginosa. Isolat diidentifikasi pada tingkat genus dan spesies menggunakan pewarnaan, uji biokimia, dan diferensial. Artikel 7. Deteksi molekuler dilakukan untuk (12) isolat P. aeruginosa dengan teknik reaksi berantai polimerase. Identifikasi Vitek2, hasil uji biokimia menggunakan Vitek2 compact, P. aeruginosa didiagnosis sebagai berikut:12 isolat dari anjing. Koloni tampak melingkar, berlendir, halus dengan bau anggur manis pada agar nutrisi (Gambar 2), memberikan beta hemolisis pada agar darah (Gambar 4) tetapi tidak memfermentasi gula laktosa pada MacConkey (Gambar 1), dan tampak berwarna hijau kekuningan pada agar cetrimide (Gambar 3), koloni yang dicurigai dikultur ulang untuk melakukan lebih banyak pengujian, isolat P. aeruginosa bergantung pada uji biokimia yang berbeda. Artikel 8. Satu sendok urin diinokulasikan ke dalam agar darah domba 5% dan agar MacConkey (HiMedia, India), dan cawan petri diinkubasi secara aerobik pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah inkubasi, satu sendok koloni terisolasi dipilih dan dikultur ulang pada media selektif, termasuk agar Cetrimide (Micromedia, AS) dan agar Pseudomonas (HiMedia, India), untuk mendapatkan pertumbuhan bakteri murni (26). Bakteri Gram-negatif yang diisolasi dengan media kultur selanjutnya didiagnosis menggunakan sistem Vitek 2 (BioMerieux, Prancis) dengan kartu Gramnegatif spesifik. Kartu tersebut berisi 64 sumur; setiap sumur mewakili uji biokimia spesifik (27). Artikel 12. Penelitian ini dilakukan selama periode 2 bulan di sebuah pusat utama untuk pasien luka bakar di Teheran, Iran. Sampel diperoleh dari luka bakar dengan cara diusap. Untuk tes fenotipik rutin yang biasanya dilakukan di laboratorium klinis, kami menginokulasi usap luka bakar terutama ke beberapa media selektif untuk isolasi P. aeruginosa, termasuk agar darah, agar MacConkey, dan agar Muller Hinton, dan menginkubasinya pada suhu 37ºC selama 24-48 jam. Isolat diidentifikasi secara presumtif dengan tes rutin, termasuk morfologi koloni dan pembentukan pigmen pada media selektif, tes oksidase positif, fermentasi glukosa, hidrolisis gelatin, dan pertumbuhan pada suhu 42ºC.10,11 Artikel 17. Untuk setiap sampel, 10–100 µl urin atau usap yang mengandung urin dioleskan ke agar Columbia dengan 5% darah domba dan cawan agar MacConkey. Cawan kultur diinokulasi secara aerobik pada suhu 37◦C, dan pertumbuhan bakteri dievaluasi setelah inkubasi 24 dan 48 jam. Koloni representatif dari masing-masing spesies bakteri dipilih dan diidentifikasi dengan spektrometri massa ionisasi desorpsi laser berbantuan matriks-waktu terbang (MALDI-TOF MS) (MicroflexR, Bruker, Jerman) mengikuti instruksi pabrikan. Untuk identifikasi bakteri, skor MALDI-TOF ≥2,0 dianggap dapat diandalkan untuk mengidentifikasi bakteri hingga tingkat spesies, dan skor antara 1,70 dan 1,99 dianggap dapat diandalkan untuk mengidentifikasi bakteri hingga tingkat genus. Untuk skor di bawah 1,70, bakteri tidak diidentifikasi.’ Artikel 19. Protokol penelitian disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Fakultas Kedokteran Hewan (FVS-ACUC nomor MUVS-2015-28). Lesi dievaluasi sebelum pengambilan sampel. Usap kornea dan konjungtiva diambil sebelum pemberian larutan oftalmik apa pun. Sampel diambil dengan usap ujung rayon steril dan disimpan dalam media transpor Amies (Delta lab, Rubí, Spanyol). Isolasi bakteri dilakukan dengan menginokulasi setiap sampel pada agar MacConkey dan agar darah domba 5% (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Inggris), dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Koloni yang diisolasi awalnya diklasifikasikan berdasarkan pewarnaan Gram, morfologi makroskopik dan mikroskopik. Panel identifikasi untuk bakteri Gram-positif terdiri dari uji katalase, uji koagulase, dan kultur pada agar garam manitol. Spesies dari setiap isolat diidentifikasi melalui analisis sekuens 16S rRNA (Macrogen, Seoul, Korea). Tes biokimia standar dan kit uji API-20E (Biomérieux, La Balme Les Grottes, Prancis) digunakan untuk bakteri Gram-negatif. Artikel 20. Sampel otitis anjing dari pasien rujukan di Rumah Sakit Hewan Kecil, Royal (Dick) School of Veterinary Studies (R(D) SVS), Universitas Edinburgh dikultur pada agar darah Columbia dengan 5% (v/v) darah kuda (E and O Laboratories Ltd.)oleh laboratorium mikrobiologi Easter Bush Pathology sebagai bagian dari layanan diagnostik rutin mereka. Isolat diidentifikasi menggunakanVitek2™ (bioMérieux) mengikuti pedoman pabrikan. Untuk penelitian ini, semua 34 isolat otitis yang diidentifikasi sebagai P. aeruginosa antara 01 Juli 2017 dan 31 Oktober 2022 diurutkan genomnya. Pengurutan seluruh genom dilakukan oleh Microbes NG (Universitas Birmingham, Inggris) seperti yang dijelaskan sebelumnya [32]. Kontig <200 bp dihilangkan secara manual, dan sekuens kontaminan dihilangkan secara otomatis selama pengunggahan ke NCBI melalui NCBI Foreign Contamination Screen [33]. Analisis CheckM (v1.2.2) juga dilakukan selama pengunggahan ke NCBI untuk menilai kualitas perakitan genom sehubungan dengan persentase kelengkapan dan kontaminasi [34]. Taksonomi dikonfirmasi selama pengunggahan ke NCBI menggunakan identitas nukleotida rata-rata (ANI) [35] dan secara independen dengan hibridisasi DNA:DNA digital melalui Type Strain Genome Server [36]. Metadata strain dan nomor akses disajikan dalam Tabel S1 (tersedia dalam versi online artikel ini). Artikel 24. Setelah dikirim ke laboratorium Bakteriologi Departemen yang disebutkan di atas, usap telinga dioleskan pada berbagai media agar padat: agar Columbia CNA dengan 5% darah domba untuk pemulihan bakteri Gram positif, agar Mac Conkey (MCA) untuk seleksi bakteri Gram negatif, agar Mannitol Salt untuk pertumbuhan selektif stafilokokus, dan agar dekstrosa Sabouraud untuk isolasi ragi. Semua cawan diinkubasi secara aerobik pada suhu 37°C selama 24–48 jam. Secara tepat, isolasi P. aeruginosa dilakukan dengan menggunakan cawan agar MCA (Lioflchelm, Teramo, Italia), media selektif dan diferensial untuk bakteri Gram negatif. Pseudomonas spp. yang dicurigai... Koloni yang berhasil dipulihkan diperiksa terlebih dahulu untuk morfologi, produksi pigmen, dan tidak adanya fermentasi laktosa pada MCA, kemudian disaring lebih lanjut dengan pewarnaan Gram dan uji oksidase. Identifikasi dinilai pada koloni segar dengan analisis spektrometri massa ionisasi desorpsi laser berbantuan matriks waktu terbang (MALDI-TOF MS) menggunakan sistem MALDI Biotyper Sirius (Bruker Daltonics Inc., Bremen, Jerman). Koloni P. aeruginosa murni disimpan dalam tabung Microbank pada suhu −80°C (Pro-Lab Diagnostics Inc., Round Rock, TX, USA) untuk penelitian lebih lanjut. Artikel 2025. 1. 2 Karakteristik kultur dan morfologi isolat P. aeruginosa diperiksa dengan mengkulturkannya pada agar MacConkey (Condalab, India), agar Cetrimide (Liofilchem, Italia), dan agar darah (TM-Media, India) yang disiapkan sesuai dengan instruksi pabrikannya. Ciri-ciri koloni seperti bentuk, ukuran, warna, bau, dan produksi pigmen dievaluasi. Untuk analisis mikroskopis, pewarnaan Gram dilakukan pada preparat apusan untuk menilai morfologi sel, reaksi Gram, dan susunan sel menggunakan mikroskop cahaya (Levinson, 2016). Artikel vingopolu. Untuk pelaksanaan penelitian ini, 75 isolat P. aeruginosa dan 26 isolat E. coli, yang diperoleh dari 96 sampel eksudat telinga yang dikumpulkan dari 78 anjing yang menderita otitis eksterna dan/atau media, dipelajari. Anjing dengan otitis eksterna dan/atau media unilateral atau bilateral (yang dirawat di dua rumah sakit hewan pendidikan universitas dan sepuluh praktik dokter hewan swasta antara tahun 2010 dan 2014) memenuhi syarat untuk penelitian ini, terlepas dari pemberian FQ topikal dan/atau sistemik sebelumnya, asalkan ditemukan basil gram-negatif pada apusan sitologi. Sampel diperoleh dari setidaknya satu dari empat lokasi yang memungkinkan: saluran pendengaran eksternal kanan pada persimpangan antara saluran vertikal dan horizontal, rongga telinga tengah kanan, saluran pendengaran eksternal kiri pada persimpangan antara saluran vertikal dan horizontal, dan rongga telinga tengah kiri. Kapas steril digunakan untuk mendapatkan eksudat telinga, secara terpisah dari setiap lokasi pengambilan sampel. Dengan demikian, jumlah sampel per anjing berkisar antara satu hingga empat, tergantung pada temuan otoskopi (otitis unilateral atau bilateral, otitis eksterna atau otitis eksterna ditambah otitis media) dan hasil sitologi. Isolat yang identik dikecualikan. Sampel tambahan yang diperoleh setelah pemeriksaan ulang anjing yang sama hanya disertakan jika isolat yang diperoleh membawa determinan resistensi yang berbeda, dibandingkan dengan isolat dalam sampel asli yang diperoleh dari lokasi pengambilan sampel yang sama. Identifikasi isolat P. aeruginosa dan E. coli dilakukan dengan tes biokimia konvensional dan dengan menggunakan sistem VITEK® 2 (kartu GN ID; bioMérieux, Marcy-l'Étoile, Prancis). Semua isolat disimpan pada suhu −85°C, menunggu analisis lebih lanjut.
