Kerusakan usus yang disebabkan latihan intensitas tinggi dilindungi oleh susu fermentasi dilengkapi dengan whey protein, probiotik dan delima (Punicagranatum L.) Abstract Disini kita mengevaluasi efek dari susu fermentasi dilengkapi dengan whey protein (sekitar 80% protein), probiotik (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB12) dan jus delima (Punica granatum L.) pada kinerja fisik, motilitas usus dan struktur vili, marker inflamasi dan mikrobiota usus dari tikus dengan latihan akut intensitas tinggi. Secara keseluruhan, dua puluh empat tikus Wistar dipisahkan menjadi beberapa kelompok: kontrol (Ctrl), suplementasi (Supp), latihan (Exe) dan latihan+suplementasi (Exe+Supp). Tikus dalam kelompok Supp menerima susu fermentasi selama 6 minggu dengan pemberian oral. Pada akhir periode suplementasi, kelompok Exe diberikan latihan akut intensitas tinggi di atas treadmill. Kami menemukan bahwa latihan akut yang intens menyebabkan perubahan dalam ruang vili usus, perubahan proporsi spesies Lactobacillus dan peningkatan spesies Clostridium, serta penurunan motilitas usus. Suplementasi meningkatkan motilitas usus, dan mempertahankan ruang vili usus dan proporsi mikrobiota alami dari tikus yang dilatih. Kinerja fisik tidak meningkat dengan suplementasi susu fermentasi. Kami menyimpulkan bahwa susu fermentasi yang mengandung protein whey, B. animalis (BB12) dan jus delima dapat membangun kembali mikrobiota usus dan melindungi hewan dari efek yang tidak diinginkan dari latihan akut yang intens. Kata kunci: Latihan: Probiotik: Fenolik: Mikrobiota Protein whey menyediakan asam amino yang digunakan terutama selama sintesis glutamin di otot: rantai cabang asam amino (26%) dan glutamat (6%). Oleh karena itu, asam amino ini dapat digunakan untuk mempertahankan stok glutamin otot, yang secara luas dibutuhkan oleh sel-sel sistem imun sebagai sumber energi dalam keadaan klinis dan selama latihan. Ada bukti bahwa glutamin memiliki peran penting dalam pemeliharaan fungsi barrier usus, yang juga diatur secara negatif oleh latihan fisik yang intens dan berkepanjangan, mengurangi kapasitas penyerapan usus. Latihan fisik mengubah sistem imun dan fungsi sel. Oleh karena itu, olahraga yang intens dapat meningkatkan kejadian infeksi pada saluran pencernaan dan saluran pernapasan bagian atas. Perubahan fisiologis terkait dengan modifikasi struktur protein yang dikenal sebagai tight junctions. Perubahan protein ini karena perubahan konstan dalam aliran darah di daerah usus. Kerja dari sel-sel epitel dan jaringan limfoid berhubungan dengan usus dan bakteri luminal yang dapat mencegah invasi patogen, sehingga memberikan fungsi barrier yang penting. Protein transmembran telah diidentifikasi pada tight junctions, di mana mereka mengatur sistem imun, permeabilitas paraseluler air dan zat terlarut. Dua dari protein ini telah diteliti secara luas pada model hewan: zonula occludens-1 (ZO-1), protein adhesi seluler yang bertanggung jawab untuk transduksi sinyal pada sambungan sel-sel, dan claudin-1, membran protein integral yang membentuk barrier paraseluler, memainkan peran penting mengatur permeabilitas sel epitel. Suplementasi probiotik pada atlet dapat membantu mengurangi frekuensi, keparahan dan durasi masalah pencernaan, serta penyakit pernapasan. Hal ini terjadi mungkin karena interaksi langsung antara kultur ini, mikrobiota usus dan sistem imun. Selanjutnya, latihan yang intens atau berat dapat menyebabkan ketidakseimbangan produksi spesies oksigen reaktif dan sistem antioksidan endogen, yang mengakibatkan stres oksidatif. Beberapa studi telah melaporkan aksi antioksidan dan antiinflamasi pada delima (Punicagranatum,L.), yang berhubungan dengan keberadaan senyawa fenolik, terutama asam galat. Oleh karena itu, disini kami bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh suplementasi dengan susu fermentasi yang mengandung whey protein, probiotik dan jus delima pada kinerja fisik, mikrobiota usus dan motilitas, struktur vili usus dan marker inflamasi pada tikus yang diberikan latihan akut intensitas tinggi. Metode Produksi susu fermentasi Susu fermentasi terdiri dari susu bubuk skim (Molico®), protein whey pekat (Alibra®, sekitar 80% de protein), maltodekstrin (SweetMix®), fruktosa (Low- ucar®), jus delima (var Luar biasa, diperoleh dengan pengolahan buah dengan industri pulper buah, model DPT-75; Tomasi®), kalium sorbat (SweetMix®), kultur starter Streptococcus thermophilus (TA 072) dan probiotik Bifidobacteria animalis subsp. lactis (BB12), masing-masing disediakan oleh Danisco dan Chr-Hansen. Fermentasi dilakukan pada suhu 42°C pada BiochemicalOxygen Demand (model TE-371; Tecnal®) hingga pH 4·6 ± 0·1. Kandungan protein Kandungan protein dari susu fermentasi ditentukan dengan metode Micro-Kjeldahl, menerapkan faktor konversi 6·38(19). Viabilitas probiotik pada susu fermentasi Viabilitas B. animalis subsp. lactis (BB12) dievaluasi dalam susu fermentasi pada 0, 14 dan 28 hari setelah produksi, menggunakan media TOS-MUP dan inkubasi di bawah anaerobiosis (Anaero-Gen; Oxoid®) pada 37°C selama 72 jam. Kandungan fenolik dan aktivitas antioksidan jus delima dan serum darah Penentuan total kandungan fenolik dari jus delima dilakukan dengan menggunakan metode FolinCiocalteau, seperti yang dijelaskan oleh Musci & Yao(20). Metode ferric-reducing antioxidant power (FRAP) digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan. Secara singkat, sampel dari jus delima extractwere ditempatkan di piring sembilan puluh enambaik: 20 μl sampel, standar atau air (kosong); 30 μlair suling; dan 200 μldari FRAP reagen, menurut metode yang dijelaskan oleh Benzie & Regangan(21).Selanjutnya, pelat diaduk dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 8 menit, dan absorbansi dibaca pada 595 nm menggunakan aspekrofotometer (Pembaca pelat mikro BioTek, EPOCH/2 dengan versi perangkat lunak Gen5.3.03). Aktivitas antioksidan serum darah tikus juga dievaluasi menggunakan metode FRAP. Darah hewan dikumpulkan dan disentrifugasi pada 2000 g selama 10 menit (model sentrifus K241R; Centurion Scientific®), dan supernatannya diambil untuk dianalisis. Deklarasi etika Pekerjaan ini telah disetujui oleh Komite Etika Penggunaan Hewan (CEUA) dari Universitas Campinas (protokol 4150-1) dan dilakukan di bawah standar etika untuk eksperimen hewan dari Sekolah Tinggi Eksperimen Hewan Brasil (COBEA). Kelompok eksperimen Secara keseluruhan, dua puluh empat tikus Wistar jantan berumur 10 minggu dengan berat sekitar 350 g (pada awal percobaan) dipelihara di Central Biotery dari School of Applied Sciences (FCA-UNICAMP). Tikus dipelihara dalam kandang polietena, empat ekor hewan per unit, pada suhu terkontrol 25°C dan 12 jamterang–siklus12 jam gelap, menerima air minum dan pakan standar komersial (Nuvilab®), ad libitum. Tikus didistribusikan di antara empat kelompok: (i) kelompok kontrol (Ctrl), tanpa suplementasi dan tanpa olahraga; (ii) kelompok tambahan (Supp), dengan suplementasi dan tanpa latihan; (iii) satu-satunya kelompok yang berolahraga (Exe), tanpa suplemen tetapi dilakukan di atas treadmill; dan (iv) kelompok suplemen plus olahraga (Exe + Supp), ditambah susu fermentasi dan berolahraga di atas treadmill. Selama periode percobaan, bobot hewan diukur setiap minggu menggunakan skala semi-analitis yang stabil (model UX620H; Marte Científica®). Suatu periode 12 jam setelah sesi latihan akut, tikus dibius dengan injeksi intraperitoneal yang mengandung campuran ketamin hidroklorida dan diazepam (70:30; 50 mg/kg) dan kemudian di-eutanasia. Colon dan tinja sampel segera dibekukan dan disimpan di -80 ° C. Sampel usus distal dibekukan di pentana iso- didinginkan dalam cairan N2 untuk histologis lanjut, immuno- fluorescence dan analisis PCR. Pengambilan sampel darah dilakukan untuk mendapatkan serum. Suplementasi dengan susu fermentasi Komposisi susu fermentasi dihitung berdasarkan jumlah protein whey yang sesuai (20 g/hari protein), seperti yang diusulkan oleh Witard et al.(22). Setiap hewan menerima 2 ml susu fermentasi, 5 hari/minggu, yang mengandung 8·9 (SD 0·3) log unit pembentuk koloni (CFU) B. animalis BB12, protein whey (dihitung berdasarkan berat rata-rata hewan, diukur mingguan ) dan sari buah delima dengan konsentrasi 2·625 mmol dari total polifenol. Protokol latihan akut Tikus-tikus sebelumnya diadaptasi pada treadmill yang digerakkan oleh hewan pengerat dengan stimulasi kejut listrik (AVS Projetos®) selama 1 minggu (selama 10 menit/hari pada 3 m/menit). Kemudian, tikus dilakukan tes beban tambahan (ILT) dengan intensitas awal 6 m / menit pada 0% dengan meningkatnya penambahan sebesar 3 m min setiap 3 menit sampai kelelahan (yaitu kecepatan maksimum), yang /didefinisikansebagai waktubahwa tikus menyentuh ujung treadmill limakali dalam 1 menit(23).ILT dilakukan tiga kali dengan interval 48 jam di antaranya. Darihewan kinerja fisikdalam tes ini, kita dipilih secara acak dua belas tikus untuk menyusun kelompok Exe. Setelah seleksi ini, tikus diserahkan ke pengobatan 6 minggu, yang meliputi suplementasi dengan susu fermentasi atau air minum (kontrol), diberikan secara oral. Pada minggu ke-5 perlakuan, kelompok Exe kembali dilakukan adaptasi di treadmill selama 1 minggu. Kemudian, tikus melakukan ILT dua kali, dengan 48 jam istirahat di antara pengujian. ILT dilakukan untuk menetapkan data kinerja, seperti kecepatan maksimum, waktu dan jarak. Karena tidak ada perbedaan yang ditemukan antara pengujian, kami mengadopsi nilai rata-rata. Setelah periode ini, tikus dari kelompok Exe diserahkan ke sesi latihan aerobik akut dengan intensitas terus menerus sesuai dengan 85% dari kecepatan maksimum yang diperoleh di ILT. Suatu periode 12 jam setelah latihan akut, hewan-hewan itu di-eutanasia. Kelompok yang tidak berolahraga ditempatkan di atas treadmill (dimatikan) selama 15 menit untuk meniru tekanan yang disebabkan oleh suasana kandang yang berbeda. Hewan-hewan ini juga di-eutanasia setelah 12 jam. Pengalaman kami sebelumnya (data dirahasiakan) adalah bahwa setelah 12 jam dari sesi latihan lengkap ada peningkatanperadanganproses dan perubahan mendatang usus struc- pada tikus. Untuk alasan ini, kami memilih untuk melakukan eutanasia setelah 12 jam dari sesi latihan yang melelahkan. Ekstraksi RNA dan real-time PCR (PCR kuantitatif) Extracted RNA (1 μg) digunakan untuk transkripsi terbalik contain- ing OligodT (500 μg / ml), 10 nM dNTP Mix, 5× Strand Pertama Buffer, 0·1 M dithiothreitoland 200 U RT (MMLV Reverse Transcriptase; Promega®). Transkripsi terbalik dilakukan pada 70 ° C selama 10 menit. Siklus dilanjutkan pada 42 ° C selama 60 menit setelah penambahan enzim. Enzim dinonaktifkan pada 95 ° C selama 10 menit. Tingkat ekspresi gen dinilai dengan fluorescencequantifikasi dengan QuantStudio Real-Time System (Thermo Fisher Ilmiahfic®).Reaksi terdiri dari DNA komplementer yang diencerkan dalam campuran yang mengandung Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems®), air Milli-Q dan masing-masing inisiator sense dan antisense. The cyclingconditions adalah 60 ° C selama 1 menit, 50 ° C selama 2 menit dan 95 ° C selama 10 menit, dan amplifikasi terjadi di empat puluh siklus denaturasi pada 95 ° C selama 15 detik dengan langkah anil / ekstensi pada 60 ° C selama 60 detik. Analisis dilakukan dengan menggunakan 2 ΔΔCt, metode di mana ΔΔCt = (Ct sample - Ct controlfrom internal sampel yang sama) - (Ct control - Ct pengendalian internal dari sampel pengendalian yang sama). Formula ini didasarkan pada anggapan bahwa tingkat Ctperubahan v. Tingkat perubahan copy sasaran identik untuk gen dari bunga dan β-actin pengendalian internal. Semua pasangan primer disintesis oleh Sigma Life Science, sebagai berikut: ACTB, 5'GTCTCACCACTGGCATTGTG-3' dan 5'-TCTCAGCTGTGGTGGT-3'; CLDN1, 5'CTGGGAGGTGCCCTACT TT-3' dan 5'-CCGCTGTCACACGTAGTCTT-3'; ZO-1, 5'GAGGGCTTCAGAACGAGGCTATTT-3' dan 5'-CATGTCGGAGAGTAGA GGTTCGA-3'; IL1B, 5'CACCTCTCAAGCAGAGCACAG-3' dan 5'-GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC-3'; IL6, 5'TCCTACCCCAAC TTCCAATGCTC-3' dan 5'-TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3'; dan TNF, 5'AAATGGGCTCCCTCTCATCAGTTC-3' dan 5'-TCT GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3'. Histologi Struktur usus hewan dianalisis dengan histologi. Usus distal membeku di isopentana, didinginkan dalam cairan N2 dan disimpan pada -80 ° C, dipotong andthen menjadi bagian dari 10 μm (tebal) dengan menggunakan cryostat (model CM1860; Leica®).Untuk mengungkap morfologi umum, nonfixed pemotongan histologis yang dicelup dalam larutan hematoksilin dan eosin (1% w / h untuk masing-masing). Gambar diperoleh di bawah mikroskop (Leica®) menggunakan perangkat lunak LAS X. Dari gambar yang diperoleh, kami menilai jarak antara vili usus menggunakan perangkat lunak ImageJ. Semua empat gambar dianalisis untuk setiap tikus, dengan tiga per kelompok eksperimen. Imunofluoresensi Transversal bagian dari usus distal untuk immunostaining yang fixed dalam aseton didinginkan(-20 ° C) dengan 0·2 M penyangga fosfat selama 10 menit, dicuci dengan saline PBS tiga kali selama 3 menit masingmasing dan kemudian diblokir dengan 0·1 glisin /0·2% TritonX-100 dalam buffer PBS selama 1 jam. Posterior, slide wereincubated dalam larutan yang mengandung antibodi primer, 3% yang normal serum kambing dan 0·3% Triton X-100/0·1 M (tiga kali selama 10 menit masing-masing), dirakit dengan Vectashield pemasangan media untuk immuno- fluorescence dengan 40,6-diamididino-2-phenylindole (katalog no. H-1200; Vector Labs®) dan kaca penutup. Antibodi utama yang digunakan untuk imunolokalisasi adalah claudin-1 (kode: 374900; Life Technologies do Brasil®) dan ZO-1/TJP1 (kode: 402200; Life Technologies do Brasil®). Antibodi sekunder adalah anti-tikus Cy3 keledai (1:500; no katalog 715–165–150; Jackson Lab®) dan anti-kelinci Cy3 keledai (1:500; no katalog 711–165–152; Jackson Laboratorium®). Gambar diperoleh dengan menggunakan mikroskop dan perangkat lunak LAS X. Aktivitas myeloperoxidase Migrasi neutrofil ke usus tikus dievaluasi melalui uji kinect-colourimetric myeloperoxidase (MPO). Sekitar 0·3 g usus distal ditimbang dan sampel dihomogenisasi dalam buffer (0·1 M NaCl, 0·02 M NaPO4, 1·015 M Na EDTA, pH 4·7) dan disentrifugasi pada 1509 g selama 15 menit . Sedimen dimasukkan ke lisis hipotonik (1·5 ml larutan NaCl pada 0·2%, diikuti dengan penambahan volume yang sama dari larutan NaCl pada 1·6 % dan glukosa 5%). Setelah sentrifugasi, sedimen disuspensikan kembali dalam 0·05 MNaPO 4 buffer(pH 5·4) yang mengandung 0·5 %hexadecyltrimethylammonium bromide. Setelah langkah ini, sedimen langsung dibekukan dalam cairan N2 sebanyak tiga kali, disentrifugasi pada g 11.963selama 15 menit dan kemudian dihomogenkan kembali. Aktivitas MPO dalam sedimen tersuspensi dianalisis dengan mengukur perubahan kerapatan optik pada 450 nm, menggunakan tetrametilbenzidin (1·6 nM) dan H2O2 (0·5 mM). Hasil dihitung dengan membandingkan kerapatan optik supernatan dengan kurva standar bilangan neutrofil (>95% kemurnian). Analisis mikrobiota menggunakan sekuensing generasi berikutnyaNextAnalisis mikrobioma usus dilakukan olehGeneration Sequencing (NGS), oleh Neoprospecta®. Pertama, persiapan perpustakaan sekuensing dilakukan dalam protokol PCR dua langkah menggunakan 1 ng DNA. Dalam pertamareaksi PCR, V3 yang-V4 primer, 314F (CCTACGGGRSGCAGCAG) dan 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT), digunakan pada konsentrasi 0·2 μM(24,25).Sepasang primer ini memiliki cakupan taksonomi yang besar pada bakteri dan archaea, mengenali daerah yang sangat bervariasi V3 dan V4 dari rRNA 16S bakteri(26).ini Fipertama PCR primer berisi urutan Illumina berdasarkan TruSeq struktur adapter (Illumina®),yang memungkinkan PCR kedua dengan urutan mengindeks. Reaksi PCR selalu dilakukan dalam rangkap tiga menggunakan Platinum Taq(Invitrogen®). The fireaksi nal PCR dibersihkan menggunakan AMPureXP manik-manik (Beckman Coulter®)dan sampel dikumpulkan di sequencinglibraries untuk kuantitatif PCRkuantifikasimenggunakan dia KAPA Perpustakaan Quantifikasi Kit untuk Illumina platform (KAPA Biosystems®).Pustaka diurutkan menggunakan sistem MiSeq, menggunakan primer Illumina standar yang disediakan dalam kit. Setelah pengurutan, pipa bioinformatika melakukan demultipleks urutan, adaptor, dan pemangkasan primer. Untuk meningkatkan keandalan pembacaan, tidak termasuk kemungkinan keragaman yang dihasilkan oleh chimericamplicon atau nukleotida yang salah yang tergabung dalam PCR, 100% pembacaan identik dikelompokkan. Jika kluster setiap diwakili oleh kurang dari limaberbunyi, Itwas tidak dipertimbangkan dalam analisis lebih lanjut. Urutankemudian menjadi sasaran klasifikasi taksonomi yangclustermembandingkannya dengan 16S rRNAdatabase (NeoRefdb; Neoprospecta Microbiome Technologies®). Urutan dengan setidaknya 99% identitas dalam database referensitaksonomi ditetapkan secara. Analisis statistik Ukuran sampel dihitung menggunakan perangkat lunak penghitung ukuran sampel gratis G*Power versi 3.1.9.2 (Franz, Universitat Kiel). Sampel dihitung dengan mempertimbangkan hasil yang diamati oleh Chen et al.(27) dan variabel waktu berenang (ST) pada tiga kelompok mencit terlatih: kendaraan (ST = 4·8); LP10-1× (ST = 9·0); dan LP10-5× (ST = 23·3). Mengingat nilai-nilai ini, kita memiliki efek ukuran 7·91. Dengan kekuatan 95%, 0·05 tingkat statistiksignifikansidan pengaruh ukuran 7·91, ukuran sampel untuk setiap kelompok dihitung menjadi 2. Mempertimbangkan bahwa efek dari studi dasar itu besar, kami memutuskan untuk menjadi konservatif dan meningkatkan jumlah sampel menjadi total dua puluh empat tikus yang secara acak dimasukkan ke dalam salah satu dari empat kelompok eksperimen. Nilai untuk awalberat badan v. final berat badan dan berat badan kurvaDinyatakan sebagai sarana dan deviasi standar dan dinilai oleh dua arah ANOVA dan Bonferroni's post hoc tes, menggunakan langkah-langkah diulang. Selama dua perbandingan kelompok independen, kami menggunakan Student's t. uji Untuk microbiotaassessment, kami menguraikan rasio antara rangkakuantifikasi(n Lactobacillale /n Clos- tridiales) dan antara genus(nLactobacillus/nClostridium).suatu rasio antara kelompok dan nilai-nilai untuk claudin-1, ZO-1, IL1B, IL-6 dan TNFa dibandingkan dengan ANOVA satu arah dengan ujiGames–Howell post hoc . Tes dipilih karena rasio kelompok memiliki varians yang tidak sama (n dikurangi oleh kelompok). Dalam hal ini, Games-Howell tes avoidserror distorsi familywise tipe I dan α-jenis I(28).Analisis statistik ini dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 5 dan SPSS 15.0.1. Signifikansiyangdipertimbangkan untuk semua pengujian adalah P < 0·05. Hasil Susu fermentasi Sebelum persiapan susu fermentasi, kami mengevaluasi kandungan fenolik jus delima yang diekstraksi langsung dari buahnya. Selain itu, kami menganalisis kandungan protein dari konsentrat protein whey. Jus yang diperoleh dari buah delima mengandung 4·64 mmol polifenol, dan dari nilai ini kami menghitung persentase penambahannya ke dalam susu fermentasi, yang bertujuan untuk mencapai 2·625 mmol polifenol dalam minuman yang digunakan untuk suplemen. Kandungan protein dari protein whey adalah 77·3 (SD 0·14) %, dan kami menghitung persentase penambahannya untuk mencapai dosis setara 20 g/hari untuk minuman, dikoreksi dengan bobot rata-rata hewan setiap minggu. Juga, kami mengevaluasi viabilitas probiotik pada susu fermentasi, dan kami mengamati jumlah di atas 8·5 log CFU/ml selama masa simpan produk. The International Ilmiahfic Asosiasi Probiotik dan Prebioticselaborated Dokumen Ahli Konsensus di mana tidak ada hitungan minimal sel probiotik yang layak untuk menyertakan klaim dari makanan probiotik(29).Instead, rekomendasinya adalah untuk membuktikan kelangsungan hidup pada tingkat yang tepat digunakan dalam mendukung studi manusia, menurut Bertazzoni et al.(30) dan menurut undang-undang untuk probiotik di Brasil(31). Namun, beberapa negara menyarankan 9 log CFU per porsi, seperti Italia dan Kanada(29). Penyajian susu fermentasi yang diusulkan untuk konsumsi manusia adalah 140 ml, yang sesuai dengan 10·6 log CFU sel probiotik. Membandingkan jumlah sel probiotik yang diberikan kepada manusia dengan berat 70 kg, ini setara dengan jumlah probiotik yang diberikan kepada tikus (sekitar 500 g) dalam penelitian ini. Suplementasi dengan susu fermentasi tidak mengakibatkan efek samping pada tikus. hewan Kinerja fisik Gambar. 1 (a) menunjukkan hasil tes progresif sampai kelelahan sebelum pengobatan, menunjukkan bahwa Exe dan Exe + Supp kelompok disajikan pertunjukan serupa. Gambar. 1 (b) menunjukkan hasil tes yang sama setelah pengobatan, menunjukkan tidak adasignifikanyangperbedaan antara kelompok. Gambar 1(c) menyajikan hasil latihan akut pada 85 % kapasitas maksimum yang diperoleh dalam tes progresif (Gbr. 1(b)) di mana tidak ada peningkatan kinerja yang diamati setelah perawatan dengan susu fermentasi dibandingkan dengan Exe-only kelompok. Evaluasi tubuh dan isi usus Suplementasi dengan susu fermentasi tidak menyebabkan penambahan berat badan dibandingkan dengan tikus kontrol (Gbr. 2 (a) dan (b)). Kami menyoroti bahwa hanya hewan yang diberi suplemen yang menunjukkan kandungan usus feses yang lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok lain, tanpa perbedaan statistik (Gbr. 2(c)). Histologi dan jarak vili usus Gambar 3(A) menunjukkan histologi kolon distal, menunjukkan bahwa kelompok Supp menunjukkan vili usus yang serupa dibandingkan dengan kelompok Ctrl, sedangkan kelompok Exe menunjukkan ruang antar vili yang lebih besar. Grup Supp + Exe mendemonstrasikan pelestarian interspace asli. Mengevaluasi jarak antara vili usus menggunakan ImageJ (Gambar. 3 (B)), kami menemukan bahwa kelompok Exe disajikan secarasignifikanlebih banyak ruang dibandingkan dengan Ctrl dan Suppgroup, menunjukkan bahwa latihan intensitas tinggi akut dapat menyebabkan perubahan struktural dalam mukosa ini (ANOVA satu arah: P = 0·001, a = P = 0·025 v.Ctrl, b = P = 0·098 v. Supp). Di sisi lain, minuman mempertahankan jarak asli antara vili, menunjukkan efek pelindung suplementasi pada situasi latihan akut intensitas tinggi (c = P < 0·030 v. Exe). Imunofluoresensi dan ekspresi fungsi penghalang protein claudin-1 pelabelan protein ditunjukkan pada Gambar. 4 (A), di mana dimungkinkan untuk catatan bahwa kelompok Supp menunjukkan akumulasi claudin-1 dispesifikdaerah (panah, Gambar. 4 ( A)) dan grup Exe + Supp menunjukkan pelabelan yang mirip dengan grup Ctrl, sedangkan grup Exe menunjukkan pengurangan pelabelan yang kuat. Onanalysing claudin- 1 mRNA ekspresi (. Gambar 4 (B)), kami menemukan bahwa suplementasi dengan susu fermentasi secarasignifikanmeningkat claudin-1 ekspresi (ANOVA satu arah: P <0·001, a= P = 0·004 v. Ctrl). Latihan akut yang intens tidak mengubah ekspresi protein dibandingkan dengan kelompok Ctrl. Namun, kelompok Exe+ Supp menunjukkan peningkatan ekspresi claudin-1 (a = P = 0·004 v. Ctrl, b= P = 0·004 v. Supp, a= P = 0·005 v. Ctrl, b= P =0·042 v.Supp dan c= P = 0·004 v.Exe), menunjukkan dimemengaruhisuplementasi pada ekspresi protein ini . ZO-1 pola pelabelan ditemukan besimilar untuk claudin-1, di mana kelompok Supp disajikan peningkatan ekspresi dan akumulasi dispesifikepitel daerah (panah, Gambar. 4 (C)). Level mRNA ZO-1 menunjukkan modulasi yang mirip dengan claudin-1 (ANOVA satu arah: P = 0·008, a= P = 0·017 v. Ctrl dan c = P = 0·050 v. Exe), seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4 (D). Pro-inflamasi sitokin ekspresi sitokin IL-1β ekspresi (Gambar 5 (A).) Lebih rendah pada kelompok dengan latihan dan suplementasi susu fermentasi (Supp + Exe) (ANOVA satu arah: P <0·05, a = P < 0·018 v. Ctrl). Dalam analisis ekspresi IL6 (Gbr. 5 (B)), diamati bahwa tingkat sitokin dalam kelompok dengan suplementasi (Supp) lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol (Ctrl). Kelompok tikus yang diberi latihan (Exe) dan kelompok yang diberi suplemen dan diserahkan ke protokol latihan (Supp + Exe) menunjukkan peningkatan IL-6 dibandingkan dengan kelompok kontrol. Mengenai analisisTNFα, ekspresi therewas tidak ada perubahan dalam kelompok belajar. Analisis antioksidan pada darah (serum) dan aktivitas myeloperoxidase Gambar 6(a) menunjukkan analisis antioksidan pada serum darah menggunakan metode FRAP. Tidak ada perbedaan yang signifikan yang ditemukan antara kelompok. Mengenai aktivitas MPO di kolon distal (Gbr. 6(b)), analisis yang membantu untuk menentukan inflamasi lokal, kami mengamati bahwa suplementasi tampaknya menurunkan infiltrasi neutrofil, tetapi tidak ada perbedaan statistik yang diamati antara kelompok. Mikrobiota analisis perintah, genus dan spesies Dalam Gambar 7-11, kami hadir NGS hasilWistar tikus'. mikrobiota Kami mengamati bahwa urutan Lactobacillale mewakili salah satu komponen utama darihewan ini', mikrobiota holistik nilai rata-rata 78% dari total populasi pada hewan kontrol (Gambar. 7). Pada membandingkan hewan Ctrl dan Supp (tidak dilaksanakan) pertama,kami mengamati bahwa suplementasi dengan susu fermentasi proporsi termodulasi pesanan ditemukan di mikrobiota, meningkatkan theorder Bifidobacteriales tanpa mengurangi proporsiLactobacillale. Namun, urutan Clostridiales berkurang dari 21% menjadi sekitar 16%. B. animalis melakukantikus awalnya tidak compose', mikrobiota dengan B. pseudolongum menjadi satu-satunya asli milik memesan Bifidobacteriales, tetapi dalam proporsi yang lebih kecil (data tidak ditampilkan). Suplementasi dengan susu fermentasi memperkenalkan B. animalis spesiesdalam kelompok Exe+ Supp dan Supp (data tidak ditampilkan). Latihan akut intens menyebabkan perubahan yang cukup besar dalam persentase kelimpahan relatif pesanan mikroba padahewan'. mikrobiota Menetapkan rasio Lactobacillale/Clostridiales, kami mengamati bahwa hewan dari Ctrl dan Suppgroups menyajikan nilai antara 4·02 dan 4·70 dari dua ordo ini; yaitu, proporsi adalah empat kali lebih tinggi untuk Lactobacillale groupcompared dengan kelompok Ctrl dan hampir limakali lebih unggul dari Grup Suplementasi. Kondisi ini diubah dengan latihan yang intens, yang menunjukkan supremasi Clostridiales (Gbr. 8). Suplementasi hewan yang dilatih dengan susu fermentasi cenderung meningkatkan proporsi ini, meningkatkan Lactobacillale. Namun demikian, tidak ada perbedaan statistik antara kelompok untuk dua ordo mikroba yang dikutip. Secara bersama-sama, hasil kami diperoleh untuk genus yang sama dengan yang diperoleh untuk pesananklasifikasi,dengan pengurangan Lactobacillusproporsidan peningkatan Clostridium karena latihan (Gambar. 9). Ketika Lactobacillus:Clostridium rasiodiamati, kecenderungan yang sama adalah confirmed, dengan perbedaan statistik antara kelompok Supp dan Exe (Gambar 10.). Untuk pengetahuan terbaik kami, hasil ini sebelumnya tidak dilaporkan dalam literatur. Sebanyak dua puluh sembilan spesies mikroba yangdiidentifikasiuntuk terdiriWistar tikus'dalam mikrobiota penelitian ini. Untuk membuktikan efek penekan latihan akut intens pada Lactobacillus, genus kami statistik dibandingkan jumlah urutan tiga spesies yang ditemukan padatikus', mikrobiota aspresented pada Gambar. 11. Kami melihat secara statistik signifikanfipenurunankandari Lactobacillus acidophilus dan kecenderungan pengurangan Lactobacillusmurinus (P = 0·07). Theyang sama fiangka menunjukkan efek sebaliknya untuk papyrosolvens Clostridium dan Clostridiumruminicantum,yang disajikan asignifipeningkatan signifikan antara hewan yang stres yang diderita disebabkan oleh latihan. Diskusi Hasil kami menunjukkan bahwa suplementasi dengan susu fermentasi tidak mengubah parameter kinerja pada tikus Wistar. Model yang paling cocok untuk mempelajari performa olahraga dalam hal berlari adalah model mouse. Dalam penelitian ini, tikus Wistar digunakan karena kebutuhan akan volume lambung yang lebih besar untuk memungkinkan pemberian 2 ml minuman setiap hari untuk mencapai jumlah senyawa bioaktif yang ditentukan. Lolo dkk.(32) menunjukkan bahwa suplementasi tikus Wistar dengan keju yang mengandung probiotik dan mengirimkannya ke latihan akut yang intens mencegah penekanan kekebalan yang disebabkan oleh latihan berat tetapi tidak mengubah kinerja secara langsung. Penelitian lain dengan praktisi latihan intens dan atlet Ance endur- menunjukkan bahwa suplementasi dengan probiotik juga tidak mengubah kinerja fisik(33-37).Sebuah studi dengan manusia menunjukkan efek ergogenic suplementasi dengan probiotik, menunjukkansignifikanfipeningkatan dalam waktu race(38). Pada tikus, Lactobacillus plantarum suplementasiTWK10 meningkatkan kinerja latihan menurut Chen (27) et al. . Studi suplementasi dengan ekstrak buah delima atau jus buah delima pada manusia yang diberikan latihan aerobik intensitas tinggi menunjukkan penurunan stres oksidatif yang disebabkan oleh olahraga tetapi tidak menunjukkan peningkatan kinerja fisik(15,39). Hewan yang diberi suplemen susu fermentasi menunjukkan kandungan feses yang lebih rendah di usus besar, dibandingkan dengan kelompok lain. Mendukung hasil kami, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa sangkaan con- probiotik mengurangi waktu transit usus dengan meningkatkan volume dan berat feses, produksi gas, tion pengurangan- pH usus, peningkatan konsentrasi SCFA, metabolisme bakteri asam empedu dan produksi cholecystokinin( 40). Selain itu, otherresearch juga menunjukkan bahwa latihan fisik dapat menurunkan waktu transit usus positif atau negatif, seperti yang diamati dalam kasus latihan intens di mana penurunandarah usus flow terjadi, menyebabkan kenyamanan dis gastrointestinal(41-43).Namun, dalam penelitian kami, kelompok Exe tanpa suplemen menunjukkan hasil yang sangat mirip jika dibandingkan dengan kelompok Ctrl. Van Nieuwenhoven dkk.(43) menilai pelari dan pengendara sepeda motor profesional mengenai kebiasaan usus, juga menunjukkan keterlambatan transit usus karena olahraga yang intens. Usus adalah organ yang, di luar fungsi pencernaan dan penyerapan, bertindak sebagai penghalang pelindung terhadap agen patogen(44). Menilai vili usus melalui histologi, kami mengamati bahwa konsumsi susu fermentasi mungkin mendukung pemeliharaan struktur fisiologis usus. Sementara itu, olahraga akut yang intens dapat secara negatif mengubah integritas usus. Protein persimpangan ketat adalah sambungan antar sel yang menyediakan-adhesi selsel dalam enterosit, memainkan peran penting dalam regulasi permeabilitas penghalangparaseluler (11,12,13,44). Dengan cara ini, perubahan pada protein ini mengarah pada perkembangan patologi yang terkait dengan pecahnya struktur usus dan penyerapan nutrisi yang buruk(44–46). Claudin adalah komponen fungsional yang paling penting darirapat sambungan(44). Regulation of claudins occurs on various levels, such as regulation of transcription, post-translational modifica- tion, interaction with cytoplasmic scaffolding proteins and interactions with claudins within the same membrane (cis-interaction), as well as with claudins of neighbouring cells (trans-interaction)(13). For claudins to form functional tight- junction strands, they require additional proteins such as the cytoplasmic scaffold proteins ZO-1 and ZO-2, which bind directly to claudins and link them to the actin cytoskeletal network(47). Intestinal barrier function can bepositively modulated by probiotics, according to a review recently pub- lished(48). However, the molecular mechanisms behind the effects need to beelucidated. Karczewski et al.(49) administered L. plantarum WCFS1 (1012 cells) in a randomised human cross- over study with seven healthy subjects and made biopsies for gene expression analysis and immunohistochemistry. Admin- istration of L. plantarum significantly increased the staining of ZO-1 in the apical part of the cell near the vicinity ofthe tight junctions, but not the peak fluorescence intensity or cyto- plasmic distribution of ZO-1. The mechanism was shown to be dependent on Toll-like receptor 2 signalling. Intense physical exercise can negatively alter intestinal barrier function, as demonstrated by van Wijck et al.(9), whereas consumption of probiotics can favour and re-establish this barrier. Our work demonstrated that supplementation with fermented milk increased tight-junction protein expression. Therefore, probio- tics can alter tight-junction protein expression and improve in vitro and animal model barrierfunction(50,51). Patel et al.(52) administered antibiotics to neonate mice, demonstrating a decrease in barrier function and claudin expression. Afteradministration of Lactobacillus rhamnosus GG, they presented accelerated intestinal barrier maturation and induction of claudin expression. This showsthat probiotics administration can accelerate the expression of proteins involved in intestinal bar- rier function in immature intestine(52). Moreover, Lu et al.(44) have demonstrated that glutamine deprivation decreases claudin-1 expression. The fermented milk administered in this study contains whey protein, specially composed of glutamine, offering a series of benefits,such as strengthening the intestine and immune system and allowing health protection during physical exercise(1,53,54). Cytokines are modulated by the physiological stimulus, such as hormones, nutrients, oxidative stress and physical exercise, and these alterationsdepend on intensity, duration and type of exercise(1,55–57). Otherwise, on strenuous and intense exercise, circulating levels of pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 are increased above normal levels. A previous study showed a 100-fold increase in plasmatic concentrations of IL6and 1-fold to 2-fold increase in the concentration of IL-1β and TNF-α after long and intense exercise(58). In the present study, there was no change in IL-1β, IL-6 and TNFα with exercise. Only the rats in the exercise group and those that also received supplementation had reduction in IL-1β cytokineexpression. Cruzat et al.(59) found that supplementation of L-glutamine can attenuate muscle lesion and inflammation, as well as reduce the levels of TNF-αinduced by strenuous exercise. Moreover, our results showed no differences in antioxidant activity on animals' blood serum. However, on assessing MPO activity in the distal colon, we found that supplementation with the functional beverage promotes reduction in neutrophil infiltration, although not statistically significant. A studydemonstrated that Lglutamine availability increases neutrophil and lymphocyte activity and function(60). In addition, there is a relationship between neutrophil infiltration, muscle damage and reactive oxygen species generation in the inflammatoryprocess(61). Continuous moderate exercise reduces reactive oxygen species through endogenous antioxidant system adap-tation(1,15). Exacerbated inflammation and oxidative stress can cause a decrease in muscle function(15). The endogenous anti-oxidant system can protect the body against oxidative damage caused by physical exercise. However, they may not be suffi- cient for elite athletes or in intense exercise(1). Therefore, many strategies have been used to avoid or minimise these damages, such as nutritional interventions with antioxidants(15,18,39). In this context, pomegranate juice is rich in polyphenols such as flavonols, anthocyanins and ellagitannins(15,41), and can be used as an exogenous antioxidant. Intestine and microbiota are important organs for physical performance, as they are responsible for delivery of nutrients, water and hormones during exercise(7). Intestinal microbiota can neutralise carcinogens and drugs, protect the host from pathogens, stimulate the immune system and modulateintest- inal motility(7,62). In addition, alterations in epithelial functions and microbiota composition can exert influence on obesityassociatedinflammation(63). The consumption of Lactobacillus and Bifidobacterium can promote beneficial changes in intestinal activity, such as an increase inbarrier function(64). Evaluating animals' microbiota, we observed that the order Lactobacillales was more abundant in Wistar rats from the Ctrl group and that intense acute exercise caused a reduction in this microbial order, that was elevated in these animals and is associated with a well-balanced microbiota (Fig. 7). Animals' supplementation with fermented milk containing pomegranate juice, whey protein and B. animalis favoured microbiota dynamic balance in exercised animals, supporting maintenance of relative abundance of Lactobacillus species. We highlight that the probiotic used in our beverage does not belong to the Lactobacillus genus, but to the Bifidobacterium genus. Even so, the supplementation created a favourable microenvironment to re-establish proportions of Lactobacillus suppressed by stren- uous exercise. A systematic review from Clark & Mach(7) con- cluded that supplementation with probiotics can result in the release of beneficial metabolites, improving barrier function, immune functions and metabolicfunctions in athletes(7). B. animalis BB12 was chosen after testing other commercial strains (five Lactobacillus species and two Bifidobacterium species) in preliminary tests This strainachieved better viability results in the fermented milk product developed (data not shown). Moreover, BB12 strain has widespread use in foodindustry (65) and there are many health benefits reported in the literature(66). We carefully evaluated the effect of the supplementation on Akkermansia muciniphila proportion, as it has been con- sidered a therapeutic micro-organism with an important role in the mutualism between intestinal microbiota and host, inter- fering with barrier function and homoeostasis(67). Nevertheless, we did not observe the major proportion of this species related to the supplementation with fermented milk (data not shown), nor did we observe an increase in this genus owing to exercise, as observed by Clarke et al.(68) and Barton et al.(69). Although there are a few studies on this thematic area so far, some publications point microbiota modulation as one of the many effects of physical exercises. In the study by Mika et al.(70), young rats submitted to treadmill running presented changes in phylum proportions, with an increase in Bacter- oidetes/Firmicutes, a pattern associated with a lean phenotype by some researchers(71,72). On the genus taxonomic level, theyobserved changes in the proportion of six genera on young and adult rats submitted to running, specifically: Rikenellaceae g_, Blautia spp., Turicibacter spp., Anaerostipes spp., Methano- sphaera spp., Desulfovibrio spp.(70). Our results did not support these findings. Our research pointed to a statistically significant rise of C. papyrosolvens and C. ruminicantum due to strenuous exercise, as presented in Fig. 11. These findings support results from the study by Batacan et al.(73) on rodents, who observed some species of Clostridium being induced by HIIT exercise (high-intensity interval training), such as Clostridium geopuri- ficans and Clostridium saccharolyticum. It is important to emphasise that the Clostridium genus is associated with dysbiosis, inflammatory bowel diseases and colon cancer(63,74). Interestingly, a study showed that a toxin produced by Clos- tridium difficile could alter barrier function, modifying tight- junction proteins such asOccludin, ZO-1 and ZO-2(75). Another important finding in our study was that strenuous exercise caused a decrease in relative abundance of the Lactobacillus genus (Fig. 9), which was statistically significant for L. acidophilus when compared with control animals (Fig. 11). L. acidophilus is a recognised health promoter spe- cies, being widely used by the food and pharmaceutical industry as a probiotic. The supplementation with the fer- mented milk tended to benefit Lactobacillus proportions and reduced Clostridium proportions (Fig. 9). Sanders suggests that bifidobacteria can modulate colonbacteria activity associated with diseases in animals(76); that is, as bifidobacteria population increases, a reduction is observed for species belonging to the Clostridium genus(63,74). Literature shows outcomes in different directions regarding Lactobacillus. Choi et al.(77) studied exercised mice, which presented ahigher abundance of the order Lactobacillales compared with sedentary animals. Similar results were obtained by Queipo-Ortuno et al.(78), who showed an increase in Lactobacillus proportion owing to exercise, adopting a rat model and treadmill running. Batacan et al.(73) observed an increase of Lactobacillus johnsonii in rodents submitted to light-intensity training running protocol. We suggest that differences in protocols (mainly intensity) are a determining factor to explain the divergence between these findings and the results of our study. In general lines, intense physical exercise seems to compromise intestinal barrier function, decrease intestinal motility and decrease the relative abundance of Lactobacillus species as increase proportion of Clostridium species. L. acidophilus wasreduced, and C. papyrosolvens and C. ruminicantum increased by strenuous exercise, with statis- tically significant differences. It is important to emphasise that the Clostridiumgenus includes several human pathogens, including Clostridium botulinum (causative agent of botulism) and C. difficile, the most significant bacterialcause of diarrhoea in adults. At present, we observed that strenuous exercise caused microbiota dysbiosis with an increase in the relative proportion of Clostridium ssp., which may represent health risks. Overgrowth of potentially pathogenic microorganisms can result in tight- junction disruption(79). On the other hand, we observed that the supplementation of the rats with the probiotic fermented milk provided an increase in the structural protein expression of tightjunctions, which may result in the strengthening of the barrier function against pathogens. In this way, supplementation proved to be an attractive optionin strenuous exercise. In this study, no statistical difference was obtained in some parameters. The possible factors involved were the variability of the responses associatedwith the restricted number of animals per group. However, the number of animals used followed the requirements of the Committee on Ethics inAnimal Experi- mentation (CEUA), in accordance with international guidelines. According to the review published by Clark & Nuria (7), nowadays, aconsensus of probiotic recommendation to sup- plementation in athletes does not exist. Nevertheless, new studies might point to specific strains ordosages to modulate various adverse events caused by strenuous exercise practice, such as a break of homoeostasis, dysbiosis, endotoxaemia andso on, which might be associated with gastrointestinal discomfort, immunosuppression and even mood changes. The fermented milk developed in this study was supple- mented with probiotics, was rich in protein and polyphenols from pomegranate juice and was capable of benefiting acute exercised animals. Although this beverage was assessed through this prism, its use also can be prospected to humans inacute exercise and in other extreme situations of hypermeta- bolic states as occurs in malnutrition.
