Pewarnaan

Laporan Praktikum
Mikrobiologi
Nama
NIM
Kelas/kelompok
PJP
Asisten
: Diana Agustini Raharja
: J3L112168
: C P1/1
: M. Arif Mulya, S. Pi.
: 1. Yuriska Sekar Rani
2. Lia Suliani
3. Ramdhani
PEWARNAAN MIKROBA
PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA
PROGAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Pendahuluan
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu Gram positif dan
Gram negatif yang didasarkan pada sifat kimia dan fisik dinding sel yang dimiliki
oleh bakteri. Metode tersebut diberi nama berdasarkan penemunya yaitu seorang
ilmuwan Denmark bernama Hans Christian Gram (1853-1938) yang
mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara
Pneumococcus dan bakteri Klebsiella pneumonia. Perbedaan klasifikasi antara
kedua jenis bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding
sel bakteri. Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna kristal ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri Gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol (Karmana
2008).
Metode pewarnaan spora berfungsi untuk mempermudah pengamatan agar
peneliti atau pengamat mampu membedakan endospora dengan sel vegetatif
ataupun mengamati bentuknya. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop
meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat
refraktil. Endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya,
karena endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan,
sel vegetatif berwarna). Hal tersebut yang menjadi dasar dari metode pewarnaan
endospora dengan larutan malacite green. Metode ini merupakan metode Shaeffor
yang mana foton endospora diwarnai pertama kali dengan larutan malacite green.
Pewarnaan tersebut sifatnya kuat karena dapat berpenetrasi ke dalam endospora
bakteri. Teknik tersebut akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan
merah pada sel vegetatif (James 2002).
Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies
utama bakteri Gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh
Theodor Escherich ini dapat ditemukan dalam usus besar manusia. E. coli
merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 mm dan diamater
0.5 mm. Volume sel E. coli berkisar 0.6-0.7 mm3. Bakteri ini termasuk umumnya
hidup pada rentang 20-40 °C, optimum pada 37°C. Usus besar manusia
terkandung sejumlah E. coli yang berfungsi membusukkan sisa-sisa makanan.
Dari sekian ratus strain E. coli yang teridentifikasi, hanya sebagian kecil bersifat
patogen, misalnya strain O157:H7. Bakteri yang namanya berasal dari sang
penemu Theodor Escherich yang menemukannya di tahun 1885 ini merupakan
jenis bakteri yang menjadi salah satu tulang punggung dunia bioteknologi.
Hampir semua rekayasa genetika di dunia bioteknologi selalu melibatkan E. coli
akibat genetikanya yang sederhana dan mudah untuk direkayasa. Riset di E. coli
menjadi model untuk aplikasi ke bakteri jenis lainnya. Bakteri ini juga merupakan
media kloning yang paling sering dipakai. Teknik recombinan DNA tidak akan
ada tanpa bantuan bakteri ini (Arican dan Andic 2011).
Bacillus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, serta dapat
tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob. Sporanya tahan terhadap panas (suhu
tinggi), mampu mendegradasi xylandan karbohidrat. Bacillus mempunyai sifat
beberapa sifat di antaranya 1) mampu tumbuh pada suhu lebih dari 50 oC dan suhu
kurang dari 5 oC, 2) mampu bertahan terhadap pasteurisasi, 3) mampu tumbuh
pada konsentrasi garam tinggi (>10%), 4) mampu menghasilkan spora dan 5)
mempunyai daya proteolitik yang tinggi dibandingkan mikroba lainnya. Bacillus
adalah anggota dari divisi Firmicutes. Bacillus merupakan bakteri yang bersifat
aerob obligat atau fakultatif, dan positif terhadap uji enzim katalase. Bacillus
secara alami terdapat di mana-mana, dan termasuk spesies yang hidup bebas atau
bersifat patogen. Beberapa spesies Bacillus menghasilkan enzim ekstraseluler
seperti protease, lipase, amilase, dan selulase yang bisa membantu pencernaan
dalam tubuh hewan. Jenis Bacillus di antaranya B. cereus, B. clausii, dan B.
pumilus termasuk dalam produk probiotik komersil yang terdiri dari spora bakteri
yang telah dikarakterisasi dan berpotensi untuk kolonisasi, immunostimulasi, dan
aktivitas antimikrobanya (Duc 2004).
Tujuan
Percobaan dilakukan untuk mengidentifikasi E. coli dengan cara pewarnaan
Gram dan untuk mengidentifikasi Bacillus dengan cara pewarnaan Gram dan
pewarnaan spora.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah kawat ose, pembakar spirtus, kaca preparat,
spidol, mikroskop, dan wadah untuk menampung bilasan. Bahan-bahan yang
digunakan adalah biakan bakteri E. coli, biakan bakteri Bacillus, akuades, alkohol
70%, kristal ungu, kalium iodida, alkohol 90%, safranin, minyak imersi, dan
malacite green.
Prosedur Kerja
Suasana steril harus diciptakan dari awal praktikum hingga akhir praktikum.
Oleh karena itu, tangan dan kaca preparat yang digunakan dibasahi dengan
alkohol 70%. Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara diteteskan setetes akuades
pada pelat kaca dan biakan bakteri E. coli dalam media padat diambil dengan
kawat ose yang telah disterilkan dengan panas api dan dioleskan di atas akuades
pada kaca preparat. Sedangkan untuk biakan Bacillus dalam media cair tidak perlu
diteteskan akuades terlebih dahulu, cukup dengan dioleskan pada kaca preparat.
Setelah bakteri dioleskan pada kaca preparat, olesan tersebut ditandai dengan
spidol di balik permukaan kaca preparatnya. Fiksasi dilakukan dengan cara
dikeringudarakan dekat api spirtus. Setelah kering, kristal ungu diteteskan di atas
biakan bakteri tersebut hingga rata menutupi area bakteri. Kristal ungu dibiarkan
melekat hingga satu menit. Setelah satu menit, krital ungu yang telah diteteskan
dibilas dengan akuades dari bagian samping kaca preparat hingga mengalir dan
jangan langsung terkena biakan bakterinya. Kemudian kaca preparat
dikeringudarakan kembali, diteteskan dengan kalium iodida hingga menutupi
seluruh area biakan bakteri, dan dibiarkan selama satu menit. Setelah satu menit,
kalium iodida yang telah diteteskan dibilas dengan menggunakan alkohol 90%
dan dikeringudarakan. Safranin diteteskan pada biakan bakteri secara merata dan
didiamkan selama satu menit dan setelah satu menit dibilas dengan akuades serta
dikeringudarakan. Kaca preparat yang berisi bakteri tersebut diamati di bawah
mikroskop. Pengamatan dilakukan dengan perbesaran lebih kecil terlebih dahulu
sampai dengan perbesaran 1000 kali. Perbesaran 1000 kali harus menggunakan
minyak imersi.
Pewarnaan spora dilakukan dengan cara diteteskan setetes akuades pada
pelat kaca dan biakan bakteri Bacillus dalam media cair diambil dengan kawat ose
yang telah disterilkan dengan panas api dan dioleskan pada kaca preparat. Setelah
bakteri dioleskan pada kaca preparat, olesan tersebut ditandai dengan spidol di
balik permukaan kaca preparatnya. Fiksasi dilakukan dengan cara
dikeringudarakan dekat api spirtus. Setelah kering, malacite blue diteteskan di
atas biakan bakteri tersebut hingga rata menutupi area bakteri selama 2 sampai 3
menit di atas uap air. Setelah malacite blue diteteskan, kaca preparat dibilas
dengan akuades dari bagian samping kaca hingga mengalir dan jangan langsung
terkena biakan bakterinya. Setelah itu, kaca preparat dikeringudarakan. Safranin
diteteskan pada biakan bakteri secara merata dan didiamkan selama 30 detik dan
setelah 30 detik dibilas dengan akuades serta dikeringudarakan. Kaca preparat
yang berisi bakteri tersebut diamati di bawah mikroskop. Pengamatan dilakukan
dengan perbesaran lebih kecil terlebih dahulu sampai dengan perbesaran 1000 kali.
Perbesaran 1000 kali harus menggunakan minyak imersi.
Data dan Hasil Pengamatan
Berikut ini data dan hasil pengamatan yang dilakukan pada sampel bakteri E.
coli dan Bacillus dalam pewarnaan mikroba baik pewarnaan Gram maupun
pewarnaan spora.
Tabel 1 Data pengamatan pada sampel bakteri E. coli dan Bacillus dengan
pewarnaan mikroba
Sampel bakteri
E. coli
Bacillus
Sifat Gram
Gram negatif
Gram negatif
Bentuk sel
Coccus
Basil
Penataan sel
Streptococcus
Monococcus
Spora
Tidak memiliki spora
Memiliki endospora
Gambar 1 Hasil pewarnaan Gram pada E. coli dengan perbesaran 40x10
Gambar 2 Hasil pewarnaan Gram pada Bacillus dengan perbesaran 40x10
Gambar 3 Hasil pewarnaan spora pada Bacillus dengan perbesaran 100x10
Pembahasan
Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun
mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik.
Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat, dan meja. Hal
tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan, seperti
bakteri lain dari udara atau tangan yang dapat menempel pada kaca preparat
sehingga akan didapatkan pengukuran yang tidak akurat jika tidak steril.
Pewarnaan Gram yang dilakukan berdasarkan percobaan terbagi menjadi dua,
yaitu pewarnaan Gram positif dan pewarnaan Gram negatif. Bakteri Gram positif
memiliki beberapa ciri di antaranya 1) struktur dinding sel tebal (15-80 nm) dan
berlapis tunggal (mono), 2) komposisi dinding sel berupa kandungan lipid rendah
(1-4%), peptidoglikan ada sebagai lapisan tunggal yang merupakan komponen
utama lebih dari 50% berat kering pada beberapa sel bakteri, dan memiliki asam
tekoat, 3) lebih rentan terhadap penisilin, 4) pertumbuhan dihambat dengan nyata
oleh zat-zat warna dasar seperi kristal ungu. 5) persyaratan nutrisi relatif rumint
pada banyak spesies, serta 6) lebih resisten terhadap gangguan fisik. Sedangkan
bakteri Gram negatif memiliki ciri di antaranya 1) struktur dinding sel tipis (10-15
nm) dan berlapis tiga (multi), 2) komposisi dinding sel berupa kandungan lipid
yang tinggi (11-22%), peptidoglikan ada di dalam lapisan kaku sebelah dalam
dengan jumlahnya sedikit sekitar 10% berat kering, dan tidak ada asam tekoat, 3)
kurang rentan terhadap penisilin, 4) pertumbuhan tidak begitu dihambat oleh zatzat warna dasar seperti kristal ungu, 5) persyaratan nutrisi relatif sederhana, serta
6) kurang resisten terhadap gangguan fisik (Pelczar 1986).
Sampel biakan bakteri pada media agar perlu ditambahkan akuades terlebih
dahulu sebelum diberi pewarna pada pewarnaan Gram. Hal tersebut bertujuan
agar bakteri yang dioleskan tidak dalam keadaan menumpuk, karena akan sulit
untuk menentukan penataan selnya ketika bertumpuk. Bakteri yang dioleskan juga
tidak boleh terlalu tipis, karena sejumlah besar bakteri yang diberi berbagai
macam perlakuan dapat hilang pada kaca preparat akibat ikut terbilas dengan
akuades maupun alkohol. Bakteri yang telah dioleskan pada kaca preparat diberi
tanda pada bagian belakang kaca preparat dengan spidol agar mempermudah
dalam pemberian perlakuan sehingga semua bakteri yang telah dioleskan dapat
terwarnai semua. Selain itu, jika sampel bakteri yang dihasilkan dapat menumpuk,
terlalu sedikit, ataupun tidak ada maka sebaiknya bakteri yang dioleskan pada
kaca preparat dibuat dua. Bakteri yang telah dioleskan dikeringudarakan atau
fiksasi udara agar bakteri menempel pada kaca preparat. Agar fiksasi memakan
waktu lebih sedikit maka fiksasi dilakukan di dekat api pembakar spirtus, akan
tetapi fiksasi ini tidak boleh dilakukan terlalu dekat dengan api pembakar spirtus
karena bakteri yang menempel dapat mati akibat suhu yang panas sehingga ketika
ditambahkan kristal ungu maupun safranin dapat larut dan hilang ketika dibilas.
Setelah bakteri terebut diteteskan kristal ungu yang berfungsi memberikan warna
utama dengan warna berupa ungu selama 1 menit yang kemudian dibilas dengan
akuades. Pembilasan dengan akudes dilakukan dengan cara mengalirkannya pada
bagian bakteri tidak dioleskan dengan cara kaca preparat sedikit dimiringkan,
bukan dengan cara menyemprotkannya secara langsung pada bakteri karena dapat
menyebabkan sejumlah besar bakteri yang menempel pada kaca preparat ikut
terbilas. Setelah itu, kaca preparat dikeringudarakan dan ditambahkan kalium
iodida selama satu menit yang dapat menyatu dengan kristal ungu membentuk
kompleks di dalam sel sehingga sel tetap berwarna ungu atau dengan kata lain
untuk mengintensifkan warna utama. Setelah satu menit, kaca preparat dibilas
dengan alkohol 90%. Fungsi alkohol ini adalah untuk dekolorisasi atau dengan
kata lain untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan
pewarnaan ungu daru kompleks kristal ungu dan kalium iodida (KU-KI) pada
bakteri Gram negatif, karena mengandung lebih banyak lipid sedangkan pada
bakteri Gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu karena mengandung
lebih banyak peptidoglikannya. Bakteri Gram positif akan mengalami dehidrasi
pada dinding selnya dan pori-porinya menciut karena daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga kompleks KU-KI tidak dapat keluar dari sel dan tetap
berwarna ungu, sedangkan pada bakteri Gram negatif lipid tereksitasi (keluar) dari
dinding sel dan pori-pori mengembang sehingga kompleks KU-KI keluar dari sel
dan sel menjadi tidak berwarna atau warna ungu akan luntur karena peluruhan
dinding sel. Setelah dibilas dengan alkohol dan dikeringudarakan, larutan safrani
diteteskan pada area dioleskannya bakteri selama 1 menit. Saftranin merupakan
warna penutup, pewarna tandingan, atau counterstain yang berfungsi untuk
mewarna bakteri Gram negatif yang semula telah luntur pewarnaanya menjadi
warna merah atau merah muda. Hasil akhirnya yaitu bakteri Gram positif akan
berwarna ungu atau biru gelap dan bakteri Gram negatif akan memberikan warna
merah atau merah muda. Pengamatan Gram yang dilakukan dengan mikroskop
pembesaran 1000 kali harus menggunakan minyak imersi. Minyak imersi ini
dapat menyebabkan karat, oleh karena itu setelah mikroskop tidak digunakan lagi
maka minyak imersi yang menempel pada lensa dibersihkan.
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, perbesaran dapat
memengaruhi hasil pengamatan. Perbesaran yang lebih kecil, misalnya pada
perbesaran 400 kali, sel bakteri E. coli yang membentuk koloni tidak begitu jelas
terlihat pembentukan koloni dari sel-sel tunggalnya. Semakin besar perbesaran
yang digunakan dengan daya fokus yang tepat maka penataan dan bentuk sel
dapat dilihat dengan jelas seperti pada sel Bacillus pada pewarnaan spora yang
menggunakan pembesaran 1000 kali. Jika pada percobaan bakteri yang diamati
terlalu tebal atau menumpuk maka yang seharusnya bakteri tersebut memberikan
warna merah akan terlihat seperti memberikan warna ungu atau sebaliknya
sehingga perlu diratakan terlebih dahulu. Terjadi penyimpangan pada saat bakteri
Bacillus yang diamati dengan mikroskop. Hasil percobaan menunjukkan bakteri
Bacillus merupakan bakteri Gram negatif. Bacillus seharusnya merupakan bakteri
Gram positif yang berwarna ungu. Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa hal
seperti pewarnaan KU-KI kurang dari satu menit sehingga warna ungu belum
terserap secara sempurna sehingga warna safranin yang masuk pada sel bakteri
tersebut ataupun dapat dikarenakan reagen sudah dalam keadaan tidak segar atau
sudah lama. Jika suatu bakteri yang seharusnya Gram negatif tetapi memberikan
hasil Gram positif dapat dikarenakan ketika dilakukan pewarnaan dengan kristal
ungu yang terlalu lama dan ketika dikeringudarakan terlalu dekat api, warna ungu
ini akan sangat melekat dengan kaca preparat dan akan sangat terserap ke dalam
dinding sel bakteri tersebut. Sehingga ketika pewarnaan selanjutnya dengan
safranin tidak dapat memberikan warna merah karena warna merah tersebut tidak
dapat mengisi dinding sel akibat alkohol yang juga tidak bisa meluruhkan warna
ungu yang dikarenakan warna ungu sudah terlalu melekat pada dinding sel.
Spora bakteri merupakan bentuk bakteri yang sedang dalam usaha
mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar
baik bagi bakteri tersebut, maka bungkus spora akan pecah dan tumbuhlah bakteri.
Spora juga disebut endospora jika masih terletak di dalam sel bakteri. Endospora
jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk daripada bakteri biasa yaitu
bakteri dalam bentuk vegetatif (Sudjadi 2006). Pewarnaan endospora dengan
larutan malacite green akan menunjukkan reaksi positif pada bakteri penghasil
endospora, yaitu larutan akan berikatan dengan spora sehingga saat pencucian
akan tetap berwarna hijau dan cat penutup atau safranin tidak bisa diikat oleh
endospora. Sedangkan pada bakteri yang tidak menghasilkan endospora maka
larutan malacite green tidak dapat diikat (Pearce 2009). Proses pewarnaan
endospora dilakukan setelah fiksasi agar bakteri dapat melekat pada kaca preparat.
Kemudian preparat diteteskan malacite green secara merata yang berfungsi
sebagai pewarna primer dan setelah itu kaca preparat diletakkan di atas uap air
yang bertujuan untuk membantu warna menembus spora karena malacite green
sulit untuk masuk ke dalam spora sehingga pori-pori spora dibuka dengan cara
pemuaian oleh panas dan dijaga jangan sampai pewarnanya kering. Kemudian
dicuci dengan akuades dengan cara dialirkan dan dikeringudarakan yang bertujuan
menghilangkan malacite green dari bagian sel endospora. Pewarnaan dengan
safranin bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk mewarnai bagian
sel endopora, sehingga sel bakterinya akan memberikan warna merah atau merah
muda. Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan Bacillus memiliki endospora
akan tetapi bagian sel bakterinya tidak berwarna merah dan sebagian berwarna
hijau pada bagian dinding selnya. Hal ini dapat disebabkan malacite green yang
diteteskan terlalu lama sehingga melekat pada kaca preparat sehingga ketika
dilakukan pembilasan dan penambahan safranin, warna dari malacite green sulit
untuk dihilangkan.
Simpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa E. coli
dan Bacillus merupakan bakteri Gram negatif. Akan tetapi, Bacillus seharusnya
merupakan bakteri Gram positif. Bacillus juga memiliki endospora berdasarkan
pewarnaan spora, selnya berbentuk basil dengan penataan sel monococcus
sedangkan E. coli memiliki bentuk sel coccus, penataan selnya streptococcus, dan
tidak memiliki endopora.
Daftar Pustaka
Arican A, S Andic. 2011. Survival of E. coli O157:H7 in yoghurt incubated until
two different pH value and stored at 4 °C. Di dalam Kafkas Univ Vet Fak
Derg 17 (4): 537-542. Turki: Yüzüncü Yil Press.
Duc Le H, Huynh AH, Teresa MB, Andriano OH, Simon MC. 2004.
Characterization of bacillus probiotics available for human use. Di dalam
Appl Environ Microbiol 70(4): 2161-2171. London: Royal Holloway Press.
James Joyce. 2002. Prinsip-Prinsip Sains untuk Keperawatan. Retno Indah,
penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Science for
Nurses.
Karmana Oman. 2008. Biologi. Jakarta: PT Grafindo Media Pratama.
Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Yuliani Sri,
penerjemah; Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari: Anatomy
and Physiology for Nurses.
Pelczar MA, J Chan, ECS Chan. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Hadioetomo
RS, penerjemah; Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Elements of
Microbiology.
Sudhadu Bagod. 2006. Biologi Sains dalam Kehidupan: Jakarta: Yudhistira
Ghalia Indonesia.