Molecular Markers

DASAR BIOTEKNOLOGI TANAMAN
Darda Efendi, Ph.D
Nurul Khumaida, Ph.D
Sintho W. Ardie, Ph.D
Departemen Agronomi dan Hortikultura,
Faperta, IPB
2013


Marka = tanda
Marka (marka biologi) adalah sesuatu/penanda
yang dapat membedakan satu individu atau
populasi dengan individu/populasi lainnya.

Marka Morfologi (marka klasik atau marka
terlihat), berupa marka fenotipik:


Marka biokimia (berupa variasi enzim karena
perbedaan alel),


Misalnya warna/bentuk daun, bunga, bentuk biji,
isozymes/isoenzim, perbedaan enzim yang bisa
dideteksi dengan elektroforesis dan pewarnaan
khusus.
Marka DNA/Marka Molekuler/Marka Genetik;

Potongan/fragmen DNA pada lokasi tertentu dalam
genom.
Marka
Level Analisis
Morfologi
Fenotipe
Biokimia
Produk dari gen
Molekuler
Sekuen DNA


Marka morfologi dapat dilihat dengan mata
Marka biokimia dan marka molekuler tidak terlihat,
sehingga dibuat suatu metode/teknik untuk
memunculkan perbedaan marka tersebut
berdasarkan pita-pita yang muncul pada gel agarose
hasil elektroforesis.
Penggunaan Marka
 Phenotyping dan Genotyping
 Keterkaitan Evolusi
 Deteksi Kontaminasi dalam Populasi
 Diaknosis penyakit
 Bukti Forensik
 Marker Assisted breeding (Pemuliaan dengan
bantuan Marka)
 dll






Marka fenotip: bentuk/warna daun, bulu
batang/daun, gerigi daun, warna batang &
cabang, warna kulit dan daging umbi, warna
petal dan sepal, dll.
Bersifat resesif
Sangat dipengaruhi oleh lingkungan
Sulit dibedakan; terkadang sangat subjektif
Adanya fenotipe antara
Sulit dilakukan automatisasi
Merah
Delima
Beda warna kulit
buah
Citra
Beda ukuran buah
Bentuk Umbi
Warna daun muda & daun tua
Warna kulit luar
Warna korteks

Berbagai bentuk molekul dari enzim dengan
aktivitas katalis yang mirip/identik, terjadi
pada organisme yang sama

Jumlah lokus yang tersedia terbatas
Metoda pengujian yang unik
Variasi alel yang terbatas
Keuntungannya karena bersifat Codominant




Didasarkan pada adanya variasi dalam untaian DNA,
yang bisa terjadi karena:
 Mutasi basa tunggal
 Insersi/delesi (penambahan/pengurangan DNA)
 Penataan ulang DNA dalam genom

Tersedia dalam jumlah yang banyak
Tidak dipengaruhi oleh lingkungan dan tahap
perkembangan tanaman.
Dapat dilakukan pada berbagai tahap perkembangan
tanaman, sehingga dapat dilakukan sedini mungkin.





Marka berbasis hibridiasasi:
 RFLPs (Restriction Fragment Length
Polymorphisms)
 VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats;
minisatellites)
Marka berbasis PCR
 RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)
 AFLP (Amplification frgment Length Polymorphism)
 CAPS (Cleaved Amplified Polymorphism Site)
 SSR (Simple Sequence repet (microsatellite)
 SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Marka berbasis sekuen DNA


Pada marka molekuler yang bisa kita lihat
bukanlah DNA, tetapi ada/tidak adanya pita
fragmen DNA pada gel hasil elektroforesis.
Polimorfik: marka yang menghasilkan pita yeng
berbeda sehingga dapat membedakan individu
yang diuji:



Dominan (AA = Aa vs aa)
Codominan (AA vs Aa vs aa)
Monomorfik: marka yang tidak bisa
membedakan individu yang diuji.
Kodominan
Dominan
Marker
Plant A
Plant B
Plant C
-
Monomorphic bands
Polymorphic bands
+
Presens of a band, ”1”
Absence of a band, ”0”
Ko-dominan
 Uji nondestruktif/ tidak merusak
 Complete penetrance
 Bisa terjadi dan teramati sedini mungkin
 Polimorfik tinggi
 Acak sebarannya di genom
 Uji bisa diautomatisasi

Restriction fragment length
polymorphism (RFLP or riflip)
 Sepotong DNA Homolog yang
bervariasi panjangnya setelah
dipotong dengan enzim
restriksi.









Isolasi DNA
Pemotongan DNA dgn enzim restriksi
Pemisahan DNA berdasar molekulnya
dengan elektroforesis
Denaturasi DNA/pemisahan untai ganda
Blot DNA untai tunggal ke membran
Persiapan probe (akan berhibridisasi dg DNA
yang ada pada pita hasil elektroforesis)
Hibridisasi DNA di membran dengan probe
(SOUTHERN BLOT)
Foto dengan autoradiografi
Untaian DNA dengan tempattempat yang dikenal oleh
enzim restriksi
Fragmen-fragmen setelah
dipotong oleh enzim restriksi
Molekul DNA paling pendek =
bobot molekul paling rendah,
maka bergerak paling jauh
dari titik awal pada gel
elektroforesis
Enzim restriksi
BamHI memotonga
DNA pada sekuen
CGATCC; terbentuk
pita ukuran 4 kb
Sekuen CGGTCC tidak dikenal oleh
BAmHI sehingga DNA tidak terpotong
disini; terbentuk pita 9 kb.
Contoh pita RFLP
Pengekspresian potongan DNA dari RFLP
Keuntungan
 Highly polymorphic
 Co-dominant inheritance
 Many loci can be established
Kerugian:
 The technique is laborious
 Time-consuming
 Expensive
 Usually uses isotope
RAPD (Randomly Amplified Polymorphic
DNA)


RAPD adalah marka berbasis PCR yang
menggunakan primer tunggal berukuran 10
nukleotida untuk mengamplifikasi fragmen DNA
secara acak dari DNA contoh.
Dulu paling banyak digunakan, sekarang mulai
ditinggalkan orang.




Amplifikasi DNA secara acak
PCR dengan primer berisi 10 basa
Hanya 1 primer per reaksi
Amplifikasi terjadi jika ada 2 molekul primer
yang berjarak kurang dari 1000 bp, dengan
posisi berlawanan arah saling berhadapan.


Hasil PCR kemudian dipisahkan dengan
elektroforesis.
Kemungkinan terjadi perbedaan antar contoh
DNA.
Template
DNA
 Primer menempel pada banyak lokasi
template DNA secara acak (random)
 Hanya primer yang menempel berdekatan,
dengan arah berlawanan saling mendekat
yang akan mengamplifikasi DNA.
Templat
e DNA
100 - 1,500 bases
Pasangan primer yang
akan mengamplifikasi
fragment DNA pada
PCR
Tidak ada
hasil yang
akan
teramplifikasi



Cepat, mudah, relatif murah.
Banyak lokus yang bisa diidentifikasi
dengan cepat.
Uji bisa diautomatisasi.
Kerugian
• Polimorfis bersifat dominan (tidak
bisa membedakan AA dengan Aa
• Polimorfis alelnya rendah
• Hasil kurang konsisten
Perbandingan Beberapa Marka
Molekuler