25 KARAKTERISASI FRAGMEN GEN 18S rRNA

Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
25
ISSN : 2355-6404
KARAKTERISASI FRAGMEN GEN 18S rRNA POKEA (Batissa violacea celebensis
Martens, 1897) DI SUNGAI POHARA KECAMATAN SAMPARA KABUPATEN
KONAWE
(Characterization of 18S rRNA Gene Fragmen from Pokea (Batissa violacea celebensis
Martens, 1897) in the Pohara River Sampara District Konawe Regency)
Muzuni1,2*, Dwi Arinto Adi1,2, dan Satriani Syarif2
1
2
Jurusan Biologi FMIPA, Universitas Halu Oleo, Kendari
Laboratorium Biologi FMIPA, Universitas Halu Oleo, Kendari
e-mail :[email protected]
ABSTRACT
This study aims to characterize sequences of 18S rRNA gene fragment from Pokea (Batissa
violacea celebensis Martens, 1897) and its role in differentiated Pokea with other Bivalvia.
The method used is a series of PCR (Polymerase Chain Reaction) reaction used to determine
the sequence of 18S rRNA gene fragments Pokea. Analysis of the data using program NCBI
(National Center for Biotechnology Information), Clustal X, Phydit (Phylogenetik editor), and
TreeViewX for characterization 18S rRNA gene sequence to construct a phylogenetik tree of
Pokea. The results showed that character of 18S rRNA gene fragments Pokea, namely: size
827 bp, including the family Corbicullidae because it has the closest kinship with Corbicula
fluminea, as well as having restriction enzyme sites XhoI, PstI, BamHI, and DraI.
Keywords: Morphology, characterization, 18S rRNA gene, Pokea (Batissa Violacea
celebensis Martens, 1897).
dikonsumsi
PENDAHULUAN
Provinsi
masyarakat
karena
Tenggara
mengandung gizi yang tinggi terutama
memiliki beberapa sungai besar maupun
protein. Selain itu, kerang dapat pula
sungai kecil yang sangat potensial untuk
digunakan sebagai bahan perhiasan yang
kebutuhan air bersih, irigasi, pembangkit
mempunyai
listrik, dan untuk berbagai kebutuhan
Cangkangnya,
lainnya. Sungai Pohara merupakan salah
tertentu, dapat dijadikan pupuk, makanan
satu sungai yang terdapat di Sulawesi
tambahan unggas, dan pembuatan cat, serta
Tenggara. Masyarakat yang bermukim di
kapur (Nadia, 2011).
daerah
Sulawesi
oleh
Sungai
Pohara
nilai
ekonomis
setelah
melalui
penting.
proses
menggunakan
Bivalvia yang hidup di Sungai
sungai tersebut sebagai sumber mata
Pohara berasal dari family Corbicullidae
pencaharian dan salah satunya adalah
dengan jenis Batissa violacea celebensis
menangkap
Martens,
kerang
di
sungai
lalu
menjualnya (Nafsal, 2008).
Kerang (Bivalvia) adalah salah
satu
jenis
makanan
yang
banyak
1897.
Masyarakat
mengenalnya
dengan
Berdasarkan
informasi
sebutan
setempat
Pokea.
LIPI-Cibinong
dalam Bahtiar (2005) bahwa pokea ini
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
26
merupakan hewan endemik di Sulawesi
organisme secara morfologi. Penelitian ini
Tenggara sedangkan di sungai lain yang
dapat menjelaskan karakteristik fragmen
ada di Sulawesi Tenggara belum ada
gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea
informasi ditemukannya organisme ini.
celebensis Martens, 1897) yang diperoleh
Penelitian
karakter
dari Sungai Pohara Kecamatan Sampara
morfologi dan fenotip pada Pokea (Batissa
Kabupaten Konawe Provinsi Sulawesi
violacea celebensis Martens, 1897) telah
Tenggara. Karakteristik ini dapat dijadikan
banyak dilakukan (Bahtiar, 2005; Nafsal,
sebagai pembeda dengan organisme yang
2008;
lain.
Renel,
mengenai
2001),
mengidentifikasi
namun
suatu
untuk
organisme
menggunakan teknik molekuler belum
banyak
dilakukan.
molekuler
telah
Beberapa
dikembangkan
teknik
METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan
untuk
Alat
yang
digunakan
dalam
melacak adanya urutan DNA spesifik dari
penelitian ini adalah
organisme tertentu, contohnya penggunaan
sentrifugator, vortex, set elektroforesis,
urutan gen 18S rRNA untuk menentukan
mesin PCR, waterbath, tabung eppendorff,
hubungan kekerabatan suatu organisme
inkubator,
dengan
photoforesis,
yang
lain
melalui
pohon
filogenetik.
micropipet, tip,
timbangan
erlemeyer,
analitik,
hotplate,
spektrofotometer, spatula, alu dan mortar.
Gen 18S rRNA sering digunakan
Bahan
yang
digunakan
dalam
untuk studi filogenetik karena mempunyai
penelitian adalah pokea (Batissa violacea
daerah yang conserve (tidak berubah dari
celebensis Martens, 1897) yang diambil
satu organisme ke organisme yang lain).
dari Sungai Pohara Kecamatan Sampara
Daerah conserve dan unik dapat digunakan
Kabupaten Konawe Provinsi Sulawesi
untuk pencirian organisme bersangkutan
Tenggara, buffer CTAB, primer, master
sehingga menjadi urutan tanda tangan
mix, agarose, PCI (Phenol-Chlorofom-
(signature sequence). Data basa penyandi
Isoamyl Alcohol), pasir kuarsa, ethidium
gen 18S rRNA memungkinkan untuk
bromide, TAE (Tris-acetic EDTA) 1X,
digunakan dalam mengkontruksi pohon
etanol 70 %, etanol absolut, aquadest,
filogenetik
RNAse, dan loading dye.
yang
menunjukkan
nenek
moyang dan kekerabatan suatu organisme
(Suwanto,
2011).
Penelitian
secara
molekuler dapat menjadi pelengkap atau
alternatif
untuk
mengidentifikasi
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
27
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
Prosedur Kerja
2 x volume etanol absolut lalu diinkubasi
Isolasi DNA
selama 2 jam. Setelah 2 jam suspensi
Ektraksi
violacea
DNA
Pokea
celebensis
menggunakan
kemudian disentrifugasi kembali selama 20
Martens,1897)
menit pada 10.000 rpm suhu 40C sehingga
(Cetyl
pellet DNA diperoleh. Selanjutnya pellet
Trimetyl Ammonium Bromide) (Sambrook
DNA dicuci dengan 0,5 ml ethanol 70 %,
et al., 1989). Sebelum dilakukan ekstraksi,
lalu
terlebih dahulu buffer lisis disiapkan
dalam 20 μl H2O. Untuk menghilangkan
dengan kebutuhan sesuai jumlah sampel
RNA, larutan ditambahkan 100 μg/μl
yang
yang
RNAse, lalu diinkubasi pada suhu 370C
diambil dari kaki Pokea terlebih dahulu
selama 12 jam. Larutan DNA selanjutnya
ditimbang
disimpan pada suhu -40C.
akan
metode
(Batissa
CTAB
diekstraksi.
sebanyak
Sampel
0,1-0,2
gr
dan
dikeringkan
kemudian
dilarutkan
dipotong kecil-kecil, lalu digerus dengan
bantuan pasir kuarsa. Sampel dimasukkan
ke
dalam
eppendorff
1,5
ml
diinkubasi selama 30 menit dengan suhu
65oC dan dibolak-balik setiap 5 menit.
Sampel kemudian dimasukkan ke dalam es
selama 5 menit lalu disentrifugasi pada
10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan
lalu
dimasukkan
ke
dalam
eppendorff baru ukuran 1,5 ml dan
ditambahkan 1 x volume PCI (PhenolChlorofom-Isoamyl
Alcohol)
yang
berfungsi memisahkan kontaminan seperti
protein dan senyawa - senyawa organik
Selanjutnya suspensi disentrifugasi
pada 10.000 rpm, suhu 40C selama 10
Supernatan
elektroforesis
diambil
ditambahkan dengan 0,1 volume sodium
spektofotometer,
alat spektrofotometer. Elektroforesis DNA
hasil isolasi berfungsi untuk mengetahui
apakah DNA utuh atau terdegradasi.
Spektrofotometer pada panjang gelombang
260 nm dan 280 nm berfungsi untuk
mengetahui apakah DNA murni atau
terkontaminasi. Panjang gelombang yang
digunakan untuk mengetahui kandungan
DNA/RNA menggunakan spektrofotometri
UV adalah 260 nm, sedangkan untuk
kandungan
protein
menggunakan spektrofotometri UV dengan
panjang gelombang 280 nm.
Kualitas
dan
dipindahkan dalam eppendorff 1,5 ml lalu
dan
sedangkan kuantitas DNA diukur dengan
mengetahui
dengan DNA.
menit.
Kualitas DNA dapat diukur dengan
dan
ditambahkan 600 μl buffer lisis. Sampel
diambil
Uji Kualitas dan Kuantitas DNA
DNA
ditetapkan
berdasarkan nilai rasio A260/A280 sekitar
1,8 - 2,0. Kuantitas DNA ditetapkan
asetat 3 M pH 5,2 kemudian ditambahkan
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
28
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
berdasarkan asumsi bahwa 1 DO = 50
Reaksi Amplifikasi dan Elektroforesis
μg/ml DNA utas ganda dengan rumus:
dilakukan dalam bak berisi es. Sebanyak
[DNA] = A260 x 50 μg/ml x FP
1,5 μl
50 μg/ml
FP
DNA contoh (konsentrasi 100
ng/μl), 1 μl primer forward (konsentrasi 10
Keterangan :
A260
Persiapan PCR untuk amplifikasi
= Konsentrasi DNA
= Absorbansi pada panjang
gelombang 260 nm
= Konstanta untuk DNA
= Faktor pengenceran
μM), 1 μl primer reverse (konsentrasi 10
μM), 1,5 μl dH2O dan 5 μl master mix 2x
yang terdiri dari H2O, 10 x Stoffel Buffer,
dNTP, MgCl2, dan enzim Taq DNA
Polymerase, dimasukkan dalam eppendorff
Desain Primer
Primer spesifik yang digunakan
ukuran 0,5 ml. Campuran kemudian
dalam penelitian ini adalah bagian dari
divortex
dan
disentrifugasi,
urutan 18S rRNA beberapa Bivalvia,
dimasukkan ke dalam mesin PCR.
lalu
yakni: Anodonta cygnea (AM774476);
Reaksi PCR dilakukan sebanyak 35
Psilunio littoralis (AF120536); Anodonta
cardium
siklus yang terdiri dari 2 stage. Stage 1
complanata
dilakukan sebanyak 5 siklus yang terdiri
lamarckii
dari 3 step, yaitu: denaturasi selama 1
(AM774478). Urutan-urutan DNA tersebut
menit pada suhu 940C, annealing selama
diperoleh dari bank data gen (Genebank).
30 menit pada suhu 600C, dan extension
Selanjutnya
tersebut
selama 90 menit pada suhu 720C. Stage 2
menggunakan
dilakukan sebanyak 30 siklus yang terdiri
Program BioEdit versi 7.0.9. Daerah yang
dari 3 step, yaitu: denaturasi selama 1
terkonservasi merupakan daerah spesifik
menit pada suhu 940C, annealing selama
yang dimiliki oleh gen tersebut sehingga
30 menit pada suhu 550C, dan extension
dapat digunakan sebagai primer spesifik.
selama 90 menit pada suhu 720C.
sp.
(AY579090);
(AF120537);
(AF117738);
disejajarkan
Lampsilis
Elliptio
Neotrigonia
seluruh
dengan
urutan
Hasil
Primer yang digunakan dalam penelitian
amplifikasi
selanjutnya
ini adalah primer Anodr-F (5’-GAC ACG
dielektroforesis dengan agarose 1 % (0,3 g
GGG AGG TAG TGA CG-3’) dan primer
agarose, 30 ml TAE 1x dan 7,5 μl etidium
Anodr-R (5’-CCA CCC ACC GAA TCA
bromida) pada voltase konstan 100 volt
AGA AA-3’). Perkiraan jumlah urutan
dan
fragmen gen 18S rRNA yang akan
divisualisasikan di atas UV transiluminator
terbentuk adalah 821 bp (base pair).
kemudian dilakukan pemotretan dengan
80
A
photoforesis.
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
selama
30
menit
lalu
29
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
Pengurutan DNA
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengurutan DNA hasil amplifikasi
menggunakan alat DNA sequencer
Isolasi DNA Pokea (Batissa violacea
celebensis Martens, 1897)
ABI
Pada
Prism 377. Pengurutan dilakukan dengan
tahap
ini
sampel
yang
metode Sanger, menggunakan terminator
digunakan terdiri dari 4 ulangan. Setelah
dye berupa fluorescent dye rhodamin
diisolasi DNA kemudian dielektroforesis
(PRISM reaction dyedoaxy terminator
untuk mengetahui apakah isolasi berhasil
cycle
Setelah
atau tidak. Keberhasilan proses isolasi
mendapatkan hasil pengurutan, urutan
dilihat berdasarkan ada atau tidaknya pita
sequencing
kemudian
kit).
disejajarkan
dengan
DNA hasil elektroforesis. Elektroforesis
juga berfungsi untuk mengetahui apakah
menggunakan program NCBI blast.
DNA hasil isolasi utuh atau terdegradasi.
Analisis Data
Hasil elektroforesis memperlihatkan
Identifikasi
urutan
dilakukan
dengan
Analisis
kesejajaran
nukleotida
pita DNA utuh (Gambar 1) hanya pada
analisis.
ulangan 2 dan 4, sedangkan pada ulangan 1
beberapa
lokal
(local
dan
3
tidak
terlihat.
DNA
utuh
alignment) hasil pengurutan DNA dengan
terkonsentrasi pada ujung sedikit di bawah
data yang ada di GeneBank dilakukan
sumur. Pemendekan yang ada di sepanjang
dengan program BLAST (Basic Local
sumur bagian tengah menunjukkan DNA
Alignment Search Tools) yang disediakan
yang mengalami degradasi. Degradasi
NCBI (National Center for Biotechnology
DNA dapat terjadi karena adanya DNA
Information)
yang terpotong-potong akibat pemipetan
melalui
http://www.
al.,
sampel berulang-ulang atau penempatan
2010 ; Mursyidin et al., 2012). Data urutan
DNA dalam suhu kamar terlalu lama.
gen
dengan
DNA mengalami degradasi juga bisa
program Clustal X (Hidayat et al., 2008).
disebabkan oleh karena DNA mengalami
Konstruksi
pembekuan
ncbi.nlm.nih.gov/blast
18S
rRNA
pohon
(Muzuni
disejajarkan
filogenetik
et
dengan
berulang-kali,
pengenceran
metode neighbour-joining menggunakan
atau kontaminasi nuklease selama proses
program
ekstraksi DNA (Lester, 2011).
Phydit
(phylogenetik
tree)
(Sembiring et al., 2008). Analisis situs
retriksi menggunakan program NEBcutter
2.0 (Muzuni et al., 2010).
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
30
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
DNA utuh
DNA terdegradasi
RNA terdegradasi
Gambar 1. Hasil elektroforesis DNA. 1, 2, 3 dan 4 menunjukkan 4 ulangan.
RNA
terdegradasi
selanjutnya. Pengenceran DNA yaitu hasil
tampak pada bagian bawah sumur di setiap
ekstraksi DNA yang didapatkan dicampur
ulangan. Untuk menghilangkan RNA,
aquabides. Perbandingan antara DNA dan
sebelum pengukuran kualitas dan kuantitas
aquabides disesuaikan dengan besarnya
DNA
ditambahkan
pengenceran. Pengenceran dilakukan agar
RNAse sehingga dapat memberikan hasil
mendapatkan konsentrasi yang seragam
elektroforesis yang bersih dari RNA pada
untuk digunakan dalam analisis PCR.
proses
sampel
yang
telah
nomor
2
elektroforesis
selanjutnya.
Kuantitas DNA didasarkan pada
Penambahan RNAse hanya diberikan pada
nilai konsentrasi DNA, dimana konsentrasi
sampel nomor 2 karena hanya pada sampel
DNA
nomor 2 pita DNA utuh terlihat tebal dan
konsentrasi DNA (μg/ml) = Absorbansi
jelas.
(260)
didapatkan
dengan
rumus
x Faktor konversi DNA (50 μg/ml) x
Faktor pengenceran (pembacaan 1 pada
Pengukuran Kualitas Dan Kuantitas
DNA
260 nm setara dengan 50 μg/ml DNA untai
ganda). Tingkat kemurnian DNA yang
Pengukuran kualitas dan kuantitas
DNA
diperlukan
untuk
mengetahui
baik
untuk
digunakan
dalam
proses
amplifikasi dengan PCR, jika nilai rasio
kualitas DNA, sehingga dapat ditentukan
yang
pengenceran yang diperlukan untuk proses
(Suharsono, 2005 ; Sambrook et al., 1989)
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
didapatkan
adalah
1,8-2,0
31
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
Tabel 1. Hasil spektrofotometer pada sampel nomor 2
No
Perlakuan
Sampel
1
Sampel
Pokea
Absorbansi pada panjang
gelombang ()
260
280
0,274
Konsentrasi
(μg /ml)
Kemurnian
(260/280)
2740
1,9291
0,142
Hasil spektrofotometer pada Tabel
M
1
2
3
4
1 menunjukkan kualitas DNA adalah
1,9291, hal ini mengindikasikan DNA
tergolong murni dan bisa digunakan pada
2000 pb
tahap selanjutnya yaitu amplifikasi DNA.
1000 pb
DNA adalah 2740 μg/ml,
1650 pb
850 pb
Konsentrasi
setelah perhitungan maka DNA diencerkan
dengan konsentrasi
akhir 100 µg/ml
volume 20 μl, menggunakan 0,7299 μl dan
aquabides
19,270
μl
untuk
proses
amplifikasi PCR. Nilai dari volume akhir
pengenceran 20 µg/ml dipilih karena
Gambar 2. Hasil PCR. M = Marker 1 kb
leader; 1, 2, 3 dan 4
menunjukkan 4 ulangan
dianggap jumlah yang sesuai agar DNA
Pada tahap ini digunakan banyak
stok yang digunakan tidak terlalu banyak
dan tidak terlalu sedikit sehingga dapat
ulangan dengan komposisi DNA yang
berbeda-beda untuk mencari komposisi
menghemat stok DNA yang ada.
DNA
tepat
agar
proses
PCR
selanjutnya lebih maksimal. DNA dalam
Amplifikasi DNA
Hasil PCR kemudian dielektroforesis
untuk melihat pita DNA yang terbentuk.
Pada tahap ini ada 4 ulangan dari 1 sampel
yang sama (nomor 2) dengan komposisi
DNA yang berbeda-beda. Ulangan 1
jumlah DNA yang digunakan
yang
sebanyak
proses PCR terdiri dari dua jenis yaitu: (1)
DNA target yang akan diamplifikasi
kembali, (2) DNA non target (Kennedy,
2011). Hasil visualisasi PCR menunjukkan
tidak terbentuk pita DNA pada ulangan 2,
sedangkan pada ulangan 1, 3 dan 4
0,5 μl, ulangan 2 jumlah DNA yang
terbentuk pita DNA yang mengindikasikan
sebanyak 1 μl, ulangan 3
komposisi PCR berhasil melipatgandakan
digunakan
jumlah DNA yang digunakan sebanyak 1,5
DNA. Ulangan 1 hanya menghasilkan
μl, dan ulangan 4 jumlah DNA yang
DNA target atau DNA yang diinginkan,
digunakan sebanyak 2 μl (Gambar 2).
sedangkan
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
pada
ulangan
3
dan
4
32
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
membentuk pita DNA non target dan DNA
forward dan ujung reverse menggunakan
target. Hal ini menunjukkan jumlah DNA
primer Anodr-F dan Anodr-R.
0,5
μl
komposisi
yang tepat
untuk
mendapatkan hasil PCR yang maksimal.
Primer
yang digunakan dalam penelitian ini
sengaja dirancang agar berukuran kecil
DNA target berukuran sekitar 850
yaitu berukuran 20 nukleotida, karena
bp, hal ini sesuai dengan perkiraan jumlah
primer yang memiliki urutan yang pendek
yang akan dihasilkan oleh primer forward
lebih mudah diamplifikasi. Kespesifikan
dan primer reverse. Sedangkan DNA non
primer tidak akan meningkat jika panjang
target berukuran sekitar 12.000 bp yang
primer lebih dari 30 nukleotida. Primer
merupakan DNA genom. Komposisi DNA
yang tidak spesifik dapat menyebabkan
1,5 μl dan 2 μl merupakan komposisi yang
teramplifikasinya daerah lain dalam genom
menghasilkan DNA non target berupa
yang tidak dijadikan target atau sebaliknya
DNA genom, hal ini menunjukkan jumlah
tidak ada daerah pada genom yang
tersebut bukan komposisi yang tepat untuk
teramplifikasi.
mendapatkan hasil PCR yang maksimal
Hasil pengurutan fragmen gen 18S
untuk Pokea (Batissa violacea celebensis
rRNA menggunakan mesin sequencer
Martens, 1897).
berupa dendogram yang memperlihatkan
Banyaknya
DNA
yang
grafik nukleotida. Nukleotida diwakili
digunakan akan menentukan hasil akhir
warna yang berbeda-beda. Nukleotida G
dari proses amplifikasi. Jika DNA target
diwakili oleh warna hitam, nukleotida C
yang digunakan terlalu sedikit maka DNA
diwakili oleh warna biru, nukleotida T
yang
bahkan
diwakili oleh warna merah dan nukleotida
teramplifikasi,
A diwakili oleh warna hijau. Setelah diolah
dihasilkan
kemungkinan
tidak
target
sedikit
sedangkan apabila terlalu banyak DNA
menggunakan
program
Bioedit
dapat
target maka akan diperoleh lebih banyak
diketahui bahwa urutan gen 18S rRNA
DNA yang tidak diinginkan (Yuwono,
yang diurutkan dari arah forward memiliki
2006; Kennedy, 2011).
688 nukleotida sedangkan
dari arah
reverse memiliki 677 nukleotida (data
Pengurutan Fragmen DNA
tidak ditunjukkan).
Pengurutan fragmen gen 18S rRNA
dilakukan dari dua arah, arah ujung
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
33
Gambar 3. Urutan gen 18S rRNA parsial Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897).
Urutan fragmen gen 18S rRNA dari Pokea
secara
masih harus diolah kembali menggunakan
BLAST
analisis contig menggunakan program
Analisis
Bioedit untuk mengetahui urutan DNA
penyejajaran (alignment) dengan database
yang terbaca dari dua arah (forward dan
urutan gen 18S rRNA yang terdapat pada
reverse). Setelah diolah lebih lanjut,
GeneBank.
diketahui bahwa fragmen gen 18S rRNA
BLAST akan memproses penyejajaran
Pokea berukuran 827 bp (Gambar 3).
urutan gen 18S rRNA yang dimasukkan.
Sebagai pembanding, gen 18S rRNA full
Analisis dengan menggunakan program ini
length
bp
dilakukan untuk mengetahui kesesuaian
(Itskovich et al., 2007 ; Soltis et al., 2001).
antara urutan basa yang didapatkan dengan
Fragmen gen 18S rRNA Pokea
urutan yang terdapat dalam bank data gen.
berukuran
sekitar
1.800
dalam
online
pada
menggunakan
situs
yang
Secara
genebank
dilakukan
otomatis
program
NCBI.
yakni
program
penelitian ini berada pada bagian tengah
Hasil blast menggunakan NCBI
gen 18S rRNA, yaitu daerah yang diapit
tidak ditemukan adanya urutan gen 18S
oleh primer Anodr-F dan Anodr-R yang
rRNA yang memiliki presentase identitas
kemiripan hingga 100% dengan Pokea.
berukuran 827 bp.
Beberapa urutan gen 18S rRNA yang
Analisis Filogenetik Berdasarkan
Urutan Fragmen Gen 18S rRNA
Urutan fragmen gen 18S rRNA
Pokea
Martens,
terdapat di NCBI mempunyai identitas
kemiripan hanya berkisar 93% sampai
dengan 99% (data tidak ditunjukkan). Hal
(Batissa
violacea
celebensis
ini menunjukkan bahwa belum tersedianya
1897)
selanjutnya
dianalisis
urutan fragmen gen 18S rRNA Pokea di
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
34
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
GeneBank. Persentase identitas kemiripan
neighbour-joining dengan 1000x replikasi.
teratas ditempati oleh Corbicula fluminea.
Berdasarkan Gambar 4, terlihat Pokea
Hal ini menandakan Urutan gen 18S rRNA
berada pada clade X dengan 4 spesies
Pokea apabila dilihat dari hasil blast
lainnya
memiliki hubungan kekerabatan dengan
Corbicula fluminea, Hemidonax pictus,
Corbicula fluminea.
Artica, dan Ruditapes variegatus. Clade ini
Pengolahan
data
otomatis menggunakan
berkaitan
dengan
dilakukan
software yang
skala
0,1.
Diantaranya
mempunyai nilai kepercayaan 100 % yang
menunjukkan
Clade
X
ini
adalah
pohon
kelompok yang stabil. Menurut Felsenstein
filogenetik. Pada penelitian ini digunakan
(1985) dalam Bahagiawati (2010) clade
3 program yaitu NCBI, Clustal X, Phydit
yang memiliki nilai bootstrap atau nilai
(Phylogenetik editor), dan TreeViewX.
kepercayaan
Metode
dikatakan sebagai clade yang benar-benar
yang
pembuatan
pada
digunakan
untuk
mengkontruksi pohon filogenetik adalah
95%
atau
lebih
dapat
stabil.
Gambar 4. Pohon filogeni yang menunjukkan hubungan kekerabatan antara Pokea (Batissa violacea
celebensis martens,1897) dengan spesies Bivalvia atas dasar urutan gen 18S rRNA.
Angka pada percabangan mengindikasikan nilai bootstrap (%) berdasarkan alogaritma
neighbour-joining dengan 1000x replikasi. Skala mengindikasikan subtitusi 1 per 10
nukleotida pada urutan gen.
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
35
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
Pokea terlihat memiliki hubungan
kekerabatan
paling
bootstrap ini bisa meningkat apabila
dekat
dengan
Batissa violacea celebensis Martens, 1897
dengan
tingkat
dibandingkan dengan genus yang sama
kepercayaan 71 %. Hal ini menandakan
yaitu genus Batissa dari spesies lain. Pokea
clade Batissa violacea celebensis belum
dan
stabil
mengalami
morfologi
dan
perubahan dalam pengambilan sampel atau
hubungan
kekerabatan
replikasi menggunakan metode neighbour-
keduanya berada dalam famili yang sama
joining. Tingkat kepercayaan atau nilai
yaitu Corbicullidae namun berbeda genus.
Tabel
menggunakan software clustal X dan
Corbicula
fluminea
dan
2.
Spesies
Batissa
violacea
celebencis
(Bvc)
Corbicula
fluminea
(Cf)
masih
bisa
Hubungan similaritas dan
nukleotida difference dari
clade
Batissa
violacea
celebencis
Bvc
Cf
A
Rv
6/827
7/827
dari
taksonomi
segi
memiliki
yang
dekat;
Urutan fragmen gen 18S rRNA
Hp
8/827
fluminea
Phydit (Phylogenetik editor).
Pokea setelah diamplifikasi berdasarkan
primer
---
Corbicula
24/827
Anodr-F
dan
Anodr-R
serta
dikonstruksi pohon filogenetiknya dapat
dijadikan pembeda dengan organisme yang
Artica (A)
Ruditapes
variegates
(Rv)
Hemidonax
pictus (Hp)
99.27
---
9/827
10/827
28/827
99.15
98.91
---
3/827
23/827
18S
99.03
98.79
99.64
---
24/827
membandingkan Pokea dengan Bivalvia
97.1
96.61
97.22
97.1
---
lain atau Bivalvia lain. Urutan fragmen gen
lain
rRNA
sampai
dapat
digunakan
tingkat
genus,
untuk
untuk
mengetahui hubungan kekerabatan Pokea
antara
dengan organisme lain. Namun dalam
Batissa violacea celebensis dan Corbicula
penelitian ini hanya dibandingkan sampai
fluminea juga didukung dari hasil analisis
ke tingkat famili, hal ini disebabkan belum
similaritas.
tersedianya urutan gen 18S rRNA Pokea
Hubungan
kekerabatan
Diantara
kelima
spesies
3,
genus Batissa di dalam GeneBank. Hasil
menunjukkan urutan nukleotida gen 18S
analisis restriksi urutan fragmen gen 18S
rRNA
celebensis
rRNA Pokea menggunakan NEBcutter
Martens,1897 dan Corbicula fluminea
dapat dilihat pada Gambar 5. Berdasarkan
memiliki
hasil amplifikasi urutan fragmen gen 18S
Bivalvia
tersebut
Batissa
pada
violacea
kemiripan
Tabel
tertinggi
dengan
indeks similaritas sebesar 99.27 % dengan
rRNA
perbedaan 6 nukleotida dari 827 basa yang
berdasarkan primer Anodr-F dan Anodr-R,
diperbandingkan.
urutan gen ini dikenali oleh banyak enzim
Analisis
ini
Pokea
setelah
diamplifikasi
restriksi, diantaranya yang biasa digunakan
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
36
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
di laboratorium adalah XhoI, PstI, BamHI,
berhasil diisolasi sehingga dapat digunakan
dan DraI. Enzim-enzim ini merupakan
sebagai pembeda dengan bivalvia lain pada
salah satu karakter yang dimiliki oleh
daerah yang setara.
fragmen gen 18S rRNA pokea yang
Gambar 5. Enzim restriksi umum pada fragmen gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea
celebensis Martens, 1897) yaitu: XhoI, PstI, BamHI, dan DraI (kotak) dengan
menggunakan program NEBcutter.
Gen 18S rRNA berperanan dalam
sedangkan fragmen bivalvia lain yang
membedakan Pokea (Batissa violacea
digunakan sebagai pembanding adalah gen
celebensis Martens, 1897) dengan Bivalvia
18S rRNA bivalvia lain yang diperoleh
lain.
dari
Berdasarkan
hasil
penelitian
GeneBank
yang
sejajar
dengan
menunjukkan bahwa fragmen gen 18S
fragmen gen 18S rRNA pokea. Oleh
rRNA
untuk
karena fragmen gen 18S rRNA pokea
membedakan pokea dengan bivalvia lain
diperoleh dengan menggunakan metode
(Gambar
yang
PCR, maka dapat dijelaskan bahwa metode
digunakan sebagai acuan pembeda adalah
PCR dapat digunakan untuk memperoleh
fragmen gen 18S rRNA pokea yang
fragmen DNA yang dapat membedakan
dibatasi oleh primer Anodr-F dan Anodr-R,
satu organisme dengan organisme lain.
dapat
4
juga
dan
digunakan
5).
Fragmen
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Simpulan
dalam
penelitian
ini
adalah sebagai berikut :
1. Karakteristik fragmen gen 18S rRNA
Pokea adalah: memiliki ukuran 827 bp,
termasuk dalam family Corbicullidae
karena Pokea dan Corbicula fluminea
mempunyai
paling
hubungan
dekat
kekerabatan
dengan
tingkat
kepercayaan 71% dan perbedaan 6
nukleotida
dari
827
basa
diperbandingkan,
serta
mempunyai
situs
enzim
restriksi
XhoI,
yang
PstI,
BamHI, dan DraI.
2. Gen
18S
rRNA
berperan
dalam
membedakan spesies Pokea dengan
Bivalvia spesies lain.
Saran
Saran dalam penelitian ini adalah
dilakukan
penelitian
lanjutan
dengan
mengkarakterisasi gen 18S rRNA Pokea
(Batissa
1897)
violacea
hingga
celebensis
ke
tingkat
Martens,
spesies
menggunakan daerah ITS.
DAFTAR PUSTAKA
Bahagiawati, Utami, W., D., dan Buchori,
D. 2010. Pengelompokkan dan
Struktur Populasi Parasitoid Telur
Trichogrammatoidea armigera pada
Telur Helicoverpa armigera pada
Jagung
Berdasarkan
Karakter
Molekuler, J. Entomologi, 7(1):5465.
37
Bahtiar. 2005. Keberadaan Populasi Pokea
(Batissa
Violacea
Celebensis
Martens, 1897) pada Berbagai
Daerah yang Berbeda pada Sungai
Pohara
Kecamatan
Sampara
Kabupaten Konawe. Tesis Sekolah
Pasca Sarjana, IPB, Bogor.
Hidayat, T., Kusumawaty, D., Yati, D., D.,
Muchtar, A., dan Mariana, D. 2008.
Analisis Filogenetik Molekuler pada
Phyllanthus
niruri
L.
(Euphorbiaceae)
menggunakan
Urutan
Basa
DNA
Internal
Transcribed Spacer (ITS). Jurusan
Biologi Fakultas Matemateka dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Bandung.
Itskovich, V., Belikov, S., Efremova, S.,
Masuda, Y., Perez, T., Alivon, E.,
Borchiellini, C., and Boury, N.
2007. Phylogenetic Relationship
Between Freshwater and marine
Haplosclerida
(Porifera,
Demospongiae) based on the Full
Length 18S rRNA and Partial COXI
Gene
Sequences,
Porifera
Researches Biodeversity, Rusia.
Kennedy, N. 2011. PCR Troubleshooting
and Optimization. Caister Academic
Press, USA.
Lester, J. 2011. Troubleshooting Poor
Quality
Template,
http://www.bio.cam.ac.uk
/pflgroup/DNA_Facility/Quality.ht
ml, Diakses pada tanggal 01 Juni
2012.
Mursyidin, D., H. 2012. Kekerabatan
Filogenetik 15 Jenis Durian (Duri
spp.)
Berdasarkan
Analisis
Bioinformatik Gen 5.8S rRNA dan
ITS
Region.
BIOSCIENTIAE,
9(1):45-54.
Muzuni, Soepandi, D., Suharsono, U.
W., Suharsono. 2010. Isolasi dan
Pengklonan Fragmen cDNA Gen
Penyandi H+-ATPase Membran
Plasma
dari
Melastoma
malabathricum L. J. Agron.
Indonesia, 38(1): 67-74.
Nadia, L. A. R. 2011. Kumpulan Jurnal
Internasional
:
Bivalvia,
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014
Karakterisasi Fragmen Gen 18S rRNA Pokea (Batissa violacea celebensis Martens, 1897) Di
Sungai Pohara Kecamatan Sampara Kabupaten Konawe
Gastropoda, dan Echinodermata.
Program
Pasca
Sarjana,
Universitas
Gajah
Mada,
Yogyakarta.
Nafsal, A. 2008. Distribusi dan Kepadatan
Kerang Pokea (Batissa Violacea
Celebensis Martens, 1897) Secara
Spasial dan Temporal di Perairan
Sungai Pohara Sulawesi Tenggara.
Skripsi, Universitas Halu Oleo,
Kendari.
Renel, K. 2001. Studi Kepadatan dan
Distribusi Kerang Pokea (Curbicula
spp)
pada
Desa
Andadowi
Kecamatan Bondoala. Skripsi,
Universitas Halu Oleo, Kendari.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T.
1989.
Molecular
Cloning:
a
laboratory manual. 2nd ed. Cold
Spring Harbor, NY.
38
Sembiring, L., Susilawati, L., dan
Suhartanti, D. 2008. Seleksi,
Karakterisasi,
dan
Identifikasi
Bakteri
Pendegradasi
2(thiocyanomethylthio) benzothiazole
(TCMTB). Biota, 13(3): 126-131.
Soltis, E., D., Soltis, S., P., Doyle, J., J.
2001 Molecular Systematics of
Plants II; DNA Sequencing. Kluwer
Academic Publisher, New York.
Suharsono, S. 2005. Penuntun Praktikum
Pelatihan Teknik Pengklonan Gen
dan Pengurutan DNA. Pusat Antar
Universitas
Bioteknologi
IPB,
Bogor.
Suwanto, A. 2011. Keanekaragaman
Hayati Mikroorganisme. Jurusan
Biologi FMIPA IPB, Bogor.
Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi
Polymerase Chain Reaction, ANDI
OFFSET, Yogyakarta.
Muzuni et. al, Biowallacea Vol. 1 (1) : Hal. 25-38, April 2014