Vetiveria zizanioides

EKSTRAKSI DNA BAKTERI ENDOFIT SECARA LANGSUNG DARI
AKAR Vetiveria zizanioides L.
DIRECT DNA EXTRACTION OF EDOPHYTIC BACTERIA FROM
Vetiveria zizanioides L. ROOTS
Fauzi Akhbar Anugrah, Any Fitriani, Topik Hidayat
Program Studi Biologi, Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI
ABSTRAK
Identifikasi potensi dari mikroorganisme endofit dapat dilakukan dengan analisa
genetik dan analisis keragaman gen. Tingkat kemurnian yang baik dari isolasi DNA
secara langsung diperlukan untuk mempelajari mikroorganisme dari sampel alam.
Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan isolasi DNA bakteri endofit pada akar
tanaman Vetiveria zizanioides, L. tanpa tahap pengkulturan. Dalam isolasi DNA
secara langsung dilakukan beberapa tahapan diantaranya sterilisasi permukaan,
ekstraksi dan pengukuran kualitas dan kuantitas hasil isolasi DNA. Ekstraksi DNA
secara langsung pada bakteri endofit dari akar Vetiveria zizaniodes, L.telah berhasil
dilakukan dengan tingkat kemurnian mencapai 1,798 dengan konsentrasi hingga 780
µg / ml.
Kata Kunci :Ekstraksi DNA, Endofit, Vetiveria zizanioides
ABSTRACT
Potential identification of endophytic microorganisms can be done through genetic
analysis and gene diversity analysis of bacteria. Extracting high-purity DNA directly
from roots has become essential for the study of microorganisms in environmental
samples. This study aims to perform DNA isolation of endophytic bacterial roots from
Vetiveria zizanioides, L. without cultivation stages. In the stages of DNA isolation
directly is required several steps including surface sterilization, extraction and
determination of the quality and quantity of the result. Direct DNA extraction of
endophytic bacterial roots from Vetiveria zizanioides L, has been successfully
performed with the purity 1.798 and concentration reached 780 µg / ml.
Key Word: DNA extraction, Endophytic, Vetiveria zizanioides
Tanaman akar wangi (Vetiveria
zizanioides L.) merupakan tanaman herba
yang banyak digunakan sebagai pengharum
karena dapat menghasilkan senyawa
metabolit sekunder seperti minyak atsiri
yang juga dapat berfungsi sebagai obat
(Champagnant et al., 2006). Selama ini,
pemanfaatan dan pengetahuan mengenai
potensi tanaman akar wangi masih terbatas
pada pengolahan minyak atsiri dan
kerajinan dari akar wangi. Tanaman akar
_______________________
1 Penulis Penanggung Jawab
wangi sendiri dewasa ini banyak digunakan
dalam pengobatan herbal, hal tersebut
mengindikasikan
adanya
kandungan
senyawa metabolit yang berguna dalam
bidang farmakologi. Potensi terbentuknya
metabolit sekunder pada tanaman akar
wangi, beberapa terkait dengan aktivitas
bakteri endofit yang berada pada organ
tanaman dimana bakteri mampu merombak
senyawa
kompleks
menjadi
lebih
sederhana yang dapat memicu tanaman
Fauzi Akhbar Anugrah, Any Fitriani, Topik Hidayat
Ekstraksi DNA Bakteri Endofit Secara Langsung dari Akar Vetiveria zizanioides L.
menghasilkan metabolit sekunder (Fitriani
et al., 2013). Hampir setiap tanaman
tingkat tinggi memiliki bakteri endofit
yang berada pada jaringan tanaman baik
batang, daun, maupun akar (Rosenblueth &
Romero, 2006). Kemampuan pembentukan
senyawa metabolit sekunder oleh tanaman
inang, juga diduga dimiliki oleh
mikroorganisme endofit, dimana bahan
aktif
yang
dapat
dibentuk
oleh
mikroorganisme
endofit
diperkirakan
memiliki kemampuan yang sama dengan
bahan aktif yang dihasilkan tanaman inang
(Strobel et al., 2003). Kemampuan bakteri
endofit dalam memproduksi senyawa
metabolit sekunder merupakan potensi
untuk dimanfaatkan sebagai sumber
produksi dan sebagai upaya mengurangi
pemanfaatan tanaman untuk ditebang.
Telah
banyak
penelitian
yang
dilakukan
untuk
mengisolasi
mikroorganisme endofit pada beberapa
tanaman, misalnya pada tanaman obat,
tanaman
perkebunan
dan
tanaman
budidaya seperti jagung, padi (Fisher,
1992), dan kentang (Sessitsch, 2002).
Namun hanya 0,02 % atau kurang dari 99
% dari mikroorganisme di muka bumi yang
dapat dikultur dalam medium pertumbuhan
sehingga belum cukup memberikan data
keragaman dan potensi yang sebenarnya
(Streit & Schmitz, 2004). Berbagai
pendekatan telah dilakukan salah satunya
melalui analisis bakteri tanpa proses
pengkulturan dikenal dengan istilah
metagenomik.
Analisis
metagenomik
adalah teknik isolasi DNA dari sampel
alam secara langsung tanpa melalui
tahapan kultivasi mikroorganisme, yang
meliputi tahapan isolasi DNA, kloning,
transformasi,
dan
isolasi
plasmid
(Handelsman, 2004). Dengan adanya
teknik ini, perkembangan dunia Biologi
Molekuler
semakin
pesat
dalam
mengungkapkan berbagai terobosan baru
seperti identifikasi jenis bakteri pada tanah,
mikroorganisme dalam usus manusia,
mikroorganisme
simbion,
bahkan
eksplorasi gen penyandi biosintesis
makromolekul tertentu seperti antibiotik
(Handelsman, 2004). Analisis hasil isolasi
plasmid akan memberikan gambaran
mengenai diversitas gen pada bakteri
endofit yang terkait dengan biosintesis dan
produksi
bioaktif,
sehingga
dapat
dimanfaatkan sebagai referensi dan
aplikasinya dalam penelitian lebih lanjut
(Moffit & Neilan, 2002).
Tingkat kemurnian dan kualitas hasil
isolasi DNA yang baik, mutlak dibutuhkan
dalam analisis metagenomik maupun
pengujian biologi molekuler lainnya.
Untuk memulai analisis molekuler
dibutuhkan DNA yang bebas dari
kontaminasi RNA, fenolik, ataupun
senyawa protein yang dapat mengganggu
berlangsungnya proses PCR. Oleh karena
itu, tahapan isolasi DNA sangat penting
untuk dilakukan dengan baik, agar
mendapatkan DNA dengan kualitas dan
kuantitas yang baik.
METODE
Pengambilan sampel. Isolasi mikroba
endofit dilakukan dengan mengambil
sampel akar tanaman Vetiveria zizanioides
L.,
kemudian
dilakukan
sterilisasi
permukaan menggunakan larutan etanol
75% selama 1 menit, bayclin 25% selama 5
menit, dan terakhir dicuci dengan etanol
75% selama 30 detik. Setelah disterilisasi
permukaan, akar kemudian dipotong lebih
halus dan dimasukan pada cairan fisiologis
NaCl 0,98% pada tabung reaksi, kemudian
divorteks selama 1,5 jam (Lumyong et al.,
2001).
Isolasi DNA. Isolasi DNA dilakukan
dengan mengambil 3 ml hasil vorteks pada
tabung 1,5 ml, kemudian proses isolasi
DNA
dilakukan
menggunakan
“
FERMENTAS DNA Purification KIT”.
Pellet hasil sentrifugasi ditambahkan
dengan 200 µl TE buffer diresuspensikan
hingga homogen. Selanjutnya ditambahkan
Formica Online, Volume 1, Nomor 1, Januari 2014
400 µl larutan lysis solution. Tabung
kemudian diinkubasi pada suhu 65oC
selama 10 menit. Setelah diinkubasi,
kemudian ditambahkan 600 µl kloroform
kedalam tabung dan dihomogenkan dengan
dibolak-balik
sebanyak
3-5
kali.
Sentrifugasi pada 10.000 rpm selama 2
menit, kemudian fasa cair dipindahkan
pada tabung baru dan ditambahkan 800 µl
larutan presipitasi (80 µl larutan
presipitation solution dilarutkan dengan
720
µl
ddH2O
steril)
kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm
selama 2 menit. Supernatan yang terbentuk
dibuang hati-hati kemudian ditambahakan
NaCl solution 1,2 M sebanyak 100 µl.
Kemudian ditambahkan RNAse free
DNAse sebanyak 10 µl dan diinkubasi
pada suhu 37oC selama 10 menit. Setelah
itu ditambahkan 300 µl etanol absolut
dingin dan disimpan pada – 20oC selama 12 jam. Selanjutnya disentrifugasi pada
12.000 rpm selama 5 menit, cairan atas
dibuang dengan hati-hati. Pellet yang
terbentuk kemudian dilarutkan dengan
ddH2O steril sebanyak 20 µl, larutan
tersebut disimpan pada -20oC hingga siap
digunakan.
Elektroforesis
hasil
PCR.
Elektroforesis dilakukan secara horizontal
pada agarose 1% dengan tegangan 75 volt
selama 40 menit dalam larutan TAE
1x/TBE 0,5x. Alat yang digunakan adalah
alat elektroforesis BIORAD. Gel berisi
DNA hasil elektroforesis direndam dengan
Ethidium Bromide (EtBr) selama lima
menit, kemudian dibilas dengan aquadest
selama 3 menit. Agar-agar yang telah
direndam dalam EtBr kemudian dilihat dan
diamati pada UV transluminator.
HASIL DAN PEMBAHASAN
DNA genom merupakan total DNA
yang ada pada sampel terutama sampel
alam (Delmont et al., 2011). Dalam
penelitian ini, telah berhasil didapatkan
DNA total dari bakteri endofit atau
endorhizosfer
tanaman
Vetiveria
zizanioides L., dengan teknik isolasi tanpa
tahap kultivasi atau pengkulturan pada
medium tumbuh. Isolasi DNA genom
dilakukan
untuk
mengupayakan
terambilnya total DNA bakteri pada
sampel, baik bakteri yang dapat
dikulturkan (culturable) maupun DNA
bakteri yang tidak dapat dikulturkan dalam
medium (unculturable) (Delmont et al.,
2011).
Isolasi DNA genom diperlukan untuk
melakukan analisis lebih mendalam
terhadap keberagaman genetik bakteri
endofit yang ada pada akar tanaman
Vetiveria zizanioides L. Isolasi DNA tanpa
tahap
kultivasi
dengan
melakukan
sterilisasi permukaan dan mengeluarkan
bakteri dari dalam jaringan secara mekanik,
memungkinkan untuk didapatkanya total
DNA bakteri termasuk yang tidak dapat
dikulturkan. Sehingga, dengan adanya
teknik tersebut dapat menjadi salah satu
cara untuk mengetahui keragaman mikroba
total yang ada pada jaringan akar. Untuk
tahapan tersebut, akar yang digunakan
haruslah masih segar dan hidup, sehingga
bakteri endofit yang ada dalam jaringan
tidak rusak bahkan mati. Salah satu faktor
penting dalam isolasi DNA sampel alam
adalah
menghindari
kontaminasi
mikroorganisme yang tidak diharapkan,
oleh karena itu proses sterilisasi permukaan
sangat penting untuk dilakukan. Sterilisasi
permukaan yang baik pada sampel akar
dapat mengurangi dan mensterilkan bagian
luar akar dari mikroorganisme lainya,
sehingga tingkat akurasi pada hasil isolasi
DNA mikroorganisme endofit dapat lebih
baik.
Fauzi Akhbar Anugrah, Any Fitriani, Topik Hidayat
Ekstraksi DNA Bakteri Endofit Secara Langsung dari Akar Vetiveria zizanioides L.
EG1
EG2
sumur
DNA
Genom
(Tabel 1.) yang menunjukkan DNA
memiliki kemurnian yang cukup tinggi dan
tidak terkontaminasi oleh protein. Hal
tersebut sesuai dengan acuan dsDNA yang
memiliki tingkat kemurnian yang mencapai
1,8 dengan menghitung rasio OD260/280.
Tabel
1.
Hasil
kuantifikasi
secara
spektrofotometri isolasi DNA
No.
1.
Kode
EG1
Absorbansi
[DNA]
Purity
λ (nm)
µg/ml
(A260/
280)
260
280
0,1
0,089
780
1,798
0,041
340
1,625
56
2.
Gambar 1. Elektroforesis DNA genom. Kode EG
(Endofit Genom) untuk DNA Genom Bakteri
endofit Vetiveria zizanioides L., dielektroforesis
dengan gel agarosa 1,5%, 75 volt selama 40 menit
Dalam analisis metagenomik kualitas
DNA yang didapat sangatlah penting, DNA
tersebut
kemudian
akan
dilakukan
amplifikasi sehingga konsentrasi DNA
akan meningkat melalui metode PCR
(Delmont et al., 2011). Adanya kontaminan
seperti protein, fenol, atau RNA akan
mengganggu proses PCR, sehingga
kemurnian DNA yang didapat menjadi
poin penting pada tahap awal pengujian
secara metagenomik. Untuk memastikan
kuantifikasi DNA yang didapatkan maka
dilakukan
spektrofotometri
yang
menunjukkan rendemen isolasi DNA
dengan hasil cukup baik.
Pengujian kemurnian DNA dilakukan
dengan membandingkan nilai OD260 dan
OD280. Rasio OD260 dengan OD280 yang
didapatkan pada sampel mencapai 1,798
EG2
0,0
68
Keterangan: purity < 1,6 (kontaminasi fenolik),
> 1,8 (kontaminasi protein)
KESIMPULAN DAN SARAN
Isolasi DNA bakteri endofit secara
langsung pada akar tanaman Vetiveria
zizanioides, L telah berhasil dilakukan.
Tingkat kemurnian hasil ekstraksi DNA
mencapai 1,625 dan 1,798, dengan
konsentrasi diatas 340 µg/ml. Untuk
mendapatkan hasil isolasi yang lebih baik
perlu dilakukan beberapa perbandingan
metode ekstraksi yang berbeda agar
diketahui cara paling baik dalam isolasi
sampel alam berupa bakteri endofit pada
akar mengingat banyak kontaminasi yang
terdapat pada akar.
(2001). “Isolation, optimitation,
and characterization of xylanase
from
endophytic
fungi”.
Biotechnology for Sustainable
Utilization
of
Biological
Resources in the Tropic, 15, 98103.
DAFTAR PUSTAKA
Champagnat, P., Figueredo, G.C , Bessière,
J.E. (2006). “Essential Oil
Composition of
Vetiveria
nigritana from Mali”. Journal of
Essential Oil Research: JEOR.
Delmont, T. O., Robe, P., Clark, I.,
Simonet, P., Vogel, T. M. (2011).
“Metagenomic comparison of
direct and indirect soil DNA
extraction approaches”. Journal
of microbiological methods, 86,
(3), 397-400.
Fisher, P.J., Petrini, O., Lappin Scott, HM.
(1992). “The distribution of some
fungal and bacterial endophytes
in maize (Zea mays L.)”. New
Phytol, 122, 299-305.
Fitriani, A., Aryani, A., Yusuf, H.,
Permatasari, Y. (2013). “The
Exploration of Ketosynthase
Gene on Endophytic Bacterial
Root of Vetiveria zizanioides L”.
International Journal of Basic &
Applied Sciences Vol:13, (04),
112-119.
Handelsman, J. (2004). “Metagenomics:
Application of Genomics to
Uncultured
Microorganisms”.
Microbiology And Molecular
Biology Reviews. p. 669–685.
Lumyong, S., Norkaew, N., Ponputhachart,
D., Lumyong, P., Tomita, F.
Moffitt,
M.C., Neilan, B.A. (2002).
“Evolutionary Affiliation Within
the Superfamily of Ketosynthases
Reflect
Complex
Pathway
Associations”.
Journal
of
molecular evolution. 56, 446-457.
Sessitsch, A., Reiter,B., Pfeifer,U.,
Wilhelm,E. (2002). “Cultivationindependent population analysis
of bacterial endophytes in three
potato
varieties
based
on
eubacterial and Actinomycetesspecies PCR of 16S rRNA
genes”. FEMS Microbiology
Ecology. 39, 23-32.
Streit, W. R., & Schmitz, R. A. (2004).
“Metagenomics–the key to the
uncultured microbes”. Current
Opinion in Microbiology. 7, (5),
492-498.
Strobel,
G.,
Daisy,
B.
(2003).
“Bioprospecting for Microbial
Endophytes and Their Natural
Products”. Microbiology and
Molecular Biology Reviews. p.
491–502.
email: [email protected]
_______________________
1 Penulis Penanggung Jawab