AHL-laktonase
advertisement
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PENGHASIL ACYL HOMOSERINE LACTONASE (AHL-LAKTONASE) ASAL LAHAN PERTANIAN DI JAWA TIRA SITI NUR AFIAH DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011 ABSTRAK TIRA SITI NUR AFIAH. Isolasi dan Karakterisasi Bateri Penghasil Acyl Homoserine Lactonase (AHL-laktonase) Asal Lahan Pertanian di Jawa. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA. Quorum sensing (QS) adalah mekanisme komunikasi bakteri yang bergantung pada jumlah populasi bakteri tersebut dan akumulasi senyawa autoinducer (AI). Quorum sensing pada kelompok bakteri Gram negatif melibatkan senyawa acyl homoserine lactone (AHL) untuk mengatur beberapa ekspresi gen, termasuk gen virulensi. Senyawa anti-QS merupakan senyawa yang dapat mendegradasi AHL sehingga gen virulensi tidak dapat diekspresikan. Acyl homoserine lactonase (AHL-laktonase) yang disandikan oleh gen aiiA merupakan salah satu enzim yang dapat berperan sebagai anti-QS. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri penghasil AHL-laktonase yang berasal dari lahan pertanian di Jawa. Bioesei aktivitas degradasi AHL menggunakan bakteri indikator Chromobacterium violaceum. Verifikasi keberadaan AHL-laktonase pada isolat-isolat yang menunjukkan hasil bioesei positif dilakukan dengan amplifikasi gen aiiA. Dari 12 isolat bakteri yang menunjukkan aktivitas degradasi AHL, terdapat dua isolat yang memiliki gen aiiA yaitu isolat INT1c dan SGT3g. Kedua isolat tersebut memiliki bentuk sel batang, penataan sel berantai, berendospora, dan termasuk dalam kelompok bakteri Gram positif. Analisis sekuen gen aiiA menunjukkan bahwa gen aiiA isolat INT1c memiliki homologi dengan gen aiiA bakteri Bacillus cereus ATTCC 14579 sedangkan isolat SGT3g memiliki homologi dengan gen aiiA bakteri Bacillus thuringiensis BMB171. Identifikasi molekuler berdasarkan gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat INT1c memiliki kemiripan terdekat dengan bakteri Bacillus cereus strain GM3 (98%) sedangkan isolat SGT3g memiliki kemiripan terdekat dengan bakteri Bacillus thuringiensis strain A1-1 (99%). Kata kunci: anti-quorum sensing, AHL-laktonase, gen aiiA. TIRA SITI NUR AFIAH. Isolation and Characterization of Acyl Homoserine Lactonase (AHLlactonase) Producing Bacteria from Agricultural Field in Java. Under supervision of IMAN RUSMANA and ALINA AKHDIYA. Quorum sensing (QS) is a bacterial communication mechanism correlating with the number of bacterial population and accumulation of autoinducer (AI). Quorum sensing in Gram-negative bacteria involves a AI group of acyl homoserine lactone (AHL) to regulate the expression of several genes, including virulence genes. Anti-quorum sensing compounds can degrade AHL so that virulence genes can not be expressed. Acyl homoserine lactonase (AHL-lactonase) encoded by the aiiA gene is one enzyme that can act as an anti-quorum sensing. This study aimed to isolate and characterize the AHL-lactonase producing bacteria isolated from agricultural field in Java. Activity of AHL degradation bioassay using Chromobacterium violaceum as a bacterial indicator. Verification the presence of AHL-laktonase was performed by gene aiiA amplification. As many as 12 bacterial isolates showed AHL degradation activity and two isolates had the aiiA gene i.e. INT1c and SGT3g isolates. These isolates had bacil cells with chain arrangement and endospores. They were grouped in Gram-positive bacteria. AiiA gene sequence analysis showed that aiiA gene of INT1c had homology with aiiA gene of Bacillus cereus ATTCC 14579 while the SGT3g isolate had homology with aiiA gene of Bacillus thuringiensis BMB171. Molecular identification based on 16S rRNA gene showed that INT1c isolate had the closest similarity with the Bacillus cereus strain GM3 (98%) while SGT3g isolate had the closest similarity with the Bacillus thuringiensis strains A1-1 (99%). Keywords: Anti-quorum sensing, AHL-lactonase, aiiA gene. ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI PENGHASIL ACYL HOMOSERINE LACTONASE (AHL-LAKTONASE) ASAL LAHAN PERTANIAN DI JAWA TIRA SITI NUR AFIAH Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011 Judul Skripsi : Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Penghasil Acyl Homoserine Lactonase (AHL-Laktonase) Asal Lahan Pertanian di Jawa Nama : Tira Siti Nur Afiah NIM : G34070022 Departemen : Biologi Disetujui Pembimbing I Pembimbing II Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si NIP. 196507201991031002 Alina Akhdiya, M.Si NIP. 196812082001122001 Diketahui Ketua Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S NIP. 196410021989031002 Tanggal Lulus : PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Tema penelitian ini adalah anti-quorum sensing, dengan judul Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Penghasil Acyl Homoserine Lactonase (AHLLaktonase) Asal Lahan Pertanian di Jawa. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2010 hingga Mei 2011, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu Alina Akhdiya, M.Si selaku pembimbing. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak, Almarhum Mama, serta seluruh keluarga, atas doa dan kasih sayangnya. Di samping itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Atun, Ka Fina, Bang Jo, Dwi, teman-teman yang tergabung dalam IR-Crew, teman-teman yang telah bersedia mengambil sampel tanah, temanteman seperjuangan: Bian, Inong, Iyut, Maya, Mayang, Nunu, Tri, dan teman-teman di laboratorium mikrobiologi yang telah membantu dalam penelitian ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Agustus 2011 Tira Siti Nur Afiah RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Cianjur pada tanggal 14 Januari 1990 dari ayah Abdul Madjid dan ibu Ai Djubaedah. Penulis merupakan anak keempat dari empat bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Sukanagara. Pada tahun yang sama, penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB pada Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penulis mendapatkan beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) dari DIKTI pada tahun 2008-2011. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Biologi Dasar pada tahun ajaran 2009/2010 dan 2010/2011, mata kuliah Ekologi Dasar, Genetika Dasar, Biologi Cendawan, dan Botani Umum pada tahun ajaran 2010/2011. Penulis telah melaksanakan Praktik Kerja Lapang di perusahaan Bina Usaha Flora dari bulan Juli sampai Agustus 2010 dengan judul Aklimatisasi dan Pengepakan Bibit Tanaman Hias dan Sayuran di PT Bina Usaha Flora. DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL .............................................................................................................. vi DAFTAR GAMBAR .......................................................................................................... vi DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................................... vi PENDAHULUAN ............................................................................................................... 1 Latar Belakang ............................................................................................................. 1 Tujuan .......................................................................................................................... 1 METODE ........................................................................................................................... Waktu dan Tempat Penelitian ....................................................................................... Isolasi, Pemurnian, dan Penyimpanan Bakteri ............................................................... Bioesei Aktivitas Degradasi AHL ................................................................................. Pengamatan Morfologi Sel dan Pewarnaan Gram .......................................................... Amplifikasi Gen Penyandi AHL-Laktonase ................................................................... Identifikasi Isolat .......................................................................................................... Sekuensing DNA dan Analisis Bioinformatika .............................................................. Konstruksi Pohon Filogenetik ....................................................................................... 1 1 1 2 2 2 2 2 2 HASIL ................................................................................................................................ Bioesei Aktivitas Degradasi AHL ................................................................................. Pengamatan Morfologi Sel dan Pewarnaan Gram .......................................................... Amplifikasi Gen Penyandi AHL-Laktonase ................................................................... Identifikasi Isolat .......................................................................................................... Konstruksi Pohon Filogenetik ....................................................................................... 2 2 3 4 4 5 PEMBAHASAN ................................................................................................................. 5 SIMPULAN ....................................................................................................................... 6 SARAN .............................................................................................................................. 7 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................................... 7 LAMPIRAN ....................................................................................................................... 8 DAFTAR TABEL Halaman 1 Isolat bakteri yang diperoleh dari lahan pertanian di Jawa dan aktivitas degradasi AHL ...... 3 2 Diameter zona degradasi AHL pada 12 isolat .................................................................... 3 3 Karakteristik morfologi sel dan pewarnaan Gram isolat-isolat yang menunjukkan aktivitas degradasi AHL .................................................................................................... 4 4 Hasil analisis sekuen gen aiiA isolat INT1c & SGT3g dengan menggunakan program BLAST-N ....................................................................................................................... 5 5 Hasil analisis sekuen gen aiiA isolat INT1c & SGT3g dengan menggunakan program BLAST-X ....................................................................................................................... 5 6 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA isolat INT1c & SGT3g dengan menggunakan program BLAST-N .......................................................................................................... 5 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Zona degradasi AHL 12 isolat terpilih .............................................................................. 3 2 Visualisasi amplikon gen aiiA pada gel agarose 1% .......................................................... 4 3 Visualisasi amplikon 16S rRNA pada gel agarose 1% ....................................................... 4 4 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen aiiA dari isolat INT1c dan SGT3g yang dibandingkan dengan sekuen gen aiiA dari beberapa spesies bakteri lainnya ...................... 5 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Komposisi media pertumbuhan yang digunakan ............................................................... 9 2 Hasil sekuensing dan analisis bioinformatik gen aiiA dan 16S rRNA dengan program BLAST-N dan BLAST X ................................................................................................. 10 PENDAHULUAN Latar belakang Bakteri fitopatogen merupakan bakteri yang menyebabkan infeksi atau penyakit pada tumbuhan. Pengendalian bakteri patogen dapat dilakukan dengan menggunakan senyawa antibiotik atau antimikrob. Masalah yang dihadapi dalam penggunaan antibiotik adalah timbulnya resistensi bakteri terhadap antibiotik tersebut. Hal ini mendorong dilakukannya berbagai penelitian tentang pengendalian bakteri patogen yang yang lebih aman dan tidak dikhawatirkan akan menimbulkan resistensi. Defoirdt et al. (2004) menyatakan bahwa ekspresi gen virulensi pada beberapa bakteri patogen diregulasi oleh proses quorum sensing. Quorum sensing (QS) adalah mekanisme komunikasi bakteri sebagai suatu pengaturan ekspresi gen yang bergantung pada jumlah populasi bakteri tersebut dan akumulasi senyawa autoinducer (AI) (Rukayadi & Hwang 2009). QS terlibat dalam regulasi fungsi biologi yang penting seperti luminescence, produksi antibiotik, transfer plasmid, motilitas, virulensi, pembentukan biofilm dan berperan dalam regulasi ekspresi gen-gen patogen pada Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas aeruginosa, dan beberapa spesies Erwinia (Dong et al. 2000; Zang & Dong 2004). Proses QS melibatkan molekul kimia yang disebut autoinducer (AI). AI merupakan molekul sinyal yang disekresikan, diakumulasi, diserap kembali, dan dikenali oleh bakteri selama proses QS terjadi (Rukayadi & Hwang 2009). Salah satu jenis molekul AI adalah N-acylhomoserine lactone (AHL) yang dihasilkan oleh bakteri Gram negatif, serta digunakan untuk komunikasi dalam spesies yang sama (Rukayadi & Hwang 2009). Salah satu prinsip pengendalian virulensi bakteri fitopatogen dengan dasar QS adalah mencegah akumulasi AHL dengan mendegradasi molekul sinyal tersebut. Senyawa atau molekul yang dapat mendegradasi molekul AHL disebut senyawa anti-QS. Anti-QS memiliki kelebihan dalam mengontrol infeksi bakteri yaitu tidak mempengaruhi pertumbuhan, sehingga dapat menghindarkan timbulnya tekanan seleksi yang sering menghasilkan generasi patogen yang lebih resisten terhadap antibiotik (White & Finan 2009). Beberapa enzim pendegradasi AHL telah diidentifikasi dari beberapa bakteri dan memiliki potensi sebagai anti-QS (Yin et al. 2010). Salah satu enzim pendegradasi AHL adalah enzim Acyl Homoserine Lactonase (AHL-laktonase) (Dong et al. 2000). Enzim ini disandikan oleh gen aiiA yang dimiliki oleh Bacillus dan mampu mendegradasi AHL dengan menghidrolisis ikatan lakton yang terdapat pada molekul AHL (Dong et al. 2000). AHL-laktonase sebagai salah satu senyawa anti-QS dapat digunakan sebagai alternatif dalam pengendalian bakteri fitopatogen. Sebagai salah satu negara megabiodiversity, Indonesia mempunyai kekayaan dan keragaman sumberdaya mikroba yang sangat besar dan berpotensi sebagai penghasil AHL-laktonase. Oleh karena itu, isolasi dan karakterisasi bakteri penghasil AHL-laktonase merupakan langkah awal untuk untuk memanfaatkan potensi tersebut. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri penghasil AHL-laktonase asal lahan pertanian di Jawa. METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan November 2010 sampai dengan Mei 2011, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA IPB. Isolasi, Pemurnian, dan Penyimpanan Bakteri Isolasi bakteri dilakukan terhadap 27 sampel tanah dan 10 sampel daun yang berasal dari lahan pertanian di Jawa. Isolasi bakteri tanah dilakukan dengan metode cawan sebar pada media nutrient agar (NA) (Lampiran 1). Sebanyak 1 gram sampel tanah disuspensikan dengan 9 mL larutan garam fisiologis 0,85%. Suspensi dienceran serial sampai pengenceran 10-6, 10-7, dan 10-8. Sisa suspensi dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit pada suhu 80oC. Sebanyak 0,1 mL dari setiap pengenceran dan suspensi yang dipanaskan tersebut masing-masing disebarkan ke media NA, kemudian diinkubasi selama dua hari pada suhu ruang. Bakteri filosfer diisolasi dengan cara membilas sampel daun dengan larutan garam fisiologis 0,85% dan disebarkan pada media pertumbuhan King’s B (Lampiran 1). Kolonikoloni bakteri yang tumbuh dan 2 menunjukkan morfologi yang berbeda dimurnikan dengan metode cawan gores. Setelah murni, bakteri disimpan dalam agar miring. Bioesei Aktivitas Degradasi AHL Isolat-isolat murni ditumbuhkan pada media Luria broth (LB). Setelah 48 jam, kultur disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Sebanyak 100 μL supernatant diteteskan pada paper disk dan diletakkan pada permukaan media cawan Luria agar (LA) yang mengandung Chromobacterium violaceum 1%. Cawan tersebut kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Media LB steril digunakan sebagai kontrol. Paper disk yang dikelilingi oleh zona tidak berwarna ungu menunjukkan adanya aktivitas degradasi AHL. Pengamatan Morfologi Sel dan Pewarnaan Gram Isolat-isolat yang menunjukkan hasil bioesei positif diamati morfologi sel (bentuk sel, penataan sel, dan endospora) dan reaksi terhadap pewarnaan Gram. Amplifikasi Gen Penyandi AHL-laktonase DNA bakteri diisolasi dengan metode Lazo (Lazo et al. 1987). Isolat-isolat yang menunjukkan hasil bioesei degradasi AHL positif diamplifikasi menggunakan primer spesifik untuk gen aiiA yaitu aiiAF (5’-ATC GGA TCC ATG ACA GTA AAG AAG CTT ATT TCG-3’, dan aiiAR (5’-GTC GAA TTC CTC AAC AAG ATA CTC CTA ATG ATGT-3’ (Dong et al. 2000). Campuran PCR terdiri dari 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0.3 µM masing-masing primer, 0.02 U/µL Taq DNA polymerase, template DNA, ddH2O, dan buffer DNA polymerase. Amplifikasi dilakukan selama 30 siklus PCR dengan kondisi pra-denaturasi (94oC, 10 menit), denaturasi (94oC, 30 detik), annealing (52oC, 30 detik), elongasi (72oC, 1 menit), dan post-PCR (72oC, 5 menit) (Chan et al. 2007). Produk PCR dilarikan pada mini-gel elektroforesis (agarose 1%) pada tegangan listrik 50 volt selama 45 menit (Sambrook et al. 1989). Visualisasi di atas UV Transiluminator dilakukan dengan pewarnaan Ethidium Bromida. Identifikasi Isolat Isolat-isolat yang menunjukkan hasil positif pada bioesei degradasi AHL dan amplifikasi gen aiiA diidentifikasi secara molekuler (16S rRNA). Amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan primer 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’) (Marchesi et al. 1998). Amplifikasi dilakukan selama 30 siklus PCR dengan kondisi pra-PCR (94oC, 2 menit), denaturasi (92oC, 30 detik), annealing (50oC, 1 menit), elongasi (72oC, 1 menit), dan post-PCR (75oC, 5 menit). Sekuensing DNA dan Analisis Bioinformatika Pengurutan DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan memanfaatkan jasa perusahaan sekuensing 1st Base di Singapura. Sekuen yang diperoleh dijajarkan dengan data pada GenBank menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotida (BLAST-N) dan Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide 6-frame translationprotein (BLAST-X) dari situs National Center for Biotechnology Information (NCBI) melalui http://www.ncbi.nlm.nih.gov untuk mengetahui tingkat kemiripan gen aiiA dan 16S rRNA dari isolat yang dianalisa. Konstruksi Pohon Filogenetik Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan metode Neighbor Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x menggunakan program MEGA 5.0. HASIL Bioesei Aktivitas Degradasi AHL Isolasi bakteri dari 10 sampel daun dan 27 sampel tanah asal lahan pertanian di Jawa menghasil 261 isolat (Tabel 1). Dari 261 isolat yang diuji, 12 isolat diantaranya yang menunjukkan aktivitas degradasi AHL yang kuat. Aktivitas degradasi ini ditunjukan dengan terbentuknya zona tidak berwarna ungu di sekitar paper disk (Gambar 1). 3 Tabel 1 Isolat bakteri yang diperoleh dari lahan pertanian di Jawa dan aktivitas degradasi AHL Sampel Jumlah isolat yang Jumlah isolat menunjukan ativitas hasil isolasi Asal Jenis Jumlah degradasi AHL Jawa barat: Bogor Filosfer 3 12 0 Tanah 3 25 0 Cianjur Filosfer 7 30 2 Tanah 6 40 1 Indramayu Tanah 6 69 5 Pangandaran Tanah 2 22 0 Sukabumi Tanah 1 3 0 Jawa Timur: Lamongan Tanah 1 3 0 Nganjuk Tanah 1 3 0 Pekalongan Tanah 2 8 1 Rembang Tanah 2 12 0 Sragen Tanah 3 34 3 Total 37 261 12 CJF4a CJF7b CJT2e INT1b INT1c INT1d INT1e INT1f SGT3a SGT3f PKT2a SGT3g Kontrol Gambar 1 Zona degradasi AHL 12 isolat terpilih. Diameter zona degradasi AHL yang dihasilkan oleh 12 isolat berkisar antara 8 sampai 11 mm (Tabel 2). Isolat yang menunjukkan diameter zona degradasi AHL terbesar adalah isolat PKT2a dan SGT3g yaitu sebesar 11 mm, sedangkan isolat CJF4a, INT1b, dan INT1f menunjukkan diameter zona degradasi AHL terkecil yaitu 8 mm. Tabel 2 Diameter zona degradasi AHL 12 isolat terpilih Kode Isolat Diameter zona degradasi AHL (mm) CJF4a 8 CJF7b 9 CJT2e 9 INT1b 8 INT1c 10 INT1d 9 INT1e 10 INT1f 8 PKT2a 11 SGT3a 10 SGT3f 10 SGT3g 11 Pengamatan Morfologi Sel dan Pewarnaan Gram Tiga isolat yang menunjukkan bioesei aktivitas degradasi AHL positif termasuk dalam kelompok Gram negatif sedangkan sembilan isolat lainnya termasuk dalam kelompok Gram positif. Isolat INT1d dan INT1f memiliki bentuk sel bulat dengan penataan bergerombol sedangkan sepuluh isolat lainnya memiliki bentuk sel batang dengan penataan rantai. Tujuh isolat memiliki endospora, sedangkan lima isolat lainnya tidak. 4 Tabel 3 Karakteristik morfologi sel dan pewarnaan Gram isolat-isolat bakteri yang memiliki aktivitas degradasi AHL Kode Isolat CJF4a CJF7b CJT2e Bentuk dan penataan sel Batang, rantai Batang, rantai Batang, rantai INT1b Batang, rantai INT1c INT1d PKT2a SGT3a SGT3f Batang, rantai Bulat, bergerombol Batang, rantai Bulat, bergerombol Batang, rantai Batang, rantai Batang, rantai SGT3g Batang, rantai INT1e INT1f Reaksi Pewarnaan Gram dan endospora Positif, berendospora Positif, berendospora Negatif, tidak berendospora Positif, tidak berendospora Positif, berendospora Negatif, tidak berendospora Positif, berendospora Positif, tidak berendospora Positif, berendospora Positif, berendospora Negatif, tidak berendospora Positif, berendospora Amplifikasi Gen Penyandi AHL-laktonase Dari 12 isolat yang mampu mendegradasi AHL, dua isolat diantaranya (isolat SGT3g dan INT1c) menunjukkan hasil amplifikasi gen aiiA berukuran ~0.8 kb (Gambar 2). 1 2 M Hasil analisis sekuen gen aiiA dengan menggunakan program BLAST-N menunjukkan bahwa gen aiiA isolat INT1c memiliki homologi dengan gen aiiA Bacillus cereus ATTCC 14579 dengan persen identitas sebesar 96% sedangkan isolat SGT3g memiliki homologi dengan gen aiiA Bacillus thuringiensis BMB171 dengan persen identitas sebesar 95% (Tabel 4). Analisis sekuen gen aiiA dengan program BLAST-X menunjukkan bahwa protein yang disandikan oleh gen aiiA pada kedua isolat memiliki homologi dengan struktur kristal AHL-laktonase pada B. thuringiensis (Tabel 5). Identifikasi Isolat Identifikasi isolat INT1c dan SGT3g dilakukan secara molekuler berdasarkan gen 16S rRNA. Visualisasi amplikon di atas UV transluminator memperlihatkan adanya pita DNA dengan ukuran ~1.3 kb (Gambar 3). Analisis kemiripan hasil sekuensing gen 16S rRNA kedua isolat dengan data di GenBank dilakukan menggunakan program BLAST-N (Lampiran 2). Isolat INT1c menunjukkan kemiripan 98% dengan B. cereus strain GM3 sedangkan isolat SGT3g memiliki kemiripan 99% dengan B. thuringiensis strain A1-1 (Tabel 6). 1 2 M 2.0 kb 1.0 kb ~0.8 kb 0.7 kb Gambar 2 Visualisasi amplikon gen aiiA pada gel agarose 1% (M= 1 kb DNA ladder, Sumur 1= INT1c, Sumur 2= SGT3g). ~1.3 kb 1.0 kb Gambar 3 Visualisasi amplikon gen 16S rRNA pada gel agarose 1% (keterangan: M= 1 kb ladder, sumur 1= INT1c, sumur 2= SGT3g). 5 Tabel 4 Hasil analisis sekuen gen aiiA INT1c & SGT3g dengan menggunakan program BLAST-N Kode isolat Sekuen bakteri yang homolog % identitas Nomor akses INT1c Bacillus cereus ATCC 14579 96% AE016877.1 SGT3g Bacillus thuringiensis BMB171 95% CP001903.1 Tabel 5 Hasil analisis sekuen gen aiiA INT1c & SGT3g dengan menggunakan program BLAST-X % Nomor Kode isolat Sekuen bakteri yang homolog identitas akses INT1c Crystal Structure Of Quorum-Quenching 82% 2BR6_A N-Acyl Homoserine Lactone Lactonase in Bacillus thuringiensis SGT3g Crystal Structure Of Quorum-Quenching 98% 2BR6_A N-Acyl Homoserine Lactone Lactonase in Bacillus thuringiensis Tabel 6 Hasil analisis sekuen gen 16S rRNA isolat INT1c & SGT3g dengan menggunakan program BLAST-N % Kode isolat Sekuen bakteri yang homolog Nomor akses identitas INT1c Bacillus cereus strain GM3 16S ribosomal 98% JF837192.1 RNA gene, partial sequence SGT3g Bacillus thuringiensis strain A1-1 16S 99% JF496321.1 ribosomal RNA gene, partial sequence Konstruksi Pohon Filogenetik Hasil analisis filogenetik gen aiiA isolat INT1c dan SGT3g yang dibandingkan dengan gen aiiA beberapa spesies bakteri di GenBank disajikan pada gambar 4. Bacillus_anthracis_str._A0248 Bacillus_megaterium Bacillus_amyloliquefaciens Bacillus_subtilis INT1c Bacillus_cereus_ATCC_14579 SGT3g Bacillus_thuringiensis_BMB171 Gambar 4 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen aiiA dari isolat INT1c dan SGT3g yang dibandingkan dengan sekuen gen aiiA dari beberapa spesies bakteri lainnya. PEMBAHASAN Bakteri yang menghasilkan senyawa antiquorum sensing dapat mendegradasi senyawa Acylhomoserine lactone (AHL). Bakteri ini dapat ditemukan pada habitat yang sama dengan bakteri yang ber-quorum sensing (Chan et al. 2007). Keberadaan kedua jenis bakteri ini di alam menciptakan suatu keseimbangan ekosistem. Bakteri fitopatogen yang dapat ditemukan pada lahan pertanian mengindikasikan keberadaan bakteri penghasil senyawa anti-QS. Pada penelitian ini, eksplorasi bakteri filosfer dan tanah dari 10 sampel daun dan 27 sampel tanah yang berasal dari lahan pertanian di Jawa menghasilkan 12 isolat bakteri yang menunjukkan aktivitas degradasi AHL yang kuat. Bioesei aktivitas degradasi AHL dilakukan untuk menyeleksi bakteri-bakteri yang menghasilkan senyawa pendegradasi AHL. Bakteri yang digunakan sebagai indikator terjadinya proses degradasi AHL adalah bakteri Chromobacterium violaceum. Bakteri C. violaceum termasuk dalam kelompok bakteri Gram negatif yang mudah ditemukan di tanah dan air, serta memproduksi pigmen ungu spesifik yang bernama violacein (McClean et al. 1997). Pigmen violacein diproduksi melalui proses QS. Penghambatan proses QS pada bakteri ini menyebabkan bakteri tidak dapat memproduksi pigmen violacein sehingga koloni bakteri tidak berwarna ungu. Degradasi AHL dilakukan menggunakan supernatant yang diteteskan pada paper disk. Paper disk yang dikelilingi oleh zona tidak berwarna ungu menunjukkan adanya aktivitas 6 degradasi AHL oleh senyawa ekstraseluler yang dihasilkan oleh bakteri. Senyawa ekstraselular ini dapat berperan sebagai antiQS. Enzim yang dapat mendegradasi AHL dikelompokkan menjadi dua enzim utama yaitu AHL-laktonase dan AHL-acylase (Czajkowski & Jafra 2009). AHL-laktonase mampu menghidrolisis cincin lakton pada AHL dan termasuk ke dalam kelompok enzim superfamily metallolactamase (Liu et al. 2008). AHL-laktonase yang disandikan oleh gen aiiA merupakan anti-QS pertama yang diaplikasikan untuk mengontrol virulensi bakteri patogen (Dong et al. 2000). Bioesei aktivitas degradasi AHL terhadap 260 isolat menunjukkan 12 isolat bakteri diantaranya mampu mendegradasi AHL. Paper disk kontrol dikelilingi oleh warna ungu yang disebabkan oleh pigmen violacein yang diproduksi bakteri C. violaceum melalui proses QS. Zona tidak berwarna ungu di sekeliling paper disk menunjukkan adanya suatu senyawa pada supernatant kultur yang dapat mencegah proses QS sehingga pigmen tersebut tidak dihasilkan. Diameter zona degradasi AHL yang dihasilkan oleh 12 isolat bervariasi. Diameter zona degradasi AHL terbesar dihasilkan oleh isolat PKT2a dan SGT3g yaitu sebesar 11 mm, sedangkan isolat CJF4a, INT1b, dan INT1f memiliki diameter zona degradasi AHL terkecil yaitu sebesar 8 mm. Hal ini menunjukan perbedaan aktivitas degradasi AHL oleh senyawa yang dihasilkan. Suhu dan pH optimum aktivitas AHL-laktonase adalah 200C dengan pH 8 (Chen et al. 2010). Aktivitas produksi enzim oleh bakteri juga dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu kandungan nutrisi, derajat keasaman media, tekanan osmotik, tingkat aerasi, suhu, dan kontrol terhadap kontaminasi selama inkubasi (Pandey et al. 2000). Verifikasi keberadaan AHL-laktonase pada isolat-isolat yang menunjukkan hasil bioesei positif dilakukan dengan amplifikasi gen penyandi AHL-laktonase yaitu gen aiiA. Gen aiiA pertama kali ditemukan pada Bacillus sp. strain 240B1 (Dong et al. 2000). Homologi gen aiiA kemudian berhasil ditemukan pada beberapa strain bakteri seperti Bacillus thuringiensis, B. cereus, B. mycoides, dan B. amyloliquefaciens (Dong et al. 2002; Yin et al. 2010). Dari 12 isolat terpilih, dua isolat diantaranya menunjukkan amplifikasi gen aiiA yaitu isolat SGT3g dan INT1c. Amplifikasi gen aiiA pada isolat INT1c dan SGT3g menghasilkan amplikon berukuran ~0.8 kb. Analisis sekuen gen aiiA dengan program BLAST-X menunjukkan bahwa protein yang disandikan oleh gen aiiA pada isolat INT1c dan SGT3g mirip dengan struktur kristal AHL-laktonase pada B. thuringiensis. Tingkat kemiripan protein AHL-laktonase SGT3g sebesar 98% sedangkan tingkat kemiripan AHL-laktonase INT1c dengan AHL-laktonase B. thuringiensis hanya sebesar 82%. Hasil ini didukung oleh analisis dengan program BLAST-N dimana isolat SGT3g memiliki kemiripan 95% dengan gen aiiA pada B. thuringiensis BMB171 sedangkan gen aiiA isolat INT1c lebih mirip dengan gen aiiA pada Bacillus cereus ATCC 14579 (kemiripan 96%). Analisis filogenenetik gen aiiA isolat INT1c dan SGT3g menunjukkan bahwa isolat INT1c berkerabat dekat dengan B. cereus ATCC 14579 sedangkan isolat SGT3g berkerabat dekat dengan B. thuringiensis BMB171. Identifikasi molekuler berdasarkan gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat INT1c menunjukkan kemiripan 98% dengan dengan bakteri B. cereus strain GM3, sedangkan isolat SGT3g menunjukkan kemiripan 99% dengan bakteri B. thuringiensis strain A1-1. Bacillus cereus dan B. thuringiensis merupakan anggota genus Bacillus yang bersifat aerob atau anaerob fakultatif, termasuk dalam kelompok Gram positif, dan membetuk spora (Drobniewski 1993). Kedua bakteri tersebut telah dilaporkan memiliki gen penyandi AHL-laktonase yang homolog dengan gen aiiA pada Bacillus strain 240B1 (Dong et al. 2002; Dong et al. 2004). Dong et al. (2004) juga menyatakan bahwa B. thuringiensis mampu memproduksi enzim laktonase yang efektif untuk menginaktivasi autoinducer pada proses quorum sensing. Bacillus thuringiensis mampu mendegradasi AHL di lingkungannya sehingga dapat digunakan sebagai agen biokontrol terhadap virulensi bakteri yang dimediasi oleh sinyal AHL melalui quorum sensing (Dong et al. 2002). SIMPULAN Isolasi bakteri filosfer dan tanah asal lahan pertanian di Jawa menghasilkan 12 isolat bakteri yang menunjukkan aktivitas degradasi AHL kuat. Dua isolat diantaranya yaitu isolat INT1c dan SGT1g memiliki gen penyandi AHL-laktonase (aiiA). Kedua isolat tersebut memiliki bentuk sel batang dengan 7 penataan berantai, berendospora, dan termasuk dalam kelompok bakteri Gram positif. Identifikasi molekuler berdasarkan gen 16s rRNA menunjukkan bahwa isolat INT1c memiliki kemiripan terdekat dengan bakteri Bacillus cereus strain GM3 (98%) sedangkan isolat SGT3g memiliki kemiripan terdekat dengan bakteri Bacillus thuringiensis strain A1-1 (99%). SARAN Perlu dilakukan identifikasi molekuler gen pendegradasi AHL yang disandikan oleh gen selain aiiA pada sepuluh isolat terpilih lainnya. DAFTAR PUSTAKA Chan KG, Tiew SZ, Ng CC. 2007. Rapid isolation method of soil bacilli and screening of their quorum quenching activity. Asia Pasific J of Mol Biol and Biotechnol 15: 153-156. Chen R, Zhou Z, Cao Y, Bai Y, Yao B. 2010. High yield expression of an AHLlactonase from Bacillus sp. B546 in Pichia pastoris and its application to reduse Aeromonas hydrophia mortality in aquaculture. Microbial Cell Factories 9: 39-49. Czajkowski R, Jafra S. 2009. Quenching of acyl-homoserine-dependent quorum sensing by enzymatic disruption of signal molecules. Acta Biochimica Polonica 56: 1-16. Defoirdt T, Boon N, Bossier P, Verstraete W. 2004. Disruption of bacterial quorum sensing: an unexplored strategy to fight infections in aquaculture. Aquaculture 240: 69-88. Dong YH, Xu JL, Li XC, Zang LH. 2000. aiiA, a novel enzyme inactivates acyl homoserine-lactone quorum-signal signal and attenuated the virulence of Erwinia carotovora. Proc Natl Acad Sci 97: 3526-3531. Dong YH, Gusti AR, Zhang Q, Xu JL, Zhang LH. 2002. Identification of quorum quenching N-acyl homoserine lactonases from Bacillus species. Appl Environ Microbiol 68: 1754-1759. Dong YH, Zhang XF, Xu JL, Zhang LH. 2004. Insecticidal B. thuringiensis silences Erwinia carotovora virulence by a new form of microbial antagonism, signal interference. Appl Environ Microbiol 70: 954-960. Drobniewski FA. 1993. Bacillus cereus and related species. Clinical Microbiol Reviews 6: 324-338. Lazo GR, Roffey R, Gabriel DW. 1987. Conservation of plasmid DNA sequences and pathovar identification of strain Xanthomonas campestris. Pytopathology 77: 1461-1467. Liu D, et al. 2008. Mechanism of the quorum-quenching lactonase (AiiA) from Bacillus thuringiensis. 1. Product-bound strctures. Biochemistry 47: 7706-7714. Marchesi JR, et al. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-spesific PCR primer that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Appl Environ Microbiol 64: 795-799. McClean KH, et al. 1997. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of Nacylhomoserine lactones. Microbiol 143: 3703-3711. Pandey A, et al. 2000. Advances in microbial amylases. Biotechnol Appl Biochem 31: 135-152. Rukayadi Y, Hwang JK. 2009. Pencegahan quorum sensing: suatu pendekatan baru dalam mengatasi infeksi bakteri. Medicinus 22: 22-27. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Ed ke-2. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. White CE, Finan TM. 2009. Quorum sensing in Agrobacterium tumefaciens: chance or necessity?. J Bacteriol 191: 11231125. Yin XT, et al. 2010. Isolation and characterization of an AHL-lactonase gene from Bacillus amyloliquefaciens. World J Microb Biotechnol 26:1361 – 1367. Zhang LH, Dong YH. 2004. Quorum sensing and signal interference: diverse implications. Mol Microbiol 53: 15631571. 8 LAMPIRAN 9 Lampiran 1 Komposisi media pertumbuhan yang digunakan A. Media nutrien agar (NA) - Agar 1.5% - Nutrient broth 0.8% B. Media King’s B agar - Agar 1.5% - Pepton 2% - K2HPO4 0.15% - MgSO4.4H2O 0.15% - Gliserol 1.5% C. Media luria agar (LA) - Agar 1.5% - NaCl 1% - Tripton 1% - Yeast extract 0.5% 10 Lampiran 2 Hasil sekuensing dan analisis bioinformatika gen aiiA dan 16S rRNA dengan program BLAST-N dan BLAST X A. Urutan nukleotida gen aiiA isolat INT1c 1 71 131 191 251 311 371 431 491 AAAAACACACAAACCTTACGTACTATCAGTTAAACGAAGATAGTTCAAAAAAAGTTTAT AATTTATTTAAAAAAATTATTTAAACGAAAAAGTCATGAGCACGCGAACTCATGACTTTT TGCACTATATATACTCAGGGAACACTCTACAACCCTTTTCCTGCTCTATATCATGACCAA AGAAAACAATTGGTTTCTCTTTCGCCACAACTCCTTTTAAACGTTTAATTGAAGATAAAG CTAATTCTGGATCAAATCCTGCGTTAAACGGCACTTCATCTTCAAAATTCTCTTTCGTGT ACGATGCATCAATTGTTAATAAAACTGAGCCGGATTGCTCCGTCTCCAAATGAATAGCGA CTGATAGGCCTGGAGAATGAATTCCCTGGCGCGAGTATACAATTAATTGAACACCTGGTA CCACTTCATAATCCCCTTCAATAATTTTGTAGTTCAAATGCGGTAATATACATTCTTTCA TATATTCTTCTCTATG 495 70 130 190 250 310 370 430 490 B. Analisis sekuen gen aiiA isolat INT1c dengan program BLAST-N > gb|AE016877.1| Length=5411809 Bacillus cereus ATCC 14579, complete genome Features in this part of subject sequence: hypothetical protein N-acyl homoserine lactone hydrolase Score = 798 bits (432), Expect = 0.0 Identities = 470/485 (97%), Gaps = 15/485 (3%) Strand=Plus/Plus Query 11 Sbjct 3409374 3409433 Query 71 Sbjct 3409434 3409493 Query 131 Sbjct 3409494 3409553 Query 191 Sbjct 3409554 3409613 Query 251 Sbjct 3409614 3409670 Query 311 Sbjct 3409671 3409727 Query 371 Sbjct 3409728 3409778 Query 431 Sbjct 3409779 3409838 Query 491 Sbjct 3409839 AAACCTTACGTACTATCAGTTAAACGAAGATAGTTCAAAAAAAGTTTATAATTTATTTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAACCTTACGTACTATCAGTTAAACGAAGATAGTTCAAAAAAAGTTTATAATTTATTTAA 70 AAAAATTATTTAAACGAAAAAGTCATGAGCACGCGAACTCATGACTTTTTGCACTATATA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAAAATTATTTAAACGAAAAAGTCATGAGCACGCGAACTCATGACTTTTTGCACTATATA 130 TACTCAGGGAACACTCTACAACCCTTTTCCTGCTCTATATCATGACCAAAGAAAACAATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACTCAGGGAACACTCTACAACCCTTTTCCTGCTCTATATCATGACCAAAGAAAACAATT 190 GGTTTCTCTTTCGCCACAACTCCTTTTAAACGTTTAATTGAAGATAAAGCTAATTCTGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTTTCTCTTTCGCCACAACTCCTTTTAAACGTTTAATTGAAGATAAAGCTAATTCTGGA 250 TCAAATCCTGCGTTAAACGGCACTTCATCTTCAAAATTCTCTTTCGTGTACGATGCATCA |||||||||||| || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCAAATCCTGCG--AA-CGGCACTTCATCTTCAAAATTCTCTTTCGTGTACGATGCATCA 310 ATTGTTAATAAAACTGAGCCGGATTGCTCCGTCTCCAAATGAATAGCGACTGATAGGCCT ||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||||||||||||||| ||||| ATTGTTAATAAAACTGAGCCGGATTGCTCCGTCTC-AA-TGAATAGCGACTGAT-GGCCT 370 GGAGAATGAATTCCCTGGCGCGAGTATACAATTAATTGAACACCTGGTACCACTTCATAA ||||||||| || ||||| |||||||| ||||||||||||||||||||||||||| GGAGAATGA---CC-TGGCG----TATACAAT-AATTGAACACCTGGTACCACTTCATAA 430 TCCCCTTCAATAATTTTGTAGTTCAAATGCGGTAATATACATTCTTTCATATATTCTTCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCCCCTTCAATAATTTTGTAGTTCAAATGCGGTAATATACATTCTTTCATATATTCTTCT 490 CTATG ||||| CTATG 495 3409843 11 C. Urutan nukleotida gen aiiA isolat SGT3g 1 50 110 170 230 290 348 408 468 528 588 648 708 768 828 888 CGGGATCCCATGACCAGTAAAAGAAGGCTTTTATTTTCCCCCCCCCCCC TCCCAGCAAGGTCCGTTGTATTGGTTAGATCAATTCTTTCTGTTAATTAGTACACTCCGC GCCGGGGGAATTTTATTGAACTTTACCTGTATGGTGTTATCTTTTTGGAGACAGAAGAGG GGCCTATTTTAGTAGATACAGGTATGCCAGAAAGTGCAGTTAATAATGAAGGGATTTTTA ACGGTACATTTGTTGAAGGACAGATTTTACCGAAAATGACTGAAGAAGATAGAATCGTGA ATATATTAAAGCGTGTAGGGTATGAGCCGGACGACC-TTT-TATATTATTAGTTCTCACT TACATTTTGATCATGCAGGAGGAAACGGTGCTTTTACAAATACACCGATTATTGTGCAGC GAGCGGAATATGAGGCAGCACTTCATAGAGAAGAATATATGAAAGAATGTATATTACCGC ATTTGAACTACAAAATTATTGAAGGGGATTATGAAGTGGTACCAGGTGTTCAATTATTGT ATACGCCAGGTCATTCTCCAGGCCATCAGTCGTTATTCATTGAGACGGAGCAATCCGGTT CAGTTTTATTAACAATTGATGCATCGTACACGAAAGAGAATTTTGAAGATGAAGTGCCGT TCGCAGGATTTGATCCAGAATTAGCTTTATCTTCAATCAAACGCTTAAAAGAAGTTGTGA CAAAAGAGAAATCGATTGTTTTCTTTGGTCATGATATAGAGCAGGAAAAAGGGTTGTAGA GTGTTCCCGGAGTATATATAGTGCAAAAAGTCATGAGTTCGCGTGCTCATGACTTTTTCG TTTAAATAATTTTTTTTAAATAAATTATAAACTTTTTTTCAAACTATCTTCCGTTTAACT GGATAGTACGTAAAGTTTTTACATCAATTAAGGAGTATCCTTG 930 49 109 169 229 289 347 407 467 527 587 647 707 767 827 887 D. Analisis sekuen gen aiiA isolat SGT3g dengan program BLAST-N > gb|CP001903.1| Length=5330088 Bacillus thuringiensis BMB171, complete genome Features in this part of subject sequence: hypothetical protein N-acyl homoserine lactone hydrolase Score = 1404 bits (760), Expect = 0.0 Identities = 846/883 (96%), Gaps = 24/883 (3%) Strand=Plus/Minus Query 50 Sbjct 3334673 3334622 Query 110 Sbjct 3334621 3334566 Query 170 Sbjct 3334565 3334506 Query 230 Sbjct 3334505 3334446 Query 290 Sbjct 3334445 3334386 Query 348 Sbjct 3334385 3334326 Query 408 Sbjct 3334325 3334266 Query 468 Sbjct 3334265 3334206 TCCCAGCAAGGTCCGTTGTATTGGTTAGATCAATTCTTTCTGTTAATTAGTACACTCCGC ||||||| |||| ||||||| | |||||||| |||| ||||||||| | ||||||| ||| TCCCAGC-AGGT-CGTTGTA-T-GTTAGATC-ATTC-TTCTGTTAA-TGGTACACT-CGC 109 GCCGGGGGAATTTTATTGAACTTTACCTGTATGGTGTTATCTTTTTGGAGACAGAAGAGG ||| |||||| |||||||||| ||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| GCC-GGGGAA-TTTATTGAAC-TTACCTGTATGGTGTTATC-TTTTGGAGACAGAAGAGG 169 GGCCTATTTTAGTAGATACAGGTATGCCAGAAAGTGCAGTTAATAATGAAGGGATTTTTA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| GGCCTATTTTAGTAGATACAGGTATGCCAGAAAGTGCAGTTAATAATGAAGGGCTTTTTA 229 ACGGTACATTTGTTGAAGGACAGATTTTACCGAAAATGACTGAAGAAGATAGAATCGTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGGTACATTTGTTGAAGGACAGATTTTACCGAAAATGACTGAAGAAGATAGAATCGTGA 289 ATATATTAAAGCGTGTAGGGTATGAGCCGGACGACC-TTT-TATATTATTAGTTCTCACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| ||||||||||||||||||| ATATATTAAAGCGTGTAGGGTATGAGCCGGACGACCTTTTATATATTATTAGTTCTCACT 347 TACATTTTGATCATGCAGGAGGAAACGGTGCTTTTACAAATACACCGATTATTGTGCAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACATTTTGATCATGCAGGAGGAAACGGTGCTTTTACAAATACACCGATTATTGTGCAGC 407 GAGCGGAATATGAGGCAGCACTTCATAGAGAAGAATATATGAAAGAATGTATATTACCGC || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACGGAATATGAGGCAGCACTTCATAGAGAAGAATATATGAAAGAATGTATATTACCGC 467 ATTTGAACTACAAAATTATTGAAGGGGATTATGAAGTGGTACCAGGTGTTCAATTATTGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTTGAACTACAAAATTATTGAAGGGGATTATGAAGTGGTACCAGGTGTTCAATTATTGT 527 12 Query 528 Sbjct 3334205 3334146 Query 588 Sbjct 3334145 3334086 Query 648 Sbjct 3334085 3334026 Query 708 Sbjct 3334025 3333967 Query 768 Sbjct 3333966 3333907 Query 828 Sbjct 3333906 3333850 Query 888 Sbjct 3333849 ATACGCCAGGTCATTCTCCAGGCCATCAGTCGTTATTCATTGAGACGGAGCAATCCGGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATACGCCAGGTCATTCTCCAGGCCATCAGTCGTTATTCATTGAGACGGAGCAATCCGGTT 587 CAGTTTTATTAACAATTGATGCATCGTACACGAAAGAGAATTTTGAAGATGAAGTGCCGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGTTTTATTAACAATTGATGCATCGTACACGAAAGAGAATTTTGAAGATGAAGTGCCGT 647 TCGCAGGATTTGATCCAGAATTAGCTTTATCTTCAATCAAACGCTTAAAAGAAGTTGTGA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| ||||||| ||||||| TCGCAGGATTTGATCCAGAATTAGCTTTATCTTCAATTAAACGTTTAAAAGGAGTTGTGG 707 CAAAAGAGAAATCGATTGTTTTCTTTGGTCATGATATAGAGCAGGAAAAAGGGTTGTAGA | ||||||||| | ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||| CGAAAGAGAAACCAATTGTTTTCTTTGGTCATGATATAGAGCAGGAAAA-GGGTTGTAGA 767 GTGTTCCCGGAGTATATATAGTGCAAAAAGTCATGAGTTCGCGTGCTCATGACTTTTTCG |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGTTCCCTGAGTATATATAGTGCAAAAAGTCATGAGTTCGCGTGCTCATGACTTTTTCG 827 TTTAAATAATTTTTTTTAAATAAATTATAAACTTTTTTTCAAACTATCTTCCGTTTAACT |||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| || |||||||| |||||||| TTTAAATAATTTTTTT-AAATAAATTATAAACTTTTTTTGAA-CTATCTTC-GTTTAACT 887 GGATAGTACGTAAAGTTTTTACATCAATTAAGGAGTATCCTTG | ||||||||||| ||||| |||||| | | |||||||| ||| G-ATAGTACGTAA-GTTTT-ACATCA-TCA-GGAGTATC-TTG 930 3333813 E. Analisis sekuen gen aiiA isolat INT1c dengan program BLAST-X > pdb|2BR6|A Chain A, Crystal Structure Of QuorumQuenching N-Acyl Homoserine Lactone Lactonase Score = 197 bits (500), Expect = 3e-51 Identities = 102/123 (83%), Positives = 108/123 (88%), Gaps = 5/123 (4%) Frame = -1 Query 495 HREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPGVQLIVYSRQGIHSPGLSVAIHLETEQSGSVLL HREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPGVQL+ HSPG ++ ++TEQSGSVLL Sbjct 135 HREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPGVQLLYTPG---HSPGHQSLFIKTEQSGSVLL 190 316 Query 315 TIDASYTKENFEDEVPFNAGFDPELALSSIKRLKGVVAKEKPIVFFGHDIEQEKGCRVFP 136 TIDASYTKENFEDEVPF AGFDPELALSSIKRLK VV KEKPI+FFGHDIEQEK CRVFP Sbjct 191 TIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIKRLKEVVKKEKPIIFFGHDIEQEKSCRVFP 249 Query 135 Sbjct 250 EYI EYI EYI 127 252 13 F. Analisis sekuen gen aiiA isolat INT1c dengan program BLAST-X > pdb|2BR6|A Chain A, Crystal Structure Of QuorumQuenching N-Acyl Homoserine Lactone Lactonase pdb|2BTN|A Chain A, Crystal Structure And Catalytic Mechanism Of The QuorumQuenching N-Acyl Homoserine Lactone Hydrolase Length=252 Sort alignments for this subject sequence by: E value Score Percent identity Query start position Subject start position Score = 285 bits (728), Expect(4) = 1e-109 Identities = 138/143 (97%), Positives = 140/143 (98%), Gaps = 0/143 (0%) Frame = +2 Query 329 YIISSHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRAEYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVV YIISSHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQR EYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVV Sbjct 101 YIISSHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRTEYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVV 508 160 Query 509 PGVQLLYTPGHSPGHQSLFIETEQSGSVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIK 688 PGVQLLYTPGHSPGHQSLFI+TEQSGSVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIK Sbjct 161 PGVQLLYTPGHSPGHQSLFIKTEQSGSVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIK 220 Query 689 Sbjct 221 RLKEVVTKEKSIVFFGHDIEQEK RLKEVV KEK I+FFGHDIEQEK RLKEVVKKEKPIIFFGHDIEQEK 757 243 Score = 123 bits (308), Expect(4) = 1e-109 Identities = 59/60 (98%), Positives = 60/60 (100%), Gaps = 0/60 (0%) Frame = +1 Query 154 LETEEGPILVDTGMPESAVNNEGIFNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLY 333 LETEEGPILVDTGMPESAVNNEG+FNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLY Sbjct 42 LETEEGPILVDTGMPESAVNNEGLFNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLY 101 Score = 25.4 bits (54), Expect(4) = 1e-109 Identities = 9/12 (75%), Positives = 11/12 (92%), Gaps = 0/12 (0%) Frame = +3 14 Query 750 Sbjct 241 RKKGCRVFPEYI ++K CRVFPEYI QEKSCRVFPEYI 785 252 Score = 24.6 bits (52), Expect(4) = 1e-109 Identities = 14/33 (42%), Positives = 16/33 (48%), Gaps = 7/33 (21%) Frame = +3 Query 90 Sbjct 16 C*LVHSA------PGEFY*TLPVWCYLFGDRRG C L HS+ PG+ LPVWCYL G CMLDHSSVNSALTPGKLL-NLPVWCYLLETEEG 170 47 G. Urutan nukleotida gen 16S rRNA isolat INT1c 1 62 122 182 242 302 362 422 482 542 602 662 722 782 813 842 902 962 1022 1082 1142 1202 1262 GGAGAATGATAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGT 61 AACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTT 121 GAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGT 181 CGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAG 241 AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCCTACGGGGAAGGCAGCC 301 AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGAACGATAAGTTCTGACGGAGCAACCGCCGGCGTGAGTG 361 ATGAAGGCCTTTCGGGTTCGTAAAACTCTGTTGTTTAGGGAAAGAACAAGTGCTTAGTTG 421 AATAAGCTGGCACCTTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCA 481 GCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCA 541 GGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC 601 TGGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTA 661 GAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC 721 GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA 781 GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCG 841 GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCG 872 CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG 901 GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC 961 TGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTG 1021 TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCT 1081 TAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG 1141 TGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG 1201 ACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTT 1261 CGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCA 1322 H. Analisis sekuen gen 16S rRNA isolat INT1c dengan program BLAST-N > gb|JF837192.1| sequence Length=1363 Bacillus cereus strain GM3 16S ribosomal RNA gene, partial Score = 2324 bits (1258), Expect = 0.0 Identities = 1303/1321 (99%), Gaps = 18/1321 (1%) Strand=Plus/Plus Query 4 Sbjct 49 Query 62 Sbjct 109 Query 122 Sbjct 169 Query 182 Sbjct 229 Query 242 GAAT-GA-TAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGT |||| || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGT 61 AACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTT 121 GAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGT 181 CGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAG 241 AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCCTACGGGGAAGGCAGCC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| ||| |||||| | 108 168 228 288 301 15 Sbjct 289 AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT-CCTAC-GGG-AGGCAG-C 344 Query 302 361 Sbjct 345 AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGAACGATAAGTTCTGACGGAGCAACCGCCGGCGTGAGTG |||||||||||||||||||||| |||| ||| ||||||||||||| |||| ||||||||| AGTAGGGAATCTTCCGCAATGG-ACGA-AAG-TCTGACGGAGCAA-CGCC-GCGTGAGTG Query 362 Sbjct 400 Query 422 Sbjct 455 Query 482 Sbjct 514 Query 542 Sbjct 574 Query 602 Sbjct 634 Query 662 Sbjct 693 Query 722 Sbjct 753 Query 782 Sbjct 813 Query 842 Sbjct 873 Query 902 Sbjct 933 Query 962 Sbjct 993 Query 1022 Sbjct 1053 Query 1082 Sbjct 1113 Query 1142 Sbjct 1173 Query 1202 Sbjct 1233 Query 1262 Sbjct 1293 Query 1322 Sbjct 1353 399 ATGAAGGCCTTTCGGGTTCGTAAAACTCTGTTGTTTAGGGAAAGAACAAGTGCTTAGTTG ||||||| |||||||| |||||||||||||||| |||||| |||||||||||| |||||| ATGAAGG-CTTTCGGG-TCGTAAAACTCTGTTG-TTAGGG-AAGAACAAGTGC-TAGTTG 421 AATAAGCTGGCACCTTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCA |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AATAAGCTGGCACC-TTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCA 481 GCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCA 541 GGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC 601 TGGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTA | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| T-GGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTA 661 GAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC 721 GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA 781 GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCG 841 CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG 901 GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC 961 TGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTG TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCT 454 513 573 633 692 752 812 872 932 992 1021 1052 1081 1112 TAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG 1141 TGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG 1201 ACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTT 1261 CGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGC 1321 A | A 1322 1353 1172 1232 1292 1352 16 I. Urutan nukleotida gen 16S rRNA isolat SGT3g 1 72 132 192 252 312 372 432 492 552 612 672 732 792 852 912 972 1032 1040 1092 1152 1212 1270 J. GGGGGGGAAGGTTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACG 71 TGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAAC 131 ATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACC 191 CGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGAC 251 CTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAG 311 CAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGA 371 AGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTG 431 GCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA 491 TACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCT 551 GAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGA 611 GGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGG 671 TAAGTCTGATGTCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTG 731 GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGT 791 TAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA 851 CGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT 911 GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTA 971 GAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCG 1031 TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATC 1091 ATTAAGTTGGGCTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATC 1099 ATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAAGAAGGTGGGGATGACG 1151 TCAAATCATCATGCCCCTTAAGACCTGGGCTACCCACGTGCTACAATGGACGGTTCAAAA 1211 AGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGG 1269 CTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGNTCAGCAGCCGC 1313 Analisis sekuen gen 16S rRNA isolat SGT3g dengan program BLAST-N > gb|JF496321.1| partial sequence Length=1411 Bacillus thuringiensis strain A1-1 16S ribosomal RNA gene, Score = 2364 bits (1280), Expect = 0.0 Identities = 1296/1304 (99%), Gaps = 2/1304 (0%) Strand=Plus/Plus Query 12 Sbjct 20 Query 72 Sbjct 80 Query 132 Sbjct 140 Query 192 Sbjct 200 Query 252 Sbjct 260 Query 312 Sbjct 320 Query 372 Sbjct 380 Query 432 Sbjct 440 Query 492 Sbjct 500 TTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGC 71 CCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGC 131 ATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTA 191 GCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGA 251 TCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATC 311 TTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGT 371 CGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGG 431 TACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGC AAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGT 79 139 199 259 319 379 439 491 499 551 559 17 Query 552 Sbjct 560 Query 612 Sbjct 620 Query 672 Sbjct 680 Query 732 Sbjct 740 Query 792 Sbjct 800 Query 852 Sbjct 860 Query 912 Sbjct 920 Query 972 Sbjct 980 Query 1032 Sbjct 1040 Query 1092 Sbjct 1100 Query 1152 Sbjct 1160 Query 1212 Sbjct 1220 Query 1272 Sbjct 1280 GAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGA 611 GGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGG 671 CGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG 731 GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCC 791 GCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGC 851 TGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGA 911 AGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTT 971 CTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATG 1031 TTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGC 1091 ACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAAGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCAT ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| ACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCAT 1151 GCCCCTTAAGACCTGGGCTACCCACGTGCTACAATGGACGGTTCAAAAAGCTGCAAGACC |||||||| |||||||||||| |||||||||||||||||||| |||| |||||||||||| GCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACC GCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCC TACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGN-TCAGCA-GCCGC |||||||||||||||||||||||||||||| |||||| ||||| TACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGC 1313 1323 619 679 739 799 859 919 979 1039 1099 1159 1211 1219 1271 1279
