Paper Title (use style: paper title)

Pengaruh Ekstrak Kasar Buah Mahkota Dewa...
PENGARUH EKSTRAK KASAR BUAH MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa (Scheff.)
Boerl.) TERHADAP EKSPRESI GEN MMP-2 PADA SEL HeLa
Sherry Aristyani, Evi Setyowati, dan E.W. Ningtyas
Jurusan Biologi, FMIPA Universitas Negeri Malang
[email protected]
ABSTRAK
Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl) merupakan tanaman yang berasal dari Indonesia.
Mahkota dewa telah digunakan sebagai obat alami untuk menyembuhkan berbagai penyakit. Ekstrak
mahkota dewa telah dilaporkan dapat menginduksi apoptosis pada berbagai jenis sel kanker. Sel HeLa
merupakan salah satu jenis sel kanker serviks yang memiliki ekspresi gen MMP-2. MMP-2 (Matris
Metalloproteinase-2) merupakan enzim proteolitik yang berperan dalam regulasi matriks ekstraselular dan
menginduksi invasi sel. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengeruh ekstrak kasar buah mahkota
dewa terhadap ekspresi gen MMP-2 pada sel HeLa. Buah mahkota dewa diekstrak menggunakan shoxlet
dengan pelarut metanol dan HCL 6M. Dosis ekstrak buah mahkota dewa sebesar 20 µg/ml, 40 µg/ml, 60
µg/ml diberikan pada sel HeLa dan diinkubasi selama 24 jam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
kelompok perlakuan memiliki ekspresi MMP-2 yang lebih tinggi dibanding dengan kelompok kontrol,
dan ekspresi MMP-2 tertinggi terdapat pada perlakuan dosis 40 µg/ml. Kesimpulan dari penelitian ini
adalah ekstrak kasar buah mahkota dewa dapat menaikkan ekspresi MMP-2 pada sel HeLa.
Kata kunci: Ekstrak kasar, mahkota dewa, MMP-2, sel HeLa
PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyakit yang disebabkan
adanya pembelahan sel yang tidak terkontrol. Kanker
muncul dari satu sel yang mengalami mutasi sehingga
memicu pembelahan terus menerus dan tidak
berdiferensiasi (Macdonald & Ford, 1997). Salah satu
kanker yang banyak menyerang wanita saat ini adalah
kanker serviks. Kasus kanker serviks banyak terjadi di
negara berkembang dan negara terbelakang (WHO,
2013).
Faktor utama penyebab kanker serviks adalah
adanya infeksi virus Human Papilomavirus (HPV) strain
16 dan 18. Virus HPV strain 16 dan 18 dapat ditularkan
melalui hubungan seksual, HPV masuk kedalam tubuh
melalui epitel serviks yang terluka, kemudian virus
masuk dan menginfeksi sel basal (Spencer, 2007). HPV
dapat mengakibatkan kanker servik karena adanya
ekspresi gen onkoprotein yang dimiliki oleh HPV seperti:
E5, E6 dan E7 (Jiang & Yue, 2013). Onkoprotein
tersebut mampu menekan kerja tumor suppressor yang
berperan sebagai kontrol pembelahan sel dan
menghambat apoptosis (Burd, 2003).
Sel HeLa merupakan salah satu jenis sel kanker
servik yang banyak digunakan dalam berbagai penelitian.
Sel HeLa dilaporkan memiliki ekspresi MMP-2 yang
tinggi (Kaewprag et al., 2013). MMP-2 adalah salah satu
anggota dari kelompok protein Matrix Metalloproteinase
(MMP) yang berperan dalam regulasi matriks
ektraselular (Sun, 2010). MMP-2 dilaporkan dapat
merusak laminin-5 yang merupakan komponen matriks
Prosiding Seminar Nasional Biologi 2016_ ISBN: 978‐602‐0951‐11‐9
ekstraseluler sehingga dapat memicu invasi sel dan
metastasis (Koshikawa et al., 2000). Tingginya ekspresi
MMP-2 pada sel HeLa disebabkan oleh aktivitas protein
E6 dan E7 dari HPV strain 16 yang mampu memicu
faktor transkripsi Sp1 dan PEA3 untuk mengekspresikan
MMP-2 dan MT1-MMP yang merupakan salah satu
protein aktifasi MMP-2 (Kaewprag et al., 2013).
Penggunaan tanaman obat untuk pengobatan
kanker telah lama digunakan, salah satu tanaman yang
banyak digunakan untuk pengobatan kanker adalah
mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl).
Mahkota dewa merupakan tanaman tropis yang termasuk
dalam famili Thymelaceae (Altaf et al., 2013). Adanya
kandungan senyawa gallic acid pada buah mahkota dewa
mampu meningkatkan ekspresi Bax yang merupakan gen
pro-apoptosis dan menurunkan ekspresi Bcl2 yang
merupakan gen anti apoptosis sehingga mampu
mengaktifkan caspase-9 sehingga dapat memicu sel
untuk berapoptosis (Faried et al., 2007). Di sisi lain gallic
acid juga dilaporkan mampu menyebabkan invasi dan
migrasi sel kanker payudara dengan memicu
terekspresinya MMP-9 (Jhang, 2015).
Saat ini meskipun telah dilaporkan adanya
senyawa gallic acid pada mahkota dewa, namun sejauh
ini masih belum ada laporan mengenai ekstrak mahkota
dewa terhadap metastasis kanker. Penelitian ini bertujuan
untuk mengetahui pengaruh ekstrak kasar buah Mahkota
Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl) terhadap
ekspresi gen MMP-2 yang berperan dalam proses
metastasis pada sel HeLa.
19
Pengaruh Ekstrak Kasar Buah Mahkota Dewa...
METODE
Ekstraksi. Buah mahkota dewa diperoleh dari
Balai Materia Medika, Batu. Serbuk buah mahkota dewa
ditimbang sebanyak 0,5 gram dan diletakkan ke dalam
soxhlet. Proses berikutnya ditambahkan larutan 40 ml
metanol dan 10 ml HCL 6M ke dalam shoxlet dan
dilakukan ekstraksi selama 2 jam dalam 90oC. Setelah
proses ekstraksi selesai, ekstrak diuapkan dengan rotary
evaporator pada suhu 40oC selama ± 20 menit.
Kultur Sel. Kultur sel kanker HeLa diperoleh dari
Laboratorium Biomedik Universitas Brawijaya. Sel HeLa
ditumbuhkan dalam medium RPMI1640 dengan diberi
suplemen 10% fetal bovine serum and 1% antibiotik.
Ekstrak kasar buah mahkota dewa dilarutkan pada pelarut
ekstrak dan diberikan pada kelompok perlakuan dengan
dosis 20 µg/ml, 40 µg/ml, dan 60 µg/ml. Pada kelompok
kontrol positif diberikan pelarut ekstrak. Sel HeLa setelah
diberi perlakuan diinkubasi dengan CO 2 5% pada 37oC
selama 24 jam.
Quantitative Real Time PCR (qRT-PCR)
RNA total sel HeLa diisolasi dengan
menggunakan RNeasy Mini Kit (Qiagen). Sintesis cDNA
menggunakan 2 µg RNA total dan Omniscript (Qiagen).
qRT-PCR dilakukan dengan menggunakan QuantiTect
SYBR Green PCR kit (Qiagen). Primer yang digunakan
adalah:MMP-2: 5’-CCGTCGCCCATCATCAAGTT-3’
dan5’-CTGTCTGGGGCAGTCCA-AAG-3’; dan β-actin,
5’-GACCTGTACGCCAACACAG-3’
dan
5’CTCAGGAGGAGC-AATGATC-3’ (Song et al., 2013).
Thermocycling condition untuk proses qRT-PCR adalah
sebagai berikut: 15 min at 95oC; (45 cycles) 15 sec at 94o
C, 30 sec at 59oC, and 30 sec at 72oC. Hasil yang
diperoleh dianalisis menggunakan metode relative
quantification 2-ΔΔCq (Livak & Schmittgen, 2001).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil analisis dengan menggunakan metode
relative quantification 2-ΔΔCq (Gambar 1). Semua
kelompok perlakuan dapat diketahui memiliki ekspresi
MMP-2 yang tinggi dari pada kelompok kontrol. Pada
kelompok perlakuan, ekspresi MMP-2 tertinggi terdapat
pada dosis 40 µg/ml dan ekspresi terendah MMP-2
terdapat pada dosis 60 µg/ml. Pada kelompok kontrol,
kontrol positif menunjukkan ekspresi MMP-2 yang
rendah jika dibandingkan dengan kelompok negatif. Hasil
tersebut dapat diketahui bahwa ekstrak kasar buah
mahkota dewa dapat meningkatkan ekspresi MMP-2 pada
sel HeLa.
Prosiding Seminar Nasional Biologi 2016_ ISBN: 978‐602‐0951‐11‐9
Gambar 1. Ekspresi MMP-2 pada sel HeLa setelah
diberi perlakuan ekstrak kasar buah mahkota
dewa
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak
kasar buah mahkota dewa mampu menaikkan ekspresi
MMP-2 pada sel HeLa. Hasil ini berlawanan dengan
penelitian yang melaporkan bahwa ekstrak mahkota dewa
berpotensi dalam pengobatan kanker (Faried et al., 2007;
Tandrasasmita et al., 2010) Kontradiksi ini diduga karena
adanya aktivitas senyawa gallic acid yang terkandung
dalam buah mahkota dewa terhadap peningkatan
transkripsi gen MMP-2.
Gallic acid dilaporkan terlibat dalam jalur
signaling Ras dan ERK sehingga mampu menghambat
MMP-2 (Lo et al., 2011), namun disisi lain, gallic acid
dilaporkan mampu meningkatkan aktivitas jalur signaling
P38 Mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)(Yeh
& Yen, 2006; Kaur et al., 2007; Liang et al., 2012). P38
MAPK merupakan jalur transduksi sinyal di dalam sel
yang berfungsi untuk meregulasi kematian sel dan
migrasi sel (Koul et al., 2013). Pada proses migrasi sel,
adanya aktivitas MAPK P38 dilaporkan dapat menaikkan
ekspresi gen MMP-2 (Shin et al., 2005; Song et al., 2006;
Xu et al., 2006). Jadi diduga adanya kenaikan ekspresi
gen MMP-2 karena adanya aktivitas senyawa gallic acid
yang terkandung dalam buah mahkota dewa.
Hasil pada kelompok perlakuan dosis 60 µg/ml
ekspresi MMP-2 mengalami penurunan. Adanya
penurunan ekspresi ini dimungkinkan juga karena adanya
kandungan senyawa lain pada ekstrak kasar buah
mahkota dewa yang mampu menurunkan ekspresi
MMP-2. Ekstrak kasar buah mahkota dewa dengan
menggunakan metanol dilaporkan mengandung senyawa
flavonoid dan fenol (Lay et al., 2014). Tingginya
kandungan fenol dilaporkan mampu memicu apoptosis
pada sel kanker (Roy et al., 2002). Berdasarkan laporan
tersebut diduga bahwa adanya penurunan ekspresi MMP2 akibat terjadinya apoptosis pada sel HeLa akibat
aktifitas fenol, semakin banyak sel yang mengalami
kematian maka jumlah sel semakin berkurang dan
mengakibatkan ekspresi gen MMP-2 menjadi semakin
berkurang.
20
Pengaruh Ekstrak Kasar Buah Mahkota Dewa...
Hasil penelitian ini, ekspresi gen MMP-2 pada
kelompok kontrol positif mengalami penurunan. Hal ini
diduga adanya pengaruh aktivitas pelarut yang digunakan
yaitu metanol dan HCL 6 M terhadap sel kanker. Pelarut
yang digunakan tersebut diduga menyebabkan kondisi
lingkungan menjadi asam sehingga dapat menyebabkan
sel-sel HeLa mati dan jumlah sel dalam sumuran
berkurang sehingga mengakibatkan ekspresi MMP-2
menurun.
SIMPULAN
Berdasarkan hasil diatas, dapat disimpulkan
bahwa dalam penelitian ini ekstrak kasar buah mahkota
dewa dapat menaikkan ekspresi MMP-2 pada sel HeLa.
DAFTAR PUSTAKA
Altaf, R., Asmawi, M.Z.B., Dewa, A., Sadikun, A. &
Umar, M.I. 2013. Phytochemistry and Medical
Properties of Phaleria macrocarpa (Scheff.)
Boerl. Extracts. Pharmacognosy Review, 7(13):
73-80.
Burd, E.M. 2003. Human Papillomavirus and Cervical
Cancer. Clinical Microbiology Reviews. 16 (1):117.
Faried, A., Kurnia, D., Faried, L.S., Usman, N.,
Miyazaki, T., Kato, H. & Kuwano, H. 2007.
Anticancer Effects of Gallic Acid Isolated from
Indonesia Herbal Medicine Phaleriamacrocarpa
(Scheff.) Boerl, on Human Cancer Cell Lines.
International Journal of Oncology, 30: 605-613.
Jhang, L. 2015. Effect of Gallic Acid on EGF-Induced
MMP-9 Expression , Migration and Invasion in
Human Breast Cancer MCF-7 Cells. (online).
(http://etd.lib.nsysu.edu.tw/ETD-db/ETDsearch/view_etd?URN=etd-0607115-102253),
diakses tanggal 3 Desember 2015.
Jiang, P & Yue, Y. 2013. Human Papilloma Virus
Oncoproteins
and
Apoptosis
(Review).
Experimental and Therapeutic Medicine, (7):3-7.
Kaewprag, J., Umnajvijit, W., Jarunya, N. &
Ponglikitmongkol. 2013. HPV 16 Oncoproteins
Promote Cervical Cancer Invasiveness by
Upregulating Specific Matrix Metalloproteinases.
PloS One, (8): e.71611.
Kaur, M., Agarwal, R., Agarwal, C. 2007. Gallic Acid, A
major Active Constituent of Grape Seed Extract,
Induces Apoptotic Death Via The Activation of
p38 MAPK Pathway in Human Prostase
Carcinoma DU145 Cells. Cancer Research, 67:
4967.
Prosiding Seminar Nasional Biologi 2016_ ISBN: 978‐602‐0951‐11‐9
Koshikawa, N., Giannelli, G., Cirulli, V., Miyazaki, K. &
Quaranta, V. 2000. Role of Cell Surface
Metalloprotease MT1-MMP in Epithelial Cell
Migration over Laminin-5. The Journal of Cell
Biology, 148 (7): 615-624.
Koul, H.K., Pal, M. & Koul, S. 2013. Role of p38 MAP
Kinase Signal Transduction in Solid Tumors.
Genes & Cancer, 4 (9-10): 342-59.
Lay, M.M., Karsani, S.A., Banisalam,B., Mohajer, S &
Malek,
S.N.A.
2014.
Antioxidants,
Phytochemicals, and Cytotoxicity Studies on
Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl Seeds.
BioMed Research International, 410184.
Liang, C., Zhang,X., Li,H., Tao.Y., Tao, L., Yang, Z.,
Zhou, X., Shi, Z. & Tao, H. 2012. Gallic Acid
Induces the Apoptosis of Human Osteosarcoma
Cells In Vitro and In Vivo via the Regulation of
Mitogen-Activated Protein Kinase Pathways.
Cancer Biotherapy and Raddiopharmateucals, 27
(10): 701-710.
Livak, K.J & Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of
Relative Gene Expression Data Using Real Time
Quantitative PCR and the 2-ΔΔCt Method.
Methods, (25): 402-408.
Lo,
C., Lai,
T.Y., Yang,
J.S., Yang,
J.H., Ma,
Y.S., Weng, S.W., Lin, H.Y., Chen, H.Y., Lin,
J.G.& Chung, J.G. 2011. Gallic Acid Inhibits The
Migration And Invasion Of A375.S2 Human
Melanoma Cells Through The Inhibition Of
Matrix Metalloproteinase-2 And Ras. Melanoma
Res, 21(4):267-273.
Macdonald, F. & Ford, C.H.J. 1997.Molecular Biology of
Cancer. BIOS Scientific Publishers:UK.
Roy, M., Chakraborty, S., Siddiqi, M. & Bhattacharya,
R.K. 2002. Induction of Apoptosis in Tumor
Cells by Natural Phenolic Compounds. Asian
Pacific Journal of Cancer Prevention, 3: 62-67.
Shin, I., Kim, S., Song, H., Kim, H.C., Moon, A. 2005.
H-Ras-specific Activation of Rac-MKK3/6-p38
Pathway. The Journal of Biological Chemistry,
280 (15): 14675-1683.
Song, C., Zhu, S., Wu, C. & Kang, J. 2013. Histone
Deacetylase (HDAC) 10 Suppresses Cervical
Cancer Metastasis through Inhibition of Matrix
Metalloproteinase (MMP) 2 and 9 Expression. The
Journal of Biological Chemistry, 288 (39): 28021–
28033.
Song, H., Ki, S.H., Kim, S.G. & Moon, A. 2006.
Activating Transcription Factor 2 Mediates Matrix
Metalloproteinase-2 Transcriptional Activation
21
Pengaruh Ekstrak Kasar Buah Mahkota Dewa...
Induced by p38 in Breast Epithelial Cells. Cancer
Res., (21): 10487- 10496.
Spencer, J.V. 2007. Deadly Diseases and Epidemics
Cervical Cancer. Chelsea House Publishers an
Imprint of Infobase Publishing: New York.
Sun, J. 2010. Matrix Metalloproteinases and Tissue
Inhibitor of Metalloproteinases Are Essential for
the Inflammatory Response in Cancer Cells.
Journal of Signal Transduction, (7): 1-7.
Tandrasasmita, O.M., Lee, J.S., Baek, S.H. &
Tjandrawinata, R.R. 2010. Induction of Cellular
Apoptosis In Human Breast Cancer by
DLBS1425, A Phaleria macrocarpa Compound
extract, Via Downregulation of PI3-kinase/AKT
pathway. Cancer Biology & Therapy, 10 (8): 814823.
World Health Organization. 2013. WHO Guidance Note:
Comprehensive cervical cancer prevention and
control: a healthier future for girls and women.
WHO Library Cataloguing-in-Publication Data.
Xu, L., Chen, S. & Bergan R.C. 2006. MAPKAPK2 and
HSP27 are Downstream Effectors Of P38map
Kinase-Mediated Matrix Metalloproteinase Type
2 Activation and Cell Invasion in Human Prostate
Cancer. Nature, (25): 2987-2998.
Yeh, C. & Yen, G. 2006. Involvement of p38 MAPK and
Nrf2 in phenolic acid-induced P-form phenol
sulfotransferase expression in human hepatoma
HepG2 cells. Carcinogenesis. 27 (5): 1008-1017.
Prosiding Seminar Nasional Biologi 2016_ ISBN: 978‐602‐0951‐11‐9
22