(Crotalaria pallida Aiton) terhadap Sel Kanker Payudara MCF-7

Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak dan Fraksi Daun Kuhung-Kuhung
(Crotalaria pallida Aiton) terhadap Sel Kanker Payudara MCF-7
Erlays Melindah Rumondor, Moelyono M.W, dan Melisa I. Barliana
Abstrak: Daun kuhung-kuhung (Crotalaria pallida Aiton) merupakan tumbuhan yang
digunakan secara tradisional oleh etnis bolaang mongondow sebagai antikanker. Penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui aktivitas antiproliferasi dari ekstrak maupun fraksi daun kuhungkuhung pada sel kanker payudara MCF-7. Pengujian aktivitas antiproliferasi dilakukan dengan
metode WST assay menggunakan sel line MCF-7. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
fraksi etil asetat daun C. pallida Ait memiliki nilai IC50 terkecil yakni 29,67 µg/mL.
Berdasarkan hasil tersebut, maka fraksi etil asetat daun kuhung-kuhung terbukti bersifat
antiproliferasi dan bisa dijadikan dasar pengembangan tumbuhan antikanker
Keywoard : Crotalaria pallida, WST assay, cell line MCF-7
Abstract: Kuhung-kuhung leaf (Crotalaria pallida Aiton) is medicinal traditionally used by
ethnic Bolaang Mongondow as anticancer. The purpose of this study was to showed
antiproliferation activity from extract and fraction to human breast cancer cell line MCF-7. The
research using WST-assay method with mammary adenocarcinoma cell line MCF-7. These
results indicate that ethyl acetate fraction of kuhung-kuhung leaf has lower IC50 29,67 value.
Because of the fact that ethyl acetate fraction of kuhung-kuhung leaf contribute to development
anticancer agent.
Kata kunci : Crotalaria pallida, WST assay, cell line MCF-7
terjadi
PENDAHULUAN
Penduduk
berbagai
suku
indonesia
bangsa
terdiri
yang
atas
cara
(Tjindarbumi
and
Mangunkusumo 2002).
BAHAN
tradisional mengenai pengetahuan tumbuhan
serta
wanita
memiliki
keanekaragaman budaya kearifan lokal dan
obat
pada
penggunaan
Bahan
yang
digunakan
dalam
dalam
penelitian ini adalah simplisia daun dan biji
menyembuhkan penyakit sehingga menjadi
kuhung-kuhung (Crotalaria pallida Ait. ),
cikal bakal penemuan obat baru yang berasal
etanol 96%, etil asetat, n-heksana, aquadest,
dari alam (Moelyono, 2014).
kloroform, ammonia,
Dimetil
Sulfoxide
(DMSO),
Mayer,
pereaksi
Kahung-kahung
merupakan
pereaksi
tumbuhan anggota keluarga Leguminosae
Dragendorff, peraksi besi (III) klorida, eter,
marga Crotalaria yang secara empiris
vanilin, asam sulfat pekat, asam asetat
digunakan oleh penduduk Sulawesi Utara
anhidrat, toluen, kalium hidroksida, larutan
sebagai obat kanker. Keluarga Leguminosae
gelatin. Sel uji yang digunakan untuk
dilaporkan memiliki aktivitas sitotoksik
pengujian aktivitas adalah sel kanker serviks
(Khalighi, et al., 2012). Selanjutnya untuk
HeLa dan sel kanker payudara MCF-7
spesies
(Laboratorium Kultur Sel dan Sitogenetik
yang
termasuk
pada
marga
Crotalaria mengandung metabolit sekunder
RSP
yang berpotensi sitotoksik terhadap sel
kultur Roswell Park Memorial (RPMI-160)
kanker (Maioli, et al., 2011) didukung pada
(Sigma), Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco),
penelitian sebelumnya terhadap beberapa
Phospate buffer saline (PBS) (Gibco),
spesies yang memiliki marga Crotalaria
antibiotik (100 U/mL penisilin dan 100
(Srinivas, 2012).
µg/mL streptomisin), larutan pewarna MTT,
Kanker merupakan suatu penyakit
yang hingga saat ini dapat menjadi ancaman
Universitas
Padjadjaran),
medium
kit Water Soluble Tetrazolium (WST-8)
(Dojindo), Sodium Dodecil Sulphate (SDS).
baik dalam bidang kesehatan di dunia
maupun
Indonesia
karena
dapat
METODE EKSTRAKSI
menyebabkan kematian. Berdasarkan data
Bahan segar dikeringkan menjadi simplisia
statistik, kanker payudara dan kanker serviks
kemudian dirajang dan dihaluskan hingga
menjadi jenis kanker yang paling sering
menjadi serbuk simplisa. Simplisia halus
ditempatkan pada wadah untuk diekstraksi
menggunakan metode maserasi yaitu dengan
etanol 96% selama 3 hari (3x24 jam).
PENAPISAN FITOKIMIA
Selanjutnya
maserat
a. Pengujian Golongan Senyawa Alkaloid
pelarutnya
diuapkan
evaporator
sehingga
ditampung
dengan
dan
rotary
Masing-masing bahan simplisia dan
dihasilkan ekstrak
ekstrak dibasahkan dengan menambahkan
kental.
sedikit ammonia, kemudian dimasukkan
FRAKSINASI
dalam mortar lalu digerus dengan stamper
Ekstrak etanol daun dan biji kuhungkuhung difraksinasi cair-cair menggunakan
pelarut dengan kepolaran yang berbeda yaitu
dengan pelarut non polar seperti n-heksan,
sambil ditambahkan kloroform. Selanjutnya
lapisan kloroform diambil dengan cara
dipipet sambil disaring dan dipindahkan ke
pelarut semi polar etil asetat dan pelarut
polar yaitu air. Sejumlah ekstrak ditimbang
dan dilarutkan dalam pelarut n-heksan
dalam corong pisah lalu didiamkan hingga
dalam tabung reaksi. Setelah itu, pada
tabung reaksi yang berisi filtrat ditambahkan
asam klorida 2 N. Campuran dikocok
terjadi pemisahan dan dilakukan secara
berulang hingga mendapatkan lapisan nheksan
yang
bening.
Fraksi
n-heksan
kemudian diambil dan dikumpulkan. Residu
dengan kuat hingga terbentuk 2 lapisan.
Lapisan
asam
dipipet
dan
dipisahkan
menjadi 3 bagian.
yang dihasilkan disimpan untuk dilakukan
fraksinasi untuk pelarut etil asetat. Sejumlah
residu
ditambahkan
etil
asetat
dan
didiamkan untuk didapatkan lapisan etil
1. Bagian pertama digunakan sebagai
blanko
2. Bagian kedua ditambahkan pereaksi
asetat selanjutnya dilakukan berulang hingga
di dapatkan lapisan etil asetat yang bening
kemudian
dipisahkan.
dihasilkan
digunakan
Residu
untuk
yang
fraksinasi
Mayer, amati perubahan yang terjadi.
Apabila terbentuk kekeruhan atau
endapan putih, menunjukkan adanya
pelarut polar yakni air. Residu dikocok dan
didiamkan hingga didapatkan lapisan air
bening.
senyawa golongan alkaloid.
3. Bagian ketiga ditambahkan pereaksi
penangas air, lalu disaring. Filtrat yang
Dragendorff, amati perubahan yang
diperoleh ditambahkan larutan pereaksi besi
terjadi. Bila terbentuk kekeruhan
(III) klorida. Terbentuknya senyawa hijau-
atau endapan berwarna kuning jingga
biru hitam menunjukkan adanya senyawa
menandakan
polifenol dalam sampel (Farnsworth, 1966).
senyawa
adanya
alkaloid
golongan
(Farnsworth,
d. Pengujian Senyawa Kuinon
1966).
Sejumlah kecil bahan dimasukkan
b. Pengujian Senyawa Flavonoid
kedalam
tabung
reaksi,
selanjutnya
Bahan berupa simplisia dan ekstrak
dipanaskan di atas tangas air, lalu disaring.
masing-masing dimasukkan dalam tabung
Tambahkan larutan kalium hidroksida 5%.
reaksi
serbuk
Adanya senyawa kuinon ditunjukkan dengan
magnesium dan asam klorida 2 N. campuran
terbentuknya warna kuning hingga merah
dipanaskan di atas penangas air, lalu
(Farnsworth, 1966).
disaring. Filtrat yang diperoleh dimasukkan
e. Pengujian Senyawa Tanin
lalu
dicampur
dengan
ke tabung reaksi lalu ditambahkan amil
Sejumlah kecil bahan berupa ekstrak
alkohol, lalu dikocok kuat-kuat. Apabila
maupun simplisia masing-masing dalam
terbentuk warna jingga, merah atau kuning
tabung reaksi dipanaskan di atas tangas air,
maka menunjukkan bahwa positif terdapat
lalu disaring. Kedalam filtrat ditambahkan
senyawa flavonoid (Farnsworth, 1966).
larutan gelatin 1%. Jika terbentuk endapan
c. Pengujian Senyawa Polifenol
putih
Sejumlah kecil bahan simplisia dan
ekstrak masing-masing dimasukan ke dalam
tabung
reaksi
lalu
dipanaskan
diatas
menunjukkan
mengandung
golongan
(Farnsworth, 1966).
bahwa
senyawa
bahan
tanin
f. Pengujian Senyawa Monoterpenoid dan
terbentuk cincin merah kecoklatan atau ungu
Seskuiterpenoid
pada batas kedua larutan dan larutan pada
Bahan simplisia dan ekstrak masing-
bagian atas menjadi hijau atau ungu
masing digerus dengan eter, selanjutnya
menunjukkan
dipipet sambil disaring. Filtrat ditempatkan
triterpenoid (Farnsworth, 1966).
dalam
h. Pengujian Senyawa Saponin
cawan
menguap
penguap,
hingga
lalu
dibiarkan
kering.
Hasil
pengeringannya tambahkan larutan vanillin
Bahan
dimasukkan
positif
ekstrak
steroid
dan
masing-masing
atau
simplisia
ke
tabung
reaksi, lalu dicampur dengan air dan
10% dalam asam sulfat pekat. Adanya
warna warna yang terbentuk menunjukkan
adanya
nyawa
monoterpenoid
dan
dipanaskan
beberapa
saat,
kemudian
disaring. Setelah dingin filtrat dalam tabung
reaksi reaksi dikocok kuat selama lebih
kurang 30 detik. Apabila terbentuk busa
seskuiterpenoid (Farnsworth, 1966).
g. Pengujian Senyawa Triterpenoid dan
setinggi lebih kurang 1 cm tinggi dan
persisten selama beberapa menit serta tidak
hilang pada saat penambahan 1tetes asam
Steroid
klorida encer menunjukkan adanya golongan
Bahan
ekstrak
dan
simplisia
senyawa saponin (Farnsworth, 1966).
dimassukkan masing-masing ke tabung
reaksi, lalu ditambahkan sedikit eter dan
dikocok, lalu larutan eter dipipet dan
ditambahkan 0,5 mL asam asetat anhidrat
dan 0,5 mL kloroform lalu dikocok. Larutan
PENGUJIANAKTIVITAS
ANTIPROLIFFERASI TERHADAP SEL
KANKER PAYUDARA
Pengujian antiproliferasi terhadap sel
kanker serviks Hela maupun sel kanker
payudara
MCF-7
dilakukan
dengan
penambahan beberapa variasi konsentrasi
tersebut dimasukkan ke dalam tabung yang
kering. Kemudian melalui dinding tabung
diteteskan 1 mL asam sulfat pekat. Apabila
ekstrak maupun fraksi menggunakan metode
MTT assay dengan menempatkan prosedur
Sel (5 x 104- 5 x 105) dalam 96 lubang plate
well. Setelah itu diinkubasi selama 24 jam.
Selanjutnya, 10 µL WST-8 cell counting
Sulawesi
solution ditambahkan ke dalam masing-
menunjukkan
masing lubang dan diinkubasi selama 3 jam
digunakan dalam penelitian ini adalah
pada suhu 37oC. Reaksi dihentikan dengan
Crotalaria pallida Aiton, marga Crotalaria,
penambahan reagen stopper SDS (100 µl)
suku Fabaceae dan memiliki sinonim
dan akan terlihat reaksi antara sel yang
Crotalaria striata DC.
hidup dengan MTT sehingga akan menjadi
Utara.
Hasil
bahwa
Sebanyak
determinasi
tanaman
1.195,45
yang
gram
daun
warna kuning. Kemudian laju proliferasi sel
kuhung-kuhung dan 2.449,93 gram biji
ditentukan dengan membaca microtiter plate
kuhung-kuhung
reader dan mengukur absorbansi pada
kemudian dimaserasi menggunakan pelarut
panjang gelombang 450 nnm.
etanol 96%. Dalam penelitian ini digunakan
. Selanjutnya, penentuan tingkat
inhibisi proliferasi sel dtentukan dengan
yang
sudah
dirajang
pelarut etanol, karena etanol merupakan
pelarut
universal
yang
dapat
menarik
metabolit sekunder baik yang bersifat polar,
rumus :
% inhibisi =
semi polar maupun non polar. Proses
Absorban blanko−Absorban sampel
maserasi
dilakukan
selama
3x24
jam.
absorban blanko
Maserat
X 100 %
yang
ditampung
dan
menggunakan
HASIL DAN PEMBAHASAN
EKSTRAKSI, FRAKSINASI DAN
PENAPISAN FITOKIMIA
Simplisia daun dan biji kuhungkuhung (Crotalaria pallida Aiton) diperoleh
dari Langowan Timur Kabupaten Minahasa,
diperoleh
rotary
kemudian
diuapkan
vaporator
dengan
untuk
menguapkan pelarut dibawah titik didihnya
sehingga zat yang terkandung di dalam
pelarut tidak rusak oleh suhu tinggi agar
mendapatkan ekstrak kental. Berat ekstrak
kental total daun kuhung-kuhung diperoleh
sebanyak 57 gram dan untuk biji kuhungkuhung 42 gram.
Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak dan Fraksi C. pallida Ait.
Sampel
No Gol Senyawa
Fraksi
Fraksi Daun
Biji
n-h ea air n-h ea air
1
2
3
4
5
6
7
8
+
+
+
-
Ket :
Alkaloid-Dragendorf
Flavonoid
Saponin
Triterpenoid
Steroid
Fenol
Monoterpen
Seskuiterpen
n-h
ea
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Ekstrak Ekstrak
Biji
Daun
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
: n-heksana
: etil asetat
Hasil uji antiproliperasi ekstrak dan fraksi C. pallida Ait.
Zat uji
8
Ekstrak etanol daun kuhung-kuhung
0
Fraksi N- heksan daun kuhung-kuhung 0
Fraksi Etil asetat daun kuhung-kuhung 0
Fraksi air daun kuhung-kuhung
0
Ekstrak etanol biji kuhung-kuhung
12
Fraksi N- heksan biji kuhung-kuhung
0
Fraksi Etil asetat biji kuhung-kuhung
1
Fraksi air biji kuhung-kuhung
0
16
8
6
16
0
18
0
22
0
31
33
27
54
0
29
49
40
0
Konsentrasi
63 125 250
54 86 85
44 53 77
79 89 86
0 18 65
46 28 35
57 84 89
65 52 68
0 0 0
500
84
86
83
85
57
88
86
0
1000
80
84
77
82
84
89
88
0
IC50
(µg/mL)
56.7
107.1
29,67
>200
>200
35.71
44.25
-
% Penghambatan Proliferasi Sel
Antiproliferasi ekstrak etanol, fraksi etil asetat, n-heksan dan air daun kuhung-kuhung terhadap
sel kanker payudara MCF-7
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
200
400
600
Konsentrasi (µg/ml)
ekstrak etanol
etil asetat
800
n-heksan
1000
1200
air
% Penghambatan Proliferasi Sel
Antiproliferasi ekstrak etanol, fraksi etil asetat, n-heksan dan air biji kuhung-kuhung terhadap sel
kanker payudara MCF-7.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
200
400
600
Ekstrak etanol
Konsentrasi (µg/ml
etil asetat
800
n-heksan
1000
air
1200
Telah dilakukan pengujian aktivitas
payudara MCF-7 dengan nilai IC50 terkecil
antiproliferasi ekstrak dan fraksi dari daun
29,67 µg/mL oleh fraksi etil asetat daun
kuhung-kuhung (Crotalaria pallida Aiton)
diikuti oleh fraksi n-heksan biji, fraksi etil
dengan metode MTT assay terhadap sel
asetat biji dan ekstrak etanol daun yang
kanker payudara MCF-7.
memiliki IC50 berturut-turut 32.1 µg/mL,
Kanker payudara dan kanker serviks
44.25 µg/mL dan 56.7 µg/mL. Fraksi n
merupakan 2 jenis kanker yang paling sering
heksan daun, fraksi etil asetat daun dan biji
menyebabkan kematian pada wanita. Pada
memiliki nilai IC50 107,14 µg/mL terhadap
penelitian ini dilakukan uji antiproliferasi
sel kanker payudara MCF-7, 170,83 µg/mL
dari daun maupun biji kuhung-kuhung
sedangkan ekstrak etanol biji, fraksi air daun
(Crotalaria paliida Aiton) terhadap sel
dan
kanker payudara MCF-7. Hasil WST assay
penghambatan
menunjukkan bahwa ekstrak maupun fraksi
kanker payudara MCF-7.
biji
tidak
dapat
proliferasi
memberikan
terhadap
sel
C. pallida Ait menghambat sel kanker
sedangkan ekstrak etanol biji, fraksi air daun
dan biji tidak berpotensi antiproliferatif baik
KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah
terhadap MCF-7.
dilakukan maka dapat disimpulkan sebagai
berikut :
1. Daun dan biji C. pallida Ait. mempunyai
DAFTAR PUSTAKA
aktivitas antiproliferatif terhadap sel kanker
payudara MCF-7.
2. Fraksi etil asetat daun, fraksi n-heksan
biji, fraksi etil asetat biji dan ekstrak etanol
daun berpotensi kuat dalam menghambat
proliferasi sel kanker payudara MCF-7
dengan nilai IC50 berturut-turut
29,67
µg/mL, 32.1 µg/mL, 44.25 µg/mL dan 56.7
µg/mL. Fraksi n heksan daun, fraksi etil
asetat daun dan biji berpotensi sedang
dengan IC50 107,14 µg/mL terhadap MCF-7,
Boldrin, P. K., Resende, F. A., Höhne, A. P.,
de Camargo, M. S., Espanha, L. G.,
Nogueira, C. H., and Varanda, E. A.
2013. Estrogenic and mutagenic
activities of Crotalaria pallida
measured by recombinant yeast
assay
and
Ames
test. BMC
complementary
and
alternative
medicine, 13(1):216.
Farnsworth, N.R. 1966. Biological and
Phytochemical Screening of Plants.
J. pharm Sci (3): 243-269
Khalighi-Sigaroodi, F., Ahvazi, M.,
Hadjiakhoondi, A., Taghizadeh, M.,
Yazdani, D., Khalighi-Sigaroodi, S.,
and Bidel, S. 2012. Cytotoxicity and
antioxidant activity of 23 plant
species of Leguminosae family.
IJPR, 11(1) : 295-302
Maioli, M. A., Alves, L. C., Perandin, D.,
Garcia, A. F., Pereira, F. T., and
Mingatto, F. E. (2011). Cytotoxicity
of monocrotaline in isolated rat
hepatocytes: Effects of dithiothreitol
and fructose. Toxicon, 57(7), 10571064.
Moelyono, MW. 2014. Etnofarmasi.
Yogyakarta : Deepublish.208-213
Srinivas, N., Sandeep, K. S., Anusha, Y.,
and Devendra, B. N. 2014. In vitro
Cytotoxic
Evaluation
and
Detoxification of Monocrotaline
(Mct) Alkaloid: An in silico
approach. International
Invention
Journal of Biochemistry and
Bioinformatics, 2(3), 20-29.
Subarnas, A., Diantini A, Abdullah R,
Zuhrotun A, et al 2015. Apoptosis
induced in MCF-7 Human breast
cancer cells by 2,4-dihydroxy-6methoxy-3,5-dimethylchalcone
isolated from Eugenia aquea Burn F.
Leaves. Oncology Letters
Tjindarbumi, D. and Mangunkusumo R.
2002. Cancer in Indonesia, Present
and Future. Jpn J Clin Oncol 32:1721