REKAYASA GENETIKA Genetika

REKAYASA
GENETIKA
Sukarti Moeljopawiro
Laboratorium Biokimia
Fakultas Biologi
Universitas Gadjah Mada
Rekayasa
Genetika
REKAYASA GENETIKA
Teknik untuk menghasilkan molekul
DNA yang berisi gen baru yang
diinginkan/kombinasi gen-gen baru
atau dapat dikatakan manipulasi
organisme
ILMU YANG MENDUKUNG UNTUK DAPAT
MELAKUKAN DAN MEMANFAATKAN
REKAYASA GENETIKA





Fisiologi mikrobia
Genetika molekular
Biokimia
Biokimia genetik
Ilmu pendukung yang lain:
 Kultur jaringan
 Fusi sel
 Bioreaktor
TAHAP PENTING PERKEMBANGAN
BIOTEKNOLOGI MODERN
1944
1953
1961
1968
1973
1977






DNA pembawa informasi genetik
struktur DNA
kodon
ditemukan enzim endonuklease restriksi
teknik kombinasi gen berhasil dilakukan
hormon tumbuh diproduksi di bakteri dengan
teknik rekombinasi DNA
gen untuk insulin diperbanyak
Humulin mulai dijual
Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR dipublikasikan
1978
1982
1983
1985
1990
1990
2000




 Human Genom Project
 terapi gen pertama kali diaplikasikan
 Human Genom Project selesai
DOGMA SENTRAL BIOLOGI
DNA
Replikasi
Transkripsi
Transkripsi Balik
RNA
Translasi
Protein
KROMOSOM – DNA
DNA
ENZIM RESTRIKSI
 Ada 3 macam enzim restriksi, yaitu:
Tipe I, II dan III
 Masing-masing mempunyai spesifisitas
tempat pemotongan
 Tipe II memotong pada urutan basa
pengenal
 Enzim yang banyak digunakan dalam DNA
rekombinan
 Nama terdiri dari 3 singkatan spesies
bakteri:
 BamH I: Bacillus amyloliquefaciens H
 EcoR I: Escherichia coli RY13
SINGKATAN
URUTAN
PENGENAL
BamH I
*
GGATCC
CCTAGG
Bal I
TGGCCA
ACCGGT
Escherichia coli RY13
EcoR I
*
GAATTC
CTTAAG
Haemophilus aeqyptius
Hae III
Haemophilus influenzae Rd
Hind III
AAGCTT
TTCGAA
Hpa II
GTTAAC
CAATTG
SUMBER ENZIM
Bacillus amyloliquefaciens H
Brevibacterium albidum
Haemophilus parainfluenzae
*
*
*
GGCC
CCGG
*
LANGKAH – LANGKAH MEMBUAT DNA
REKOMBINAN
1. Isolasi sumber DNA yang diinginkan :
 DNA dari total genomic
 Dibuat dari mRNA yaitu cDNA
 Dibuat secara in vitro
2. Pemotongan gen yang diinginkan
 Bila hasil pemotongan ujungnya tumpul pada ujung
perlu ditambahkan Fragmen DNA :
 Ekor homopolimer
 Linker
 Adaptor
3. Menyisipkan gen yang diinginkan ke alat pembawa
“vektor”



Plasmid : materi gen ekstrakromosomal
Bacteriophage : virus bakteri
Cosmid : gabungan “cohesive ends” bacteriophage
lambda dan plasmid
LANGKAH – LANGKAH MEMBUAT
DNA REKOMBINAN (lanjt.)
4. Memasukkan DNA Rekombinan ke sel
inang
 Transformasi
 DNA-packaging
 Mikroinjection
5. Menyeleksi clone
 Genetik
 Hibridisasi asam nukleat
LANGKAH –
LANGKAH
MEMBUAT
DNA
REKOMBINAN
ISOLASI SUMBER DNA
PENYISIPAN
DNA
CARA INTRODUKSI DNA
 Transformasi
E.coli dapat menyerap DNA
bakteriophage maupun DNA plasmid
dengan perlakuan CaCl3, diikuti
perlakuan suhu.
 Transfeksi
Sama dengan transformasi, bedanya
yang masuk bukan plasmid tetapi DNAphage atau virus. Masuknya DNA
diinduksi dengan heat shock.
CARA INTRODUKSI DNA (lanjt.)
 DNA- packaging
Masuknya molekul DNA-phage lebih
efisien apabila dikemas di dalam partikel
phage daripada transfeksi.
 Microinjection
Dengan memakai jarum super kecil
menginjeksikan DNA secara langsung ke
inti sel yang ditransformasi.
SELEKSI
CLONE
SYARAT VEKTOR UNTUK TRANSFER GEN
1. Harus berukuran kecil
2. Melangsungkan independen replikasi
(replikasi sendiri)
3. Berisi sisi pengenal tunggal untuk satu
atau lebih enzim restriksi pada tempat
yang tidak esensial unruk replikasi
4. Memiliki gen untuk resistensi terhadap
antibiotik
5. Tidak mengganggu metabolisme dan
merusak gen dalam sel target
6. Mampu memindahkan secara efisien
PLASMID
pBR 322
CLONING VECTORS
VECTOR
AVARAGE INSERT SIZE
(BP)
Plasmid
4.000
Lambda
20.000
Cosmid
40.000
Yeast Artificial
Chromosome (YAC)
400.000
JENIS VECTOR
1. VIRAL VECTOR
Retrovirus
Adenovirus
Adeno Ass. Virus
Herpes virus
Hepatitis virus
2. NON- VIRAL VECTOR
JENIS VECTOR (lanjt.)
RETROVIRUS :
Mampu menginfeksi
bermacam – macam sel
target
Tidak merusak sel yang
diinfeksi
SYARAT SEL INANG YANG BAIK
1. Cepat tumbuh
2. Mampu tumbuh pada medium kultur
yang murah
3. Tidak pathogenik
4. Stabil dalam kultur
Sel inang yang banyak digunakan
untuk mempelajari cloning :
E.coli, Bacillus subtilis,
Saccharomyces cerevicae
KEBERHASILAN REKAYASA
GENETIKA
 Keberhasilan Rekayasa Genetika
tergantung pada :
 Kemurnian DNA
 Bersih dari “DNA-ase”
 Kemampuan penguasaan teknik
rekombinan
 Kriteria keberhasilan :
Bila gen asing yang di “clone” dapat
berekspresi dengan baik dan stabil
Terima Kasih