Untranslated Region Thymidylate Synthase Gene in Orbital Region

Ophthalmol Ina 2015;41(3):311-315
311
Laboratory Science
Identiication Insertion/Deletion 6bp of 3’-Untranslated
Region Thymidylate Synthase Gene in Orbital Region
Basal Cell Carcinoma
Lady Kavotiner, Ibrahim, Irsan Saleh
Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Sriwijaya University
Mohammad Hoesin Hospital, Palembang, South Sumatera
ABSTRACT
Background: Basal cell carcinoma (BCC) is the most common eyelid malignancy tumor. The risk
factor for development of BCC related to environtmental factor especially prolonged sun exposure and
individual factor. One of the internal risk factor contributes to BCC development is genetic instability
including defects in folic acid synthesis or DNA synthesis. Enzyme participates in this process is
3’-untranslated region Thymidylate synthase gene (UTR TS). This study is to identify the insertion or
deletion of 6bp of 3’-UTR TS gene in orbital region BCC.
Methods: This study was a descriptive explorative study with case series which involved 13 orbital
region basal cell carcinoma (BCC). The diagnosis was based on histological examination of the
tumor. The frequencies of insertion/deletion 6bp of 3’-UTR TS gene were assessed by Polymerase
Chain Reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses using Dra I as
restriction enzyme.
Results: Thirteen patients consist of 9 males (69%) and 4 females (31%). Majority of subjects have
history of sun exposure. The most common type of BCC is nodular type (80%). There was two subject
with recurrent case. Identiication result of insertion/deletion 6bp 3’-UTR TS gene found heterozigot
mutant -6bp/+6bp in 7 samples (54%) at 152bp band and 158 bp band, homozigot mutant -6bp/-6bp in
6 samples (46%) at 152bp band.
Conclusion: The results of this study were 7 samples (54%) are heterozigot mutant -6bp/+6bp and 6
sample (46%) are homozigot mutant -6bp/-6bp.
Karsinoma sel basal (KSB) adalah tumor ganas
terbanyak pada palpebra, sekitar 90% dari semua
keganasan pada palpebra. KSB sering berlokasi di
palpebra inferior (50-60%), dekat dengan kantus
media (25-30%), palpebra superior (15%) dan
kantus lateral (5%). Faktor resiko utama KSB
adalah paparan sinar matahari khususnya UVB,
kulit terang, bermata biru, rambut pirang dan
usia. KSB berasal dari lapisan basal epidermis
atau sel basaloid pluripotent pada adneksa dan
banyak terlihat pada daerah tubuh yang sering
terpapar sinar matahari dan daerah berambut.
Metastasis pada KSB jarang terjadi, namun
destruksi lokal dan kerusakan jaringan sering
terjadi. KSB biasanya terlihat datar, meninggi,
kemerahan, translusen, mengkilat dengan
ukuran tumor dapat bervariasi. Frekuensi KSB
meningkat pada negara berkembang, sekitar
1.000.000 kasus baru didiagnosa setiap tahunnya
dan lebih dari 10.000 kematian (2% dari seluruh
kematian akibat kanker).1-4
312
KSB dapat terjadi pada semua jenis kulit
namun pada populasi kulit gelap lebih jarang
terjadi dibanding dengan kulit terang. Pada
populasi kulit putih, KSB terdapat sekitar
95%dari seluruh kanker kulit. KSB pada
palpebra biasanya terjadi pada dekade 6 sampai
8, tetapi 15% bisa terjadi pada umur yang lebih
muda. Pada penelitian yang dilakukan di RSMH
Palembang, ditemukan peningkatan insidensi
KSB sebanyak 0,30% sejak tahun 2000.
Jenis kelamin pada laki-laki lebih sering 3080% dibandingkan perempuan, kemungkinan
disebabkan faktor pekerjaan yang lebih banyak
terkena paparan sinar matahari. Lebih dari 96%
individu yang terkena berusia diatas 40 tahun.5-7
Faktor resiko interna yang dianggap
berperan dalam berkembangnya karsinoma sel
basal adalah adanya faktor genetik yaitu gen
yang berlokasi pada kromosom 9q22.3-q31 yang
meliputi mutasi dalam repair gen, defek dalam
sintesis asam folat atau sintesis DNA. Mutasi
akan menyebabkan beberapa faktor genetik
yang mengubah sintesis folat yang rendah dalam
serum, hal ini mendukung bahwa fotolisis juga
terjadi secara in vivo. Diketahui juga bahwa
metabolisme folat terlibat dalam sintesis dan
repair DNA. Beberapa penelitian mendapatkan
bahwa folat dapat mencegah berkembangnya
beberapa kanker, peran ini disebabkan karena
fungsinya dalam sintesis timidilat dan purin de
novo dan produksi 5-adenosilmetionin, suatu
donor grup metil.7-11
Salah satu enzim yang berperan sebagai
ko-faktor pada metabolism asam folat dan
sintesis DNA yaitu Thymidylate synthase
(TS atau TYMS). TS berlokasi pada rantai
pendek kromosom 18 yaitu suatu enzim yang
bertanggung jawab pada transformasi dari
dUMP (deoxyuridine monophosphate) menjadi
dTMP (thymidine monophosphate), fungsi
protein, dan kapasitas repair kerusakan DNA
yang akan merangsang efek karsinogenik.
Terdapat dua polimorisme TS yaitu TS 5’untranslated enhanced region (TSER) dan
insersi/delesi 6bp 3’-untranslated region TS (TS
3’-UTR) yang dianggap mempunyai hubungan
dengan terjadinya resiko kanker. Insersi/delesi
6bp 3’-UTR gen TS terdapat pada posisi
1494 yang berperan pada proses translasi dan
Ophthalmol Ina 2015;41(3):311-315
stabilitas mRNA. Bagian yang tidak terubah
pada TS diketahui berperan penting pada
transkripsi dan translokasi.12-18 Mutasi pada
gen TS mengakibatkan akumulasi homocystein,
penurunan sintesis methionin dan penurunan
kadar TS mengakibatkan defek pada sintesis
dTMP. Hal ini menghasilkan delesi single atau
double strand melalui misincorporation urasil.
Thymidylate sebagai nukleotida yang berperan
pada sintesis dan repair DNA yang seharusnya
ada untuk meminimalisir misincorporation
urasil menjadi DNA, pemecahan kromosom.18-26
Pada penelitian sebelumnya memperlihatkan hubungan polimorisme 3’-UTR gen
TS dengan resiko terjadinya KSB, yaitu oleh
Sang Yoon Kang, bahwa genotip 6bp/6 bp pada
insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS berperan
pada peningkatan resiko terjadinya KSB. Pada
penelitin oleh Xiangjun Zhai ditemukan bahwa
insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS berkontribusi
terhadap terjadinya resiko kanker.17,24,25
Penelitian ini untuk mencari frekuensi
insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS pada penderita
KSB regio orbita belum pernah diteliti sebelumnya,
mengingat bahwa KSB lebih beresiko pada area
yang banyak terpapar sinar matahari (sebagai
faktor resiko utama) yaitu head dan neck, oleh
karena itu peneliti tertarik melakukan penelitian
untuk mencari insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen
TS pada KSB regio orbita di Rumah Sakit Dr.
Mohammad Hoesin Palembang.
MATERIAL DAN METODE
Penelitian ini merupakan suatu case study yang
bersifat observasional eksploratif untuk menganalisis pengaruh insersi/delesi 6bp 3’-UTR
gen TS pada karsinoma sel basal regio orbita.
Penelitian dilakukan di Poliklinik Subdivisi
Tumor Departemen Mata, Poliklinik IK
Kulit dan Kelamin FK UNSRI/Rumah Sakit
Dr. Mohammad Hoesin (RSMH), Poliklinik
Mata rumah sakit jejaring dan Laboratorium
Mikrobiologi dan Bioteknologi FK UNSRI/
RSMH dalam kurun waktu pelaksanaan dimulai
bulan Juni 2013 sampai dengan November
2013. Populasi target adalah semua penduduk
Sumatera Selatan. Populasi terjangkau pada
penelitian ini adalah semua penderita karsinoma
Ophthalmol Ina 2015;41(3):311-315
sel basal regio orbita yang berobat ke Rumah
Sakit Dr. Mohammad Hoesin Palembang.
Sampel pada penelitian ini diambil dari
penelitian tandem yang sudah diambil darahnya
dan sampel baru yang diambil sampai November
2013. Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah:
1) semua penderita BCC regio orbita yang berobat
ke Poliklinik Mata Subdivisi Tumor RSMH
dalam kurun waktu Juni 2013 sampai 2013 yang
dikonirmasi dengan pemeriksaan biopsi atau
histopatologi; 2) penderita dengan pekerjaan yang
mempunyai risiko terpapar sinar matahari 6-8
jam/hari atau dari jam 10 pagi sampai jam 4 sore,
seperti petani, buruh, nelayan, dan sebagainya;
3) seluruh penduduk etnik asli Indonesia yang
berasal dari suku-suku asli, seperti Melayu,
Sunda, Jawa, Dayak, dan lainnya; dan 4) bersedia
mengikuti penelitian yang dinyatakan dengan
menandatangani informed consent.
Pengukuran frekuensi insersi/delesi 6bp
3’-UTR gen TS pada penelitian ini menggunakan
teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)-RFLP
(restriction fragment length polymorphism). Alat
PCR yang digunakan pada penelitian ini adalah
DNA thermal Cycler merk I-cycle produksi
Biorad® USA. Kit elektro-foresis yang digunakan
adalah merk Power Pac Basic produksi Biorad®
dan alat sentrifuse merk Biofuge Prim. Untuk
deteksi produk PCR dan RFLP digunakan alat
elektroforesis gel agarose (4%) selama 60 menit
serta alat visualisasi hasil PCR yaitu Geldoc
produksi Biorad® dengan ultraviolet pada panjang
gelombang 300 nm yang dihubungkan dengan
kamera digital dan perangkat komputer yag berisi
software Quantity One. Cara untuk mendeteksinya
yaitu dengan isolasi DNA dengan menggunakan
enzim Dra I pada suhu 370C selama satu jam dan
kemudian fragmen dipisahkan dengan elektroforesis
pada 4% gel agarosa, yang dibatasi oleh Primer 1
(sense) 5’-CAAATCTGAGGGAGCTGAGT-3’
dan Primer 2 (antisense) 5’-CAGATAAGTGGCAGTACAGA-3’.
Frekuensi insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen
TS yang terdapat pada PCR, akan dihitung dan
di catat berapa ins/del yang muncul yaitu: 1)
genotip +6bp/+6bp, yang berada pada 158 bp;
2) genotip -6bp/-6bp, yang berada pada 152 bp;
dan 3) genotip +6bp/-6bp, yang berada pada 158
bp dan 152 bp.
313
Dilakukan pengambilan sampel darah untuk
ekstraksi DNA. Sampel darah diambil melalui
punksi vena antecubiti sebanyak 2 cc. Sebelum
punksi dilakukan tindakan antiseptik dengan
alkohol pad. Sampel darah ini dimasukkan ke
tabung reaksi yang mengandung Ethylen Diamine
Tetra Acetic (EDTA) lalu disimpan pada suhu
maksimal 4o sampai pemeriksaan Polymerase
Chain Reaction (PCR) dilakukan. Ekstraksi
(isolasi) DNA dari darah vena subjek yang telah
dicampur dengan antikoagulan ethylene diamine
tetraacetic acid (EDTA) dilakukan dengan
metode Chelex-100. Ekstraksi dilakukan sesuai
dengan prosedur standar. Isolate yang diperoleh
disimpan dalam kulkas pendingin dengan suhu
-200 hingga -700C.
Data responden dicatat dalam suatu formulir
data yang telah disiapkan, kemudian disusun dalam
suatu tabel induk dengan menggunakan program
Microsoft Word for Windows. Data dianalisis secara
univariat berupa frekuensi insersi/delesi 6bp 3’UTR gen TS pada karsinoma sel basal regio orbita.
HASIL
Pada penelitian ini didapatkan subjek penelitian
sebanyak 13 orang, jenis kelamin pria adalah
sebanyak 9 orang (69%) dan wanita sebanyak
4 orang (31%). Sedangkan usia penderita
karsinoma sel basal regio orbita adalah berkisar
antara usia 47 hingga 77 tahun. Tingkat
pendidikan pada penelitian ini adalah SD yaitu
sebanyak 9 orang, sedangkan SMP 3 orang dan
SMA 1 orang. Distribusi pekerjaan pada subjek
penelitian ini yaitu petani 8 orang (62%), buruh
2 orang (15%) dan pedagang 1 orang (8%), dan
ibu rumah tangga 2 orang (2%) yang mempunyai
riwayat pekerjaan dahulu sebagai petani.
Tidak ada penderita yang memiliki riwayat
penyakit yang sama dalam keluarga. Semua
penderita memiliki riwayat terpapar sinar matahari
yang lama, Pada penelitian lain didapatkan tidak
ada perbedaan yang bermakna terjadinya KSB
pada jenis kelamin laki-laki dan perempuan.
Tipe karsinoma sel basal yang tersering pada
penelitian ini adalah tipe nodular yaitu sebanyak
84%, sedangkan sisanya adalah tipe campuran
iniltrating-nodular (8%) dan adenoid kistik
(8%). Terdapat dua kasus pada penelitian ini
yang mengalami rekurensi dan tidak satupun
314
penderita mengalami pembesaran kelenjar getah
bening.
Pada penelitian ini mengidentiikasi insersi/
delesi 6bp 3’-UTR gen TS dengan menggunakan
metode Polymerase Chain Reaction – Restriction
Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP).
Adanya produk PCR dideteksi menggunakan
elektroforesis, diwarnai dengan ethium bromide
dan pita DNA divisualisasi dengan transluminator
ultraviolet. Hasil PCR (amplicon) gen TS pada
152 bp dan 158 bp (gambar 1). Untuk mendeteksi
insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS digunakan enzim
retriksi Dra I. Pada penelitian ini didapatkan
visualisasi base pair seperti yang terlihat pada
gambar 2.
Gambar 1. Hasil PCR gen TS pada 152 bp dan 158 bp
Gambar 2. Hasil visualisasi produk PCR-RFLP pada
penderita setelah direstriksi menggunakan enzim Dra I.
Genotip -6p/+6bp terdapat pada pita 158 bp dan 152 bp,
sedangkan -6bp/-6bp terdapat pada pita 152 bp.
DISKUSI
Penelitian ini merupakan suatu penelitian case
study dengan rancangan deskriptif eksploratif
yang digunakan untuk menganalisis pengaruh
Ophthalmol Ina 2015;41(3):311-315
insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS pada penderita
karsinoma basal sel regio orbita. Populasi pada
penelitian ini adalah semua penderita KSB yang
berobat ke Poliklinik Mata Subdivisi Tumor
RSMH Palembang pada kurun waktu bulan JuniNovember 2013. Dari hasil penelitian didapatkan
sebaran usia penderita yang berjumlah 13 orang
adalah 47 hingga 77 tahun, dengan usia rata-rata
adalah 62 tahun. Penelitian Gloster mendapatkan
bahwa KSB paling sering mengenai populasi yang
berusia di atas 50 tahun dengan riwayat paparan
sinar matahari yang lama. Claudia Moteoiu dkk
melaporkan bahwa KSB biasanya terjadi pada
usia 51-70 tahun (49,92%).3,7
Tipe karsinoma sel basal yang terbanyak
yang diderita adalah tipe nodular yaitu sebesar
85%, sisanya adalah tipe campuran. Penelitian
Vantuchoya mengenai tipe histologi KSB,
didapatkan bahwa tipe nodular adalah yang paling
sering dan paling beresiko rendah terjadinya
metastasis. Dari tiga belas kasus pada penelitian
ini, dua kasus merupakan kasus rekuren dengan
hasil histopatologi tipe nodular. KSB regio orbita
mempunyai resiko terjadi rekurensi lebih besar
dari KSB pada kulit bagian lain. Faktor resiko KSB
regio orbita untuk terjadinya rekurensi adalah
tumor rekuren sebelumnya, lesi besar >2cm,
lokasi di kantus medial atau palpebra inferior,
keterlibatan segmen palpebra yang multipel,
riwayat terapi radiasi sebelumnya, riwayat eksisi
yang inkomplit, kondisi imunosupresi pasien
sendiri, usia kurang dari 35 tahun, invasi ke tarsus
dan perluasan ke orbita, hidung, sinus atau sistem
syaraf.6,11
Dari penelitian ini tidak didapatkan adanya
pembesaran kelenjar getah bening maupun
metastase KSB pada semua subjek penelitan.
KSB tumbuh secara lambat, jarang bermetastase
namun menginvasi jaringan. Dilaporkan bahwa
karsinoma sel basal metastase berkisar antara
0,028% hingga 0,5%. Metastase biasanya pada
kelenjar getah bening, paru-paru, dan tulang
namun hal ini jarang terjadi.13
Pada penelitian ini, dilakukan analisis PCR
gen TS dan didapatkan bahwa jumlah genotip
heterozigot tipe mutan adalah sebesar 7 sampel
(54%), dan 6 genotip homozigot (46%). Hal
ini tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian
sebelumnya.17 Pada penelitian Sang Yoon Kang
dkk, didapatkan bahwa visualisasi 3’-UTR gen
Ophthalmol Ina 2015;41(3):311-315
TS pada 100 pasien KSB di Korea ditemukan
genotip homozigot dengan adjusted odds ratio
(AOR) sebanyak 7,539 dan genotip heterozigot
dengan AOR: 2,821. Dari penelitian case-control
yang dilakukan oleh Sang Yoon Kang dkk yang
mengikutsertakan 100 pasien KSB. Didapatkan
bahwa pada kelompok kasus homozigot 6bp/6bp
(AOR: 7,539) dan heterozigot 0bp/6bp (AOR:
2,821) dan kombinasi mutasi heterozigot dan
homozigot 0bp/6bp+6bp/6bp (AOR: 3,079).
Didapatkan bahwa terdapat hubungan antara
insersi/delesi 6bp 3’-UTR gen TS terhadap
resiko terjadinya karsinoma sel basal.17,21
315
9.
10.
11.
12.
13.
14.
KESIMPULAN
Telah dilakukan analisis PCR gen TS pada 13
pasien KSB dan pada hasil akhir elektroforesis
didapatkan hasil yang tidak jauh berbeda dengan
penelitian sebelumnya yaitu terdapatnya insersi/
delesi 6bp 3’-UTR gen TS pada pasien KSB,
yaitu genotip heterozigot tipe mutan (-6bp/+6bp)
sebanyak 7 sampel dan homozigot tipe mutan
(-6bp/-6bp) sebanyak 6 sampel.
Keterbatasan penelitian ini adalah jumlah
sampel yang masih minim, tidak adanya kelompok
kontrol untuk membandingkan perbedaan dengan
individu normal sehingga belum dapat ditarik
suatu kesimpulan adanya peranan insersi/delesi
6bp 3’-UTR gen Thymidylate synthase terhadap
kejadian karsinoma sel basal regio orbita.
REFERENSI
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
G. Sánchez,J. Nova,F. de la Hoz. Risk Factors for Basal Cell
Carcinoma: A Study From the National Dermatology Center
of Colombia. Actas Dermosiiliogr. 2012;103:294-300.
Lear W, Dahlke E, Murray CA.Basal cell carcinoma: review
of epidemiology, pathogenesis, and associated risk factors.
J Cutan Med Surg. 11(1):19-30, 2007.
Yahya YF dkk, Proil Karsinoma Sel Basal Primer di RSUP
M. Hoesin Palembang, (MDVI 2011; 38/2:78-83).
Kim GK, Rossa JQ, Bellew S, Skin Cancer in Asia, Clinical
aesthetic dermatology, 2009, 2, 39-42.
Suriadiredja AS, Editorial Epidemiologi Kanker Kulit,
Departemen IK Kulit dan Kelamin FKUI/RSUPN dr.Cipto
Mangunkusumo.
Claudia Mateoui, Claudia-Valentina Georgescu. Cristina
Simionescu. Histopathological study of Basal Cell Carcinoma.
Current Health Science Journal. 2009. Vol.35, No.2.
Cheng-Hsien Chang, Sheng-Ming Chang, Yu-Hung Lai, Jason
Huang. Eyelid Tumors in Southern Taiwan: A 5-year Survey from
a Medical University. Kaohsiung J Med Sci 2003;19:549–54
N.R.Telfer, G.B.Colver andP.W.Bowers. Guidelines for
the management of basal cell carcinoma. British Journal of
Dermatology 1999; 141: 415-423.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
Lacour JP. Carcinogenesis of basal cell carcinomas:genetics
and molecular mechansisms. Br J Dermatol 2002;146(Suppl
61):17–19.
Vantuchoya Y, Curik R, histological types of basal cell
carcinoma, Scripta Medica, 79 (5-6), 261-270, 2006.
Leffel DJ, Headington JT, Wong DS et al. Aggressive
growth basal cell carcinoma in young adult. Arch Drmatol
1991, 127: 1663-1667.
Joshua M. Berlin, MD, Michael R. Warner, MD, and Philip
L. Bailin, MD. Metastatic Basal Cell Carcinoma Presenting as
Unilateral Axillary Lymphadenopathy: Report of a Case and
Review of the Literature. Dermatol Surg 2002;28:1082–1084.
Recep Bedir, Rustu Kose, Hasan gucer, Nursel dilek.
Nodular Basal Cell Carcinoma in non exposed skin: a case
report. Egyptian Dermatology online journal. Vol.7 No. 2:9,
Desember 2011
Tilli CML, Steensel MAM, et al in Molecular aetiology
and pathogenesis of basal cell carcinoma British Journal of
dermatology, 152, 1108 – 1124,2005
Kim Y I. cancer Epidemiology Biomarker. Prev. 2004,
13,511-519
Sang Yoon Kang, sung Jun Lee, Seung Ho Hong et al.
Polymorphisms of 5,10-methylenetetrahydrofolatereductase
and thymydilate synthase in squamous Cell Carcinoma
and Basal Cell Carcinoma of the skin.Molecular Medicine
Reports,2010. Vol 3:741-747
Sanjay Agarwalla, Sherry LaPorte, Lu Liu, Janet FinerMoore, Robert M. Stroud, and Daniel V. Santi. A Novel
dCMP Methylase by Engineering Thymidylate Synthase.
Biochemistry 1997, 36, 15909-15917
Goto Y, Yue L, Yokoi A, Nishimura R, Uehara T, Koizumi
S and Saikawa Y: A novel single-nucleotide polymorphism
in 3’-Untranslated region of the human dihydrofolate
reductase gene with enhanced expression. Clin Cancer Res
7:1952-1956, 2001
Mandola MV, Stoehlmacher J, Zhang W, Groshen S, Yu
MC, Ibal S, Lens HJ and Ladner RD: A6 bp polymorphism
in the tymidylate synthase gene causes message instability
and is associated with decreased intratumoral TS mRNA
levels. Pharmacogenetics 14: 319-327, 2004
Festa F, Kumar R, Sanyal S, Unden B, Nordfors L,
Lindholm B, Snellman E, Schalling M, Forsti A and
Hemminki K : Basal cell carcinoma and variants in gene
coding for immune response, DNA repair, folate, and iron
metabolism. Mutat Res 574:105-111, 2005
Kastan MB, onkyekwere O, Sidransky D et al.participant
of p53 protein in the cellular response to DNA damage.
Cancer res 1991; 51; 6304-11
Mannor GE, Chern PL, Barnette D. Eyelid and Periorbital Skin
Basal Cell carcinoma, oculoplastic Management and Surgery,
International Ophthalmology Clinics, 49, 1-16, 2009.
Nemet AY et al, Management of Periocular Basal and
Squamous Cell carcinoma: a series of 485 cases. American
Journal of Ophthalmology, 2006, 142: 293-297
Ibrar Hussain, Mahmooda Soni, Bakht Samar Khan,
Mohammad Daud Khan.
Basal Cell Carcinoma Presentation,Histopathological
Features and Correlation with Clinical Behaviour. Pak J
Ophthalmol 2011, Vol. 27 No. 1
Homo sapiens thymidylate synthase gene, partial cds; and
upstream region. Availabale at http://www.metalife.com/
Genbank/5478495