hasil dan pembahasan hasil dan pembahasan

HASIL DAN PEMBAHASAN
Morfologi Sel Fibroblas dalam Kultur In Vitro
Hasil pengamatan kultur sel otot fetus tikus menunjukkan secara
morfologi adanya dua bentuk sel, yakni sel fibrosit, berbentuk spindel pipih dan
sel fibroblas, berbentuk spindel agak membulat dengan beberapa penjuluran
sitoplasma (Gambar 4).
c
c
b
a
b
a
A
B
Gambar 4. Kultur in vitro sel fibroblas : A. Sel fibrosit; B. Sel fibroblas;
(a) Penjuluran sitoplasma, (b) Inti sel, (c) Sitoplasma; A-B
Preparat natif; Bar: 20 µm.
Sel fibroblas dan fibrosit memiliki inti sel yang berbentuk lonjong dan
memiliki satu atau dua nukleoli yang kadang-kadang terlihat. Hal ini sejalan
dengan Samuelson (2007) yang menyatakan bahwa sel fibrosit umumnya
berbentuk spindel dengan penjuluran sitoplasma yang saling bersentuhan.
Sedangkan, sel fibroblas memiliki bentuk yang lebih besar dibandingkan sel
fibrosit (Eurell dan Sickle 1998) dengan beberapa penjuluran sitoplasma yang
berbentuk irregular (Junquieira dan Carneiro 2005). Menurut Eurell dan Sickle
(1998) inti sel fibrosit hanya dikelilingi oleh sedikit sitoplasma yang berwarna
pucat. Sel fibrosit merupakan bentuk tidak aktif dari sel fibroblas (Junquieira dan
Carneiro 2005). Menurut Eurell dan Sickle (1998) sel fibrosit merupakan sel yang
paling umum ditemui pada jaringan ikat. Sel fibrosit memiliki kemampuan untuk
membelah diri dan kembali aktif menjadi fibroblas saat dibutuhkan untuk
memperbaiki jaringan yang rusak.
Selain dengan pengamatan secara natif, sel fibroblas juga diamati
morfologinya dengan pewarnaan HE (Gambar 5).
c
b
a
Gambar 5. Sel-sel fibroblas dengan pewarnaan Hematoksilin Eosin. Inti sel
fibroblas terlihat dengan jelas (a) dengan satu atau dua nukleoli
(b), sedangkan bagian sitoplasma tidak terlalu jelas (c). Bar: 20
µm.
Menurut Aughey dan Fyre (2001) sel-sel fibroblas tidak dapat terwarnai
dengan baik menggunakan metode HE karena adanya kandungan bahan dasar
jaringan ikat yang berlimpah dan bersifat seperti gelatin. Pernyataan Aughey dan
Fyre (2001) ini mendukung hasil pewarnaan HE dalam penelitian ini. Berdasarkan
hasil pengamatan terlihat bahwa dengan pewarnaan HE sel-sel fibroblas hanya
terlihat jelas di bagian inti selnya saja, sedangkan sitoplasmanya kurang jelas.
Oleh karena sitoplasma sel tidak terlihat dengan jelas, sulit dilakukan pembedaan
antara sel fibroblas dengan sel fibrosit. Hal ini juga sejalan dengan Eurell dan
Sickle (1998) yang menyatakan bahwa dengan pewarnaan HE, hanya inti sel
fibroblas saja yang dapat terlihat jelas, sedangkan bagian membran plasmanya
tidak jelas. Oleh karena itu diperlukan metode pewarnaan lain yang diharapkan
dapat mewarnai sel fibroblas dengan lebih baik misalnya pewarnaan Van Gieson,
Masson's trichrome, atau Periodic acid Schiff (PAS) yang merupakan jenis
pewarnaan jaringan ikat.
Pertumbuhan Sel Fibroblas dalam Kultur In Vitro
Hasil penghitungan jumlah sel fibroblas memperlihatkan terjadinya
peningkatan jumlah sel baik pada kultur primer maupun pada kultur galur sel
setelah mengalami pasase. Sedangkan dilihat dari PDT, tampak bahwa dengan
meningkatnya jumlah pasase, waktu PDT menjadi semakin kecil (Tabel 1).
Tabel 1. Jumlah dan PDT sel fibroblas pada kultur in vitro
Galur
Jumlah sel awal
Jumlah sel akhir
PDT (hari)
Kultur primer
6,0 x 106
16 x 106
4,2
1
2,4 x 106
6 x 106
3,7
5
1,2 x 106
3 x 106
2,2
9
2,0 x 105
6 x 105
1,9
Doubling time adalah periode waktu yang diperlukan oleh sel untuk
menjadikan jumlah atau ukurannya dua kali dari jumlah maupun ukuran semula
(Mader 2000). Semakin cepat proses proliferasi (pembelahan) sel, maka PDT
yang dicapai pun akan semakin cepat.
Pada kultur primer tampak bahwa PDT adalah 4,2 yang menunjukkan
bahwa waktu yang dibutuhkan untuk proses pembelahan sel adalah 4,2 hari,
waktu ini jauh lebih tinggi dibandingkan waktu yang dibutuhkan untuk proses
pembelahan sel secara in vivo yaitu berkisar 18–24 jam (Butler 2004). Hal ini
disebabkan komposisi sel pada kultur primer masih tidak homogen. Selain itu, selsel pada kultur primer belum bisa beradaptasi dengan lingkungan in vitro,
sehingga pertumbuhannya belum terlalu baik. Namun demikian, seiring dengan
dilakukannya pasase yang mengarah kepada homogenisitas sel, maka waktu yang
dibutuhkan oleh sel untuk membelah semakin cepat dan bahkan setelah sel
mengalami pasase ke 9, PDT menunjukkan nilai yang semakin mendekati kisaran
waktu normal yang dibutuhkan untuk pembelahan secara in vivo. Sel yang telah
mengalami beberapa kali pasase akan semakin homogen dan akan lebih mampu
beradaptasi dengan kondisi lingkungan in vitro. Menurut Freshney (2005) setelah
pasase ke tiga, sel yang dikultur akan menjadi lebih stabil dan mampu
berproliferasi dengan lebih cepat. Peningkatan jumlah sel ini berkolerasi dengan
hasil pengamatan morfologi sel. Semakin homogen sel di dalam kultur, maka
tingkat proliferasinya juga akan semakin cepat.
Menurut Freshney (2005), proliferasi sel dipengaruhi oleh faktor dari
lingkungan. Oleh karena itu, selain faktor homogenitas, salah satu faktor lain yang
sangat berpengaruh terhadap tingkat proliferasi sel adalah kepadatan sel. Sel
dermal fibroblas akan berkembang relatif seragam (uniform) pada kultur dengan
kepadatan rendah (sekitar 104 sel/ml), dan sebaliknya pada kultur dengan
kepadatan tinggi (sekitar 105 sel/ml), sel yang berkembang akan relatif tidak
seragam, terjadi induksi terhadap sel untuk berdiferensiasi, dan terjadi
penghambatan proliferasi sel (Freshney 2000). Sel fibroblas dalam penelitian
dikultur dengan konsentrasi 105 yang menurut Freshney (2000) termasuk dalam
kategori padat, oleh karenanya proliferasi sel juga tidak berjalan dengan baik.
Penghambatan proliferasi sel dapat diinisiasi oleh kontak antar sel dan
ditonjolkan oleh kepadatan, perubahan resultan pada bentuk sel, dan penurunan
penyebaran sel (Freshney 2005). Kepadatan menyebabkan terjadinya induksi dan
diferensiasi karena kontak antar sel memungkinkan terbentuknya gap junction dan
menyebabkan metabolit mengsinkronisasi ekspresi diferensiasi di dalam populasi
sel. Hal ini umumnya terjadi saat populasi sel telah menutupi seluruh permukaan
tempat sel ditumbuhkan atau dikenal dengan istilah konfluen (Butler 2004).
Faktor lainnya yang dapat mempengaruhi proliferasi sel adalah nutrisi (Freshney
2000). Tetapi dalam penelitian ini, faktor nutrisi tidak mempengaruhi proliferasi
sel, karena semua sel menggunakan medium dengan kandungan nutrisi yang
sama.
Identifikasi protein
Conditioned medium
yang
mengandung
sekreta
protein
yang
diekskresikan oleh sel dalam kultur di analisis kandungannya menggunakan
metode Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS
PAGE) dilanjutkan dengan metode pewarnaan silver nitrat (Gambar 6).
Gambar 6.
Hasil SDS PAGE conditioned medium kultur sel fibroblas
dengan visualisasi protein menggunakan metode silver nitrat.
Semua sampel memiliki BM kurang lebih 36,5 kDa. (M:
Marker; KP: Kultur primer; P1, P5, P9: Kultur galur sel 1, 5,
dan 9).
Estimasi berat molekul protein yang terkandung di dalam CM kultur sel
fibroblas dilakukan dengan menggunakan perbandingan berat molekul protein
standar (marker) yang di-running secara bersamaan dengan CM kultur sel
fibroblas. Hasil pewarnaan memperlihatkan pita (band) yang sejajar baik dari
kultur primer, pasase 1, pasase 5, maupun pasase 9. Hal ini menunjukkan bahwa
berat molekul protein dari keempat sampel CM yang dievaluasi adalah sama.
Estimasi berat molekul protein berdasarkan marker yang digunakan adalah 36,5
kDa.
Ketebalan pita protein yang dihasilkan oleh tiap sampel berbeda. Pita
protein yang paling tebal adalah pita protein dari CM kultur primer dan pasase 1
dengan ketebalan pita yang hampir sama. Selanjutnya adalah pasase 5 dan yang
paling tipis adalah pita protein dari CM pasase 9. Ketebalan pita protein ini
dipengaruhi oleh jumlah sel fibroblas yang ada di dalam kultur. Semakin sedikit
jumlah sel fibroblas maka dapat diasumsikan bahwa konsentrasi protein yang
disekresikan ke dalam CM juga semakin sedikit. Sesuai dengan data pengamatan
pertumbuhan sel, jumlah total sel di akhir setiap pasase semakin menurun. Oleh
karena itu, pita protein yang dihasilkan juga semakin lama semakin tipis.
Penurunan jumlah sel akhir ini dikarenakan jumlah sel awal yang dikultur
konsentrasinya tidak sama.