18 BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN Sebelum

BAB 4
HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN
Sebelum melakukan PCR, terlebih dahulu dilakukan perancangan primer menggunakan
program DNA Star. Pemilihan primer dilakukan dengan mempertimbangkan parameter
spesifisitas, terbentuknya hairpin, terbentuknya self dimer atau pair dimer, dan perbedaan
Tm antar primer. Primer hasil perancangan memiliki spesifisitas kurang baik karena
mengenali 2 gen yang berbeda. Gen yang dikenali adalah chaperonin 60.1 dan gen
MTGROEOP yang mengkode pembentukan protein β-Ketoacyl-Acyl Carrier Protein
Synthase (KCS) dan protein berukuran 10 kDa. Hal ini sulit dihindari karena setelah
dilakukan proses penyamaan homologi menggunakan program online LALIGN pada situs :
www.ch.embnet.org didapat 99,9% homologi antara gen chaperonin 60.1 dan gen
MTGROEOP dengan perbedaan hanya 1 basa. Keberadaan dimer (penempelan antara
primer) dan hairpin (pembentukan loop dari primer) tidak terlalu mempengaruhi kinerja
primer, dan Tm dari kedua primer cukup jauh akan tetapi tidak mempengaruhi kinerja
primer sehingga bisa digunakan pada kondisi yang sama (perbedaan Tm 4 0C).
Proses optimasi PCR dilakukan untuk memperoleh 1 produk PCR dengan menentukan
kondisi dan komposisi reaksi yang optimum. Hasil elektroforesis produk PCR dengan suhu
penempelan 55, 56, dan 60°C menunjukkan bahwa pada suhu ini belum terjadi proses
amplifikasi karena diduga pada suhu ini belum terjadi penempelan primer. Untuk
menentukan konsentrasi optimum ion Mg2+, primer, dNTP dan Taq polimerase yang
digunakan dalam reaksi amplifikasi, variasi konsentrasi digunakan dan komponen lain
PCR tidak divariasikan.
Pada suhu 57°C dengan variasi MgCl2 produk PCR yang mengandung 2 dan 3 mM MgCl2
memberikan produk PCR lebih dari satu, reaksi lainnya tidak memberikan amplifikasi
sama sekali tapi hanya reaksi dengan 2 mM MgCl2 yang memberikan produk PCR hasil
perhitungan berukuran 1643 pb. Produk amplifikasi lebih dari satu dapat disebabkan
karena konsentrasi ion Mg2+ berlebih akan menyebabkan primer menempel di tempat yang
tidak diharapkan sehingga akan dihasilkan produk yang tidak spesifik. Optimisasi
konsentrasi ion Mg2+ sangat penting karena Taq DNA polimerase merupakan enzim yang
18
19
dipengaruhi oleh magnesium. Taq DNA polimerase membutuhkan ion magnesium bebas
pada bagian atas enzim dimana cetakan DNA, primer dan dNTP terikat. Pada konsentrasi
Mg2+ yang rendah akurasi Taq DNA polimerase tinggi tapi kecepatan polimerisasi DNA
rendah dan sebaliknya. Selain itu Mg2+ berlebih akan menstabilisasi untai ganda DNA dan
mencegah denaturasi DNA secara lengkap sehingga akan menyebabkan berkurangnya
jumlah produk amplifikasi yang dihasilkan.
Pada suhu 57°C dengan variasi konsentrasi dNTP , reaksi PCR yang mengandung 1 dan
0,8 mM dNTP memberikan produk PCR lebih dari satu, reaksi lainnya tidak memberikan
produk PCR sama sekali
tapi hanya reaksi yang mengandung 1 mM dNTP yang
memberikan produk PCR hasil perhitungan berukuran 1643 pb. Pada suhu 57°C dengan
variasi konsentrasi Taq polimerase , reaksi PCR yang mengandung 0,5 U Taq polimerase
memberikan satu produk PCR sedangkan pada reaksi dengan 1 dan 1,5 U Taq polimerase
memberikan produk PCR lebih dari satu. Ketiga konsentrasi memberikan produk PCR
hasil perhitungan berukuran 1643 pb. Produk PCR lebih dari satu dapat terjadi karena
jumlah Taq polimerase yang terlalu tinggi dapat menyebabkan meningkatnya produk yang
tidak spesifik dan apabila digunakan terlalu rendah maka jumlah produk yang diharapkan
akan sedikit.
Pada suhu 57°C dengan variasi jumlah primer, reaksi PCR yang mengandung 30; 15 dan
7,5 pikomol memberikan 3 produk PCR dengan hasil perhitungan berukuran 1643 pb. Dari
ketiga reaksi tidak ada perbedaan intensitas produk pada 1643 pb yang bermakna. Pada
suhu 58°C dengan variasi jumlah primer, reaksi PCR yang mengandung 30; 15 dan 7,5
pikomol memberikan satu produk PCR berukuran 1643 pb. Pada suhu 59°C amplifikasi
memberikan produk PCR lebih dari satu namun memberikan produk PCR berukuran hasil
perhitungan 1643 pb. Jumlah primer yang meningkat dapat menyebabkan kesalahan
penempelan primer di tempat selain target yang akan diamplifikasi sehingga akan terjadi
peningkatan jumlah produk yang tidak spesifik.
20
5
4 3 2 1 M
4 3
2 1 M
5 kb
4 kb
3 kb
2 kb
5 kb
4 kb
3 kb
2 kb
1 kb
1643 pb
1643 pb
1 kb
M = Marka, 1 = kontrol negatif,
2 = 2 mM MgCl2, 3 = 3 mM
MgCl2, 4 = 4 mM MgCl2, 5 =
5 mM MgCl2 .
M = Marka, 1 = kontrol
negatif, 2 = 1 mM dNTP,
3 = 0,8 mM dNTP, 4 = 0,6
mM dNTP
(A)
(B)
4
3
2 1 M
M
1
2
3
4
5 kb
4 kb
3 kb
5 kb
2 kb
4 kb
3 kb
1 kb
2 kb
1643 pb
1 kb
M = Marka, 1 = kontrol negatif , 2
= 0.5 Unit Taq polimerase, 3 = 1
Unit Taq polimerase, 4 = 1,5 Unit
Taq polimerase
(C)
1643 pb
M = Marka, 1 = kontrol negatif,
2 = 30 pikomol primer, 3 = 15
pikomol primer, 4 = 7,5
pikomol primer
(D)
21
M
1 2
3
4
M
5 kb
4 kb
3 kb
1
2
5 kb
4 kb
3 kb
2 kb
2 kb
1643 pb
1 kb
1 kb
M = Marka, 1 = kontrol negatif,
2 = 30 pikomol primer, 3 = 15
pikomol primer, 4 = 7,5 pikomol
primer.
(E)
1643 pb
M = Marka, 1 = kontrol
negatif, 2 = Produk
PCR.
(F)
Gambar 4.1 Hasil Optimasi Komposisi PCR. A = Variasi Konsentrasi MgCl2, B =
Variasi Konsentrasi dNTP, C = Variasi Jumlah Taq Polimerase, D =
Variasi Jumlah Primer, Suhu 57°C, E = Variasi Jumlah Primer, Suhu 58°C,
F = Suhu 59°C..
Berdasarkan data optimasi yang telah dilakukan maka proses PCR untuk selanjutnya
dilakukan pada suhu 58°C dengan komposisi cetakan DNA 22,5 ng, primer M. tuberculosis
forward dan M. tuberculosis reverse masing-masing 30 pikomol, MgCl2 2 mM, Taq
polimerase 1 Unit, Taq Buffer 2,5 L dan aquabidest steril ditambahkan hingga volume
reaksi mencapai 25 L.
Produk PCR yang dihasilkan mempunyai nukleotida A bebas pada ujung 3’. Produk PCR
ini kemudian diligasikan ke vektor kloning pGEM-T yang memiliki nukleotida T bebas
pada ujung 5’ sehingga bila diligasi akan saling komplemen. Ligasi dilakukan dengan
enzim T4 DNA ligase. Perbandingan DNA sisipan dan vektor yang disarankan oleh
produsen pGEM-T Kit adalah 1:8 hingga 8:1, walaupun secara prinsip semakin besar
perbandingan jumlah DNA sisipan terhadap vektor maka semakin besar kemungkinan
jumlah vektor yang tersisipi. Untuk mendapatkan hasil ligasi yang optimum maka reaksi
ligasi dilakukan pada suhu 4°C selama 20 jam setelah sebelumnya diinkubasi 37°C 1 jam
22
pada suhu ruang. Perbandingan ligasi yang digunakan adalah 1:1, 3:1 , 6:1, 8:1 dan 16:1.
Hasil reaksi ligasi kemudian ditransformasi ke dalam E. coli JM 109 menggunakan metode
kejut panas. Proses transformasi berhasil apabila biakan dapat tumbuh pada media yang
mengandung ampisilin. Dari hasil biakan diperoleh E. coli transforman yang dapat tumbuh
pada media mengandung ampisilin dengan koloni berwarna putih dan koloni biru, koloni
putih menunjukkan adanya plasmid rekombinan dan koloni biru memiliki plasmid tanpa
DNA sisipan. Untuk menganalisis keberhasilan ligasi maka koloni putih yang dihasilkan
dari hasil transformasi kemudian diisolasi plasmidnya, dan dilakukan analisis migrasi
dibandingkan dengan pGEM-T tanpa DNA sisipan. Plasmid rekombinan bergerak lebih
lambat dibandingkan dengan pGEM-T tanpa DNA sisipan, yang menunjukkan bahwa
plasmid rekombinan yang membawa DNA sisipan ukurannya bertambah sehingga
bergerak lebih lambat.
Tabel 4.1 Jumlah Koloni Hasil Transformasi dan Koloni Putih
Yang Mengandung Plasmid Rekombinan
Perbandingan jumlah DNA
terhadap vektor
3:1
Jumlah koloni putih
56
Jumlah koloni putih mengandung
plasmid rekombinan
17
6:1
2
-
8:1
26
5 koloni
16 : 1
6
-
5
4
3
2
1
Gambar 4. 2 Analisa Migrasi Plasmid Rekombinan.
1 = plasmid tanpa DNA sisipan ; 2, 3, 4,
5 = plasmid dengan DNA sisipan.
23
Hasil analisa migrasi menunjukkan bahwa hanya 22 koloni putih yang memiliki plasmid
rekombinan. Sebagian besar koloni putih memiliki plasmid yang jarak migrasinya sama
dengan plasmid tanpa DNA sisipan dan sebagian kecil koloni tidak memiliki plasmid.
Menurut teori koloni putih seharusnya memiliki plasmid yang tersisipi DNA karena vektor
kloning pGEM-T memiliki sisi kloning tempat DNA menyisip dalam gen lacZ. Koloni
putih berarti mengandung DNA sisipan pada sisi kloning dalam gen lacZ yang
menyebabkan tidak terjadinya katabolisme X-gal dan tidak terbentuk pigmen biru yang
mewarnai koloni.
Dari hasil transformasi diperoleh 90 koloni putih tetapi hanya 22 koloni putih yang
memiliki plasmid rekombinan. Banyaknya koloni putih yang tidak memiliki plasmid
ataupun plasmid tanpa DNA sisipan dapat diakibatkan karena perbandingan ligasi antara
vektor dengan DNA sisipan tidak optimal. Selain itu, waktu inkubasi yang tidak cukup
lama, kegagalan proses ligasi karena adanya komponen inhibitor dalam produk PCR,
produk PCR tidak terligasi karena tidak mempunyai nukleotida A bebas pada ujung 3’.
Penyebab lain koloni putih yang tidak memiliki plasmid ataupun plasmid tanpa DNA
sisipan adalah produk PCR tidak terligasi karena terbentuknya dimer, fragmen DNA
menyisip pada plasmid tapi tidak merusak gen lacZ, dan adanya primer yang membentuk
dimer yang mana akan terligasi ke dalam vektor dan terlihat sejajar dengan vektor tanpa
DNA sisipan karena ukuran yang kecil.
Untuk meyakinkan keberadaan DNA pengkode chaperonin 60.1 pada plasmid rekombinan,
dilakukan analisis pemotongan plasmid. Pada saat perancangan primer bagian sisi 5’ dari
masing-masing primer ditambahkan urutan DNA yang dikenali oleh enzim restriksi BamHI
dan EcoRI, sehingga produk PCR yang dihasilkan membawa situs restriksi tersebut pada
ujung 5’ dan 3’. Pemotongan menggunakan enzim BamHI dan EcoRI akan memotong
DNA sisipan tersebut dari plasmid. Hasil analisa pemotongan plasmid memberikan dua
pola pemotongan. Pada Gambar 4.3, elektroforegram hasil restriksi tunggal plasmid
rekombinan dengan BamHI ataupun EcoRI menunjukkan terdapat satu pita berukuran 3503
pb. Ukuran teoritis hasil restriksi tunggal adalah 4656 pb yaitu ukuran plasmid pGEM-T
ditambah dengan gen sisipan. Plasmid ini menunjukkan plasmid tidak mengandung DNA
sisipan pengkode chaperonin 60.1 karena jauh berbeda dengan ukuran teoritis, hal ini dapat
24
terjadi karena produk PCR yang digunakan untuk proses ligasi tidak hanya mengandung
satu produk PCR berukuran teoritis 1656 pb
Pada Gambar 4.4, elektroforegram menunjukkan bahwa plasmid tidak terpotong oleh
enzim restriksi dibuktikan dengan pita hasil restriksi yang sejajar dengan pita plasmid yang
tidak dipotong dengan enzim restriksi. Plasmid yang tidak terpotong oleh enzim BamHI
dan EcoRI mungkin besar adalah plasmid mengandung DNA sisipan chaperonin 60.1 yang
telah kehilangan situs restriksi BamHI dan EcoRI. Penambahan situs restriksi bertujuan
menyediakan ujung gen yang kompatibel dengan vektor ekspresi pET yang juga akan
direstriksi dengan enzim yang sama.
M
1
2
3
4
M
1
2
3
4
3503 pb
5 kb
4 kb
3 kb
2 kb
1 kb
5 kb
4 kb
3 kb
2 kb
1 kb
Gambar 4.3 Hasil Analisis Karakterisasi Klon Gambar 4.4
Menggunakan Enzim Restriksi (1)
M = Marka, 1 = Hasil restriksi
menggunakan enzim EcoRI, 2 =
Hasil restriksi menggunakan enzim
BamHI, 3 = Plasmid pGEM-T
Chaperonin 60.1 tidak dipotong
dengan enzim restriksi EcoRI dan
BamHI, 4 = pGEM-T tanpa DNA
sisipan
Hasil Analisis Karakterisasi Klon
Menggunakan Enzim Restriksi (2)
M = Marka, 1 = Hasil restriksi
menggunakan enzim EcoRI, 2 =
Hasil restriksi menggunakan enzim
BamHI, 3 = Plasmid pGEM-T
Chaperonin 60.1 tidak dipotong
dengan enzim restriksi EcoRI dan
BamHI, 4 = pGEM-T tanpa DNA
sisipan