TEKNIK PEMBUATAN BIAKAN SEL PRIMER GINJAL JANIN SAPI

TEKNIK PEMBUATAN BIAKAN SEL PRIMER GINJAL JANIN SAPI UNTUK
MENUMBUHKAN VIRUS INFECTIOUS BOVINE RHINOTRACHEITIS
Pudji Kurniadhi1
P
enyakit infectious bovine rhinotracheitis (IBR) pada
sapi disebabkan oleh virus bovine herpesvirus 1 atau
BHV 1 (Buxton dan Fraser, 1977; Gibbs dan Rweyemamu,
1977; St George, 1982). Virus BHV1 selain menyerang alat
pernapasan juga dapat menyerang alat-alat genital atau alat
reproduksi. Gejala-gejala klinis hewan penderita IBR adalah
demam tinggi (40,5-42 oC), nafsu makan hilang/berkurang,
depresi, pernapasan terlihat sesak disertai adanya lendir dari
lubang hidung. Pada stadium awal, lendir bersifat encer,
tetapi memasuki stadium lebih lanjut berubah menjadi keruh
(Gibbs dan Rweyemamu, 1977). Selain gejala-gejala klinis
tersebut, juga dapat ditemukan selaput lendir pada mata
(conjunctivitis dan keratitis). Pada hewan jantan, virus
tersebut menyebabkan balanopostitis (radang pada kepala
penis), sedang pada hewan betina menyebabkan radang pada
vulva dan vagina sehingga penyakit ini disebut infectious
pustular vulvovaginitis (Gibbs dan Rweyemamu, 1977; St
George, 1982).
Penyakit biasanya menular melalui kontak langsung
dengan hewan penderita, sedangkan pada penyakit genital
melalui perkawinan alami maupun buatan (Gillespie dan
Timoney, 1981). Pada hewan jantan yang terinfeksi virus IBR,
virus dapat ditemukan pada semen. Isolasi virus IBR dari
semen pernah dilaporkan di Australia (Spradbrow, 1968),
Brasil (Weiblen et al., 1992), dan Belanda (Van Oirschot et al.,
1993).
Diagnosis penyakit dapat dilakukan berdasarkan gejalagejala klinis dengan didukung oleh isolasi virus. Selain
gejala klinis dan isolasi virus, uji serologi juga dapat membantu melengkapi diagnosis penyakit. Uji serologi yang
sudah dibakukan oleh Badan Kesehatan Hewan Dunia
adalah uji netralisasi virus (VNT) pada biakan sel. Biakan sel
tersebut bisa dibuat dari organ ginjal janin sapi dengan
teknik pembuatan biakan sel primer. Uji VNT memerlukan
stok virus (antigen). Tujuan dari percobaan ini adalah untuk
menumbuhkan virus IBR dengan cara membuat biakan sel
primer ginjal janin anak sapi dan menumbuhkannya untuk
menjamin ketersediaan stok virus IBR.
1
Ajun Teknisi Litkayasa Madya pada Balai Penelitian Veteriner, Jln.
R.E. Martadinata 30, Bogor 16114, Telp. (0251) 331048, Faks.
(0251) 336425
66
BAHAN DAN METODE
Percobaan dilaksanakan pada bulan Juli 2001 di Laboratorium Virologi Balai Penelitian Veteriner, Bogor. Virus yang
dipakai adalah virus IBR standar galur Colorado, dan sampel
organ adalah ginjal janin sapi.
Pembuatan Biakan Sel
Sampel organ berupa janin sapi diletakkan di atas baki yang
terbuat dari bahan stainless steel dan sudah dicucihamakan
dengan cara dibersihkan menggunakan kapas yang mengandung alkohol teknis 70%. Janin sapi diseksi/dibedah
menggunakan alat-alat bedah yang sudah disterilkan, yaitu
pinset, gunting lurus, gunting bengkok, scalpel, dan pisau
bedah.
Setelah proses pembedahan selesai, selanjutnya organ
ginjal diambil untuk dilakukan pembuatan biakan sel primer.
Organ ginjal dibuka lapisan kulitnya sehingga terlihat bentuk
ginjal. Selanjutnya ginjal dicuci dengan phosphate buffer
saline (PBS) pH 7,2 yang mengandung antibiotik 1.000 IU/ml.
Antibiotik yang digunakan yaitu penisilin dan streptomisin.
Pencucian dilakukan 3-4 kali atau sampai terlihat bersih,
kemudian ginjal dicincang sampai halus dengan gunting dan
pinset. Organ yang sudah halus dicuci kembali dengan PBS
pH 7,2 yang mengandung antibiotik 200 IU/ml sebanyak 3-4
kali atau sampai bersih dari darah, kemudian dipindahkan ke
dalam botol bermagnet yang steril dan ditambahkan antibiotic trypsin versen (ATV) 0,25%. Tripsinasi dilakukan
dalam pemanas air dengan pengaduk steril pada suhu 37°C
selama 5-10 menit, sampai cairan di dalam botol terlihat
keruh.
Setelah itu cairan dituang dan dipindahkan ke dalam
botol steril lain dan ditambahkan ± 2 ml foetal bovine serum
(FBS), kemudian disimpan ke dalam kulkas selama 10 menit.
Organ yang belum hancur ditripsinasi ulang, proses ini
dilakukan 2-3 kali. Cairan yang sudah terkumpul kemudian
disaring menggunakan kawat kasa steril dan dipindahkan ke
dalam tabung sentrifuse steril dan diputar dengan kecepatan
1.000-1.500 rotasi per menit (rpm). Selanjutnya supernatan
dibuang dan ditambahkan media penumbuh yaitu dulbecco
modified eagle medium (DMEM) yang mengandung 10%
Buletin Teknik Pertanian Vol. 8. Nomor 2, 2003
FBS pada endapan sel. Larutan sel dimasukkan ke dalam
botol biakan jaringan dan diinkubasikan pada suhu 37°C.
Penyiapan Biakan Sel
Setelah 2-3 hari, media penumbuh biakan sel diganti untuk
membuang sel-sel yang mati. Penggantian dilakukan dengan
cara mencuci sel tersebut dengan PBS pH 7,2 yang mengandung antibiotik 200 IU/ml sebanyak satu kali, kemudian
ditambahkan media penumbuh dan diinkubasikan kembali
pada suhu 37°C. Setelah biakan sel berumur ± 7 hari, biakan
sel tersebut akan tumbuh merata, sehingga bisa diperbanyak
lagi dengan cara mempasase. Proses pasase dilakukan
dengan cara mencuci biakan sel yang sudah tumbuh merata
tersebut dengan PBS pH 7,2 yang mengandung antibiotik 200
IU/ml sebanyak 2 kali, kemudian ditambahkan ATV 0,25%
sebanyak 10% dari jumlah media penumbuh semula dan
diinkubasikan pada suhu 37°C selama 5-10 menit.
Gambar 1. Biakan sel ginjal janin sapi yang diinfeksi virus IBR
Setelah itu biakan sel akan tertripsinasi menjadi sel-sel
tunggal (bulat satu-satu) dan siap untuk dipindahkan ke
dalam dua botol sel serta diberi media penumbuh, selanjutnya diinkubasikan pada suhu 37 oC. Untuk memperbanyak
biakan sel tersebut dilakukan proses pasase secara terus
menerus.
Uji Infeksi Virus
Setelah biakan sel primer ginjal janin sapi cukup banyak,
dapat digunakan untuk menumbuhkan virus IBR. Caranya,
biakan sel yang sudah monolayer lebih kurang berumur 1-2
hari dibuang media penumbuhnya, kemudian dimasukkan
virus IBR sebanyak 10% dari jumlah media penumbuh dan
diinkubasikan selama 1-3 jam pada suhu 37°C. Selanjutnya
ditambahkan media pemelihara yaitu DMEM yang mengandung 2% FBS.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Setelah 1-4 hari infeksi, virus IBR tumbuh dengan baik
(Gambar 1) yang ditunjukkan oleh adanya cythophatic effect
(CPE), yaitu kerusakan biakan sel karena virus. Hal ini
membuktikan bahwa virus IBR tersebut tumbuh di dalam
biakan sel primer ginjal janin sapi. Sebagai pembanding
digunakan biakan sel primer ginjal janin sapi yang normal
(Gambar 2). Tingkat kerusakan sel karena virus (CPE) IBR
(Tabel 1) dihitung dengan cara melihat persentase kerusakan
sel yang disebabkan oleh virus (CPE) dari keseluruhan sel.
Apabila kerusakan biakan sel mencapai 80% maka virus
Buletin Teknik Pertanian Vol. 8. Nomor 2, 2003
Gambar 2. Biakan sel ginjal janin sapi yang tidak diinfeksi virus
IBR (normal)
Tabel 1. Tingkat kerusakan sel karena virus (CPE) IBR
Hari ke1
2
3
4
Biakan sel yang dinfeksi
virus IBR
CPE
CPE
CPE
CPE
20%
40%
60%
80%
Biakan sel normal
Normal
Normal
Normal
Normal
segera dipanen dengan cara dibekucairkan pada suhu -70°C
sebanyak 2 kali, selanjutnya dipindahkan ke tabung penyimpanan dan disimpan pada suhu -70°C setelah diberi
label.
Setelah dilakukan infeksi virus IBR pada biakan sel
primer ginjal janin sapi, ternyata virus IBR dapat tumbuh
dengan baik sehingga stok virus IBR akan selalu tersedia
67
dalam jumlah yang cukup banyak. Biakan sel primer ginjal
janin sapi ini tidak selamanya tumbuh dengan baik. Sel primer
yang tumbuh dengan baik dan dapat digunakan untuk
infeksi virus IBR hanya sampai pada pasase ke-15, karena
setelah pasase ke-15 selnya menjadi tidak sensitif lagi. Apabila stok virus diperkirakan sudah cukup banyak maka biakan
sel pimer tersebut bisa disimpan mengingat sulitnya mencari
janin sapi.
Infeksi virus IBR dapat dilakukan dengan beberapa cara,
yaitu menggunakan hewan percobaan (sapi dan kelinci) dan
biakan sel. Biakan sel yang bisa digunakan untuk infeksi ada
dua macam, yaitu biakan sel lestari dan biakan sel primer.
Biakan sel lestari adalah biakan sel yang sudah mengalami
pasase lebih dari 40 kali (dengan perlakuan khusus) sehingga
sifat sel sudah tidak berubah lagi. Sel ini bisa dipakai sampai
pasase ke-150. Biakan sel primer adalah biakan sel yang
dibuat langsung dari organ dan pasasenya (tanpa perlakuan
khusus) tidak bisa lebih dari 15 kali, karena setelah pasase
yang ke-15 selnya tidak sensitif lagi.
KESIMPULAN
Biakan sel primer ginjal janin sapi dapat digunakan untuk
menumbuhkan virus IBR. Pasase biakan sel primer ginjal
janin sapi tidak lebih dari pasase yang ke-15, karena setelah
pasase yang ke-15 selnya tidak sensitif lagi. Untuk menjamin
ketersediaan biakan sel dan virus IBR, maka perlu dilakukan
68
pembuatan sel serta pasase sel dan virus yang berkesinambungan serta pengawasan terhadap sel dan virus
secara teratur.
DAFTAR PUSTAKA
Buxton, A. and G. Fraser, 1977. Animal Microbiologi Vol II.
Blackwell Scientific Publication, Oxford-London-EdenburgMelbourne. p. 745-746.
Gibbs, E.P.J. and M.M. Rweyemamu. 1977. Bovine herpesvirus 1.
Vet. Bull. (47): 317-343.
Gillespie, J.E. and J.F. Timoney, 1981. Hagan and Bruner’s
Infectious Diseases of Domestic Animals. Comstock
Publishing Associates. Cornell University Press, Ithaca &
London. p. 552-559.
Spradbrow, P.B. 1968. The isolation of Infectious bovine
rhinotracheitis from bovine semen. Aust. Vet. J. (44): 410-412.
St George, T.D. 1982. Herpesvirus in cattle. Advance in Veterinary
Virology. Proceeding No. 60. Refresher Course for Veterinarians. University of Sydney, Australia. p. 103-108.
Van Oirschot, J.T., P.J. Straver, J.A.H. Van Lieshout, J. Quak,
Westenbrink, and A.C.A. Van Exsel. 1993. A subclinical
infection of bulls with bovine herpesvirus type 1 at an
artificial insemination centre. Vet. Rec. 132: 32-35.
Weiblen, R., L.C. Kreutz, T.F. Cannabarro, L.F. Schuch, and M.C.
Rebelatto. 1992. Isolation of bovine herpes virus 1 from
preputial swabs and semen of bulls with balanopostitis. J.
Vet. Diagn. Invest. 4: 341-343.
Buletin Teknik Pertanian Vol. 8. Nomor 2, 2003