III. UJI TOKSISITAS AKUATIK A. Uji Toksisitas

III. UJI TOKSISITAS AKUATIK
A. Uji Toksisitas
Toksisitas adalah kemampuan suatu bahan atau senyawa kimia untuk
menimbulkan kerusakan pada saat mengenai bagian dalam atau permukaan tubuh
yang peka. Uji toksisitas digunakan untuk mempelajari pengaruh suatu bahan kimia
toksik atau bahan pencemar terhadap organisme tertentu. Dalam toksikologi dan uji
tokisitas sering digunakan istilah-istilah berikut:
1.
Akut
: tanggapan berat dan cepat terhadap rangsang,
biasanya dalam waktu 4 hari untuk ikan dan
biota akuatik lainnya.
2.
Subakut
: tanggapan terhadap rangsang yang tidak seberat tanggapan akut, timbul dalam waktu lebih
lama dan dapat menjadi akut.
3.
Kronik
: tanggapan terhadap rangsang yang berlangsung dalam waktu lama, paling tidak mencapai >
0,1 masa hidup.
4.
Letal
: rangsang pada konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian secara langsung.
5.
Subletal
: rangsang pada konsentrasi di bawah konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian
secara langsung.
6.
Bioassay Aquatic
: uji toksisitas dengan menggunakan biota air
guns mengetahui pengaruh bahan toksik atau
faktor-faktor lingkungan.
7.
Uji Toksisitas Dinamik
: uji toksisitas pada organisme uji yang diper-
(Flow-through Toxicity Test)
lakukan dengan serangkaian konsentrasi bahan
toksik yang toksikan dan air ujinya selalu diganti.
Biasanya organisme uji diperlakukan dalam air uji
yang mengalir selama > 4 hari.
Uji Toksisitas Statik
: uji toksisitas pada organisme uji yang diper-
(Static Toxicity Test)
lakukan dengan serangkaian konsentrasi bahan
toksik tanpa penggantian air uji.
Dosis Letal-50
: dosis bahan toksik yang dapat menyebabkan
(Lethal Dose-50 atau LD50)
kematian 50% populasi organisme uji dalam
periode waktu tertentu.
8.
9.
Universitas Gadjah Mada
10
11
12
13
14
Konsentrasi Letal-50
: konsentrasi atau kadar bahan toksik yang
(Lethal Concentration-50
dapat menyebabkan kematian 50% populasi atau
LC50)organisme uji dalam periode waktu tertentu.
Dosis Efektif-50
: dosis bahan toksik yang menyebabkan peru-
(Effective Dose-50
bahan tingkah laku dan tanggapan fisiologik
atau ED50)
tertentu pada 50% populasi organisme uji dalam
periode waktu tertentu.
Konsentrasi Efektif-50
: konsentrasi bahan toksik yang menyebabkan
(Effective Concentration-50
efek tertentu pada 50% populasi organisme
atau EC50)
uji dalam periode waktu tertentu.
Konsentrasi Aman
: konsentrasi maksimum bahan toksik yang
(Safe Concentration
tidak membahayakan organisme setelah ber-
atau SC)
sentuhan dengan bahan tersebut dalam periode
waktu lama, setidak-tidaknya satu generasi.
Konsentrasi Toksikan Mak-
: konsentrasi bahan toksik yang mungkin ter-
simal yang Diperbolehkan
dapat dalam air tanpa menyebabkan gang-
(Maximum Alloable
guan berarti bagi organisme air.
Toxicant Concentration
atau MATC)
Penentuan toksisitas akut umumnya digunakan untuk menentukan tingkat
konsentrasi bahan toksik yang menimbulkan efek merugikan terhadap persentase
spesifik organisme uji dalam periode waktu yang pendek. Penentuan toksisitas akut
yang paling umum yaitu penentuan mortalitas atau letalitas akut.
Pada umumnya toksisitas diekspresikan sebagai [C 50 atau LD50 yaitu konsentrasi
atau dosis yang dalam kondisi spesifik menyebabkan mortalitas separoh populasi
organisme dalam jangka waktu tertentu. Secara eksperimental efek 50% populasi
merupakan ukuran toksisitas yang paling reproduksibel suatu bahan toksik terhadap
suatu kelompok organisme uji. Waktu 96 jam merupakan lama (durasi) persentuhan
yang mullah dan umum digunakan, oleh karena itu pengukuran toksisitas akut yang
paling banyak dilakukan yaitu penentuan LC50-96 jam.
Universitas Gadjah Mada
B. Bahan, Alat dan Organisme Uji
Peaksanaan uji toksisitas yang banyak digunakan yaitu uji toksisitas statik. Dalam
uji toksisitas statik, organisme uji dan larutan uji ditempatkan dalam bejana-bejana uji
selama durasi waktu pengujian.
1. Bahan dan alat
Bahan yang digunakan dalam uji toksisitas dapat berupa berbagai senyawa kimia
baik organik maupun anorganik, misalnya: air limbah, satu atau lebih senyawa kimia
murni, pestida, dan lain-lain. Bahan uji lainnya yang mutlak diperlukan dalam uji
toksisitas akuatik yaitu air. Guna memperoleh hasil uji toksisitas yang baik dan akurat,
air uji harus memenuhi beberapa persyaratan berikut:
a. suhu berkisar antara 25-27°C dengan amplitudo harian kurang dari 5°C
b. derajat keasaman (pH) sebaiknya antara 6,0-7,5 atau setidak-tidaknya antara 5,09,0
c. kandungan oksigen (O2) telarut antara 4,0-8,0 ppm atau setidak-tidaknya tidak
kurang dari 3 ppm
d. kandungan karbon dioksida (CO2) bebas antara 3,0-15,0 ppm atau setidaktidaknya
kurang dari 50,0 ppm
e. kandungan ammonia, nitrit atau nitrat tidak lebih dari 10,0 ppm
f. kandungan HCO3 antara 60,0-70,0 ppm
g. volume air sekitar satu liter per 0,8 g berat ikan.
Alat yang diperlukan dalam uji toksisitas antara lain bejana uji, aerator, dan
berbagai alat pendukung lainnya. Bejana uji yang baik yaitu yang terbuat dari bahan
gelas.
2. Organisme Uji
Dalam uji toksisitas dapat digunakan berbagai jenis organisme, misalnya anggota
kelompok crustacea, mollusca atau pisces (ikan); walaupun demikian, terdapat jenisjenis organisme uji yang direkomendasikan sejumlah besar referensi digunakan dalam
uji toksisitas baku, misalnya: Daphnia magna, Daphnia pulex, Chironomus plumosus,
Carrassius auratus, Cyprinus carpio dan
Universitas Gadjah Mada
Clarias batrachus (Johnson dan Finley 1980). Guna menjaga homogenitas, hewan uji
yang digunakan sebaiknya berasal dari satu tempat yang sama. Jika menggunakan
ikan sebagai hewan uji, maka sebaiknya ikan yang digunakan mempunyai berat 0,21,5 g (fingerling fish). Guna meningkatkan akurasi hasil, sebaiknya hewan uji yang
digunakan umurnya relatif sama. Jika menggunakan ikan, maka umur yang relatif
sama tersebut dapat didekati dengan menggunakan ikan yang mempunyai
perbandingan ukuran panjang baku ikan yang terkecil dengan ikan yang terbesar tidak
lebih dari 1 : 1,5; misalnya jika panjang baku ikan terkecil yang digunakan = 3 cm,
maka panjang baku ikan uji terbesar yang boleh digunakan maksimal = 4,5 cm.
3. Tatalaksana uji toksisitas
Pelaksanaan uji toksisitas diawali dengan tahap pemeliharaan (holding),
kemudian dilanjutkan dengan aklimasi (acclimation), uji pendahuluan (exploratory test)
dan uji sesungguhnya (full-scale test).
a. Pemeliharaan (holding)
1)
Hewan uji dipindahkan dari lingkungan asal (misalnya kolam) ke air
pemeliharaan yang ditempatkan dalam laboratorium.
2)
Lama pemeliharaan sejak diperoleh dari daerah asal kemudian diangkut ke
tempat pemeliharaan lebih kurang 14 hari.
3)
Hewan uji diberi pakan satu kali per hari.
4)
Hewan uji yang mati atau abnormal segera dibuang (Anonymous 1975).
b. Aklimasi (acclimation)
1)
Hewan uji diadaptasikan dengan keadaan fisik laboratorium (lingkungan
pengujian) dengan cara berangsur-angsur dipindahkan dari 100% air
pemeliharaan ke 100% air uji.
2)
Aklimasi dianjurkan selama minimal 10 hari. Apabila dalam waktu 48 jam lebih
dari 3% populasi hewan uji mati, maka populasi hewan uji dianggap tidak
memenuhi syarat untuk pengujian.
3)
Dua hari sebelum diperlakukan, hewan uji tidak diberi pakan.
Universitas Gadjah Mada
c. Uji pendahuluan (exploratory test)
1) Masing-masing bejana uji diisi dengan 10 liter air jika hewan uji yang
digunakan sebanyak 10 ekor ikan dengan panjang 4-6 cm atau 1 liter air
untuk tiap 0,96 gram berat ikan.
2) Ke dalam tiap-tiap bejana uji yang telah diisi air dimasukkan 10 ekor hewan
uji.
3) Ke dalam masing-masing bejana uji dimasukkan bahan pencemar
dengan beberapa variasi konsentrasi.
4) Dilakukan pengamatan pola aktivitas hewan uji setiap 24 jam, mulai dari
0 jam sampai dengan 96 jam.
5) Penentuan LC50-96 jam dilakukan dengan pendekatan analisis regresi linier
sederhana atau dengan cara mengekstrapolasi titik ordinat 50% (sumbu Y)
ke garis regresi linier yang digambar di atas kertas grafik kemudian ditarik
garis tegak lurus absis (sumbu X).
d. Uji sesungguhnya (full-scale test)
1) Berdasarkan nilai LC50-96 jam uji pendahuluan, dilakukan uji toksisitas
dengan cara yang sama tetapi dengan variasi konsentrasi yang lebih sempit
di sekitar LC50-96 jam uji pendahuluan dengan mengacu pada skala
logaritmik Rand (Rand 1980).
2) Dilakukan
pengamatan
pola
aktivitas
hewan
uji
(meliputi
frekuensi
pernafasan, pola gerak, dan escape reflex) pada 0 jam, 24 jam, 48 jam, 72
jam dan 96 jam serta pengukuran kualitas air uji pada 0 jam, 48 jam dan 96
jam.
3) Penentuan LC50-96 jam dilakukan dengan pendekatan analisis regresi linier
sederhana atau dengan cara menginterpolasi titik ordinat 50% (sumbu Y) ke
garis regresi linier yang digambar di atas kertas grafik (milimeter blok)
kemudian ditarik garis tegak lurus absis (sumbu X).
Dalam uji toksisitas sebaiknya dilakukan aerasi pada setiap bejana uji, walaupun
sebagai pembanding dapat juga dilakukan pengujian tanpa pemberian aerasi.
Pemberian aerasi bertujuan agar diperoleh hasil yang lebih akurat karena efek yang
terjadi betul-betul disebabkan oleh bahan uji (senyawa kimia, air limbah, dan lain-lain),
bukan karena kekurangan oksiaen selama masa pengujian.
Universitas Gadjah Mada
Berikut ini merupakan variasi konsentrasi progresif bahan pencemar pada skala
logaritmik yang banyak digunakan sebagai acuan dalam uji toksisitas:
Kolom 1
Kolom 2
Kolom 3
Kolom 4
Kolom 5
10,0
8,7
7,5
6,5
5,6
4,2
3,7
3,2
2,8
2,4
2,1
1,8
1,55
1,35
1,15
1,0
(Sumber: Rand, 1980)
Catatan: angka-angka dalam kolom-kolom tabel di atas dapat dikalikan atau dibagi
dengan angka basis 10, misalnya 10 -3, 10-2, 10-1, 102, 103, dan seterusnya.
Umumnya penggunaan konsentrasi pada kolom-kolom 2, 3 dan 4 sudah
memadai untuk suatu pengujian pestisida. Guna memperoleh data yang
lebih akurat dapat digunakan angka-angka pada kolom 5.
C. Tolokukur subletal
Dalam uji toksisitas disamping tolokukur kematian atau letalitas, jugs sering
digunakan tolokukur subletal. Menurut Mitrovic (1972) beberapa tolokukur subletal
tersebut antara lain:
1. perubahan sifat biologik penting seperti laju pertumbuhan, cars makan, pematangan
(maturation) sel kelamin, kemampuan fertilisasi, perkembangan telur, kelulus
hidupan (survival rate) anak ikan, dan lain-lain.
Universitas Gadjah Mada
2.
gangguan fungsi (patofisiologik), dapat diamati dengan pengukuran hematologik
dan derajat metabolik, mempelajari aktivitas imunobiologik dan enzimatik atau
pengamatan tingkah laku.
3.
perubahan patomorfologik, meliputi perubahan morfologik eksternal hingga
kerusakan histologik dan sitologik.
Menurut Tandjung (1982) perubahan patomorfologik berupa perubahan morfologik
hingga kerusakan histologik branchia ikan dapat dihubungkan dengan tingkat
pencemaran air tempat ikan tersebut hidup dan/atau ditemukan. Metoda Tandjung
yang berupa pengamatan terhadap perubahan atau kerusakan struktur mikroanatomi
branchia dapat digunakan untuk menentukan tingkat pencemaran air.
Kerusakan Branchia
Tingkat 1 :
Patomorfologik Branchia
terjadi edema pada lamellae secundariae
branchiales (menunjukkan telah terjadi pengotoran
Tingkat 2 :
air tetapi belum merupakan pencemaran)
terjadi
hyperplasia
pada
pangkal
lamellae
secundariae branchiales (menunjukkan gejala terjadi
Tingkat 3 :
pencemaran)
terjadi
penyatuan dua lamellae secundariae
branchiales (menunjukkan telah terjadi pencemaran
Tingkat 4 :
ringan)
terjadi hyperplasia pada hampir seluruh lamellae secundariae branchiales (menunjukkan telah terjadi pen-
Tingkat 5 :
cemaran sedang)
terjadi kerusakan dan hilangnya struktur lamellae secundariae branchiales serta hilangnya bentuk
filamentum branchiale (menunjukkan telah terjadi
pencemaran berat).
Pada banyak uji toksisitas dan kajian tentang pencemaran air sering ditemukan
terjadinya perubahan sitologik berupa terjadinya degenerasi (perubahan struktur) dan
kematian sel. Fase-fase degenerasi dan kematian sel yang sering terlihat pada organ
atau jaringan tubuh organisme yang telah terpapar
Universitas Gadjah Mada
bahan kimia toksik atau bahan pencemar lainnya meliputi perubahan-perubahan
berikut (Price dan Wilson 1984):
1.
Pembengkakan sel. Pada fase pembengkakan sel, sitoplasma sel yang
mengalami pembengkakan (cloudy swelling) terlihat granuler. Hal ini disebabkan
sewaktu air tertimbun dalam sitoplasma, organella sitoplasmatik juga menyerap
air sehingga dapat terjadi pembengkakan mitokondria, pembesaran retikulum
endoplasma dan lain-lain. Jika terjadi masukan air yang besar, sebagian
organella seperti retikulum endoplasma dapat berubah menjadi kantong-kantong
berisi air sehingga sitoplasma terlihat bervakuola. Perubahan semacam itu
disebut perubahan hidropik atau perubahan vakuoler.
2.
Degenerasi lemak (fatty degeneration). Fase kedua degenerasi sel ini merupakan
akibat lebih lanjut dari pembengkakan sel dan sering disebut sebagai infiltrasi
lemak. Akibat adanya penimbunan intraseluler, sitoplasma tampak bervakuola
dengan mekanisme sangat mirip dengan yang terjadi pada perubahan hidropik
tetapi vakuola tersebut berisi lemak.
3.
Kematian sel (necrosis). Setelah terjadi pembengkakan sel dan degenerasi
lemak, fase berikutnya yaitu kematian sel atau nekrosis. Walaupun perubahan
yang terjadi dalam jaringan nekrotik dapat melibatkan sitoplasma tetapi yang
paling jelas terlihat mengalami perubahan yaitu inti sel (nukleus).
a.
Piknosis
ditandai dengan nukleus mengkerut, batas nukleus tidak
beraturan sehingga bentuk nukleus juga menjadi tidak
beraturan dan terjadi kondensasi butir-butir kromatin menjadi
satu globulus;
b.
Karyorrhexis : ditandai dengan nukleus pecah dan butir-butir kromatin
hancur menjadi pecahan-pecahan yang tersebar dalam sel;
c.
Karyolysis
: ditandai dengan butir-butir kromatin yang larut dan berdifusi melalui membran nukleus,
Universitas Gadjah Mada
4. Pengapuran (calcification), hanya dapat terjadi pada jaringan yang mampu mengikat
garam dapur (NaCI) atau kalsium (Ca) seperti matriks cartilaginous pada ujung
tulang yang sedang tumbuh dan jaringan osteoid yang baru dibentuk oleh
osteoblast. Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi pengendapan kalsium yaitu
keadaan patologik jaringan serta kadar garam kalsium dalam darah.
Gambar berikut menunjukkan kronologi kematian sel atau necrosis yang dapat terlihat
dengan jelas pada terjadinya perubahan pada inti sel (nukleus):
Universitas Gadjah Mada