pembentukan benzil penisilin dengan senyawa
advertisement
83 FORMATION OF BENZYL PENICILLYN USING INTERMEDIATE COMPOUNDS OUTSIDE MORE PERMEABLE CELLS OF PENICILLIUM CHRYSOGENUM ATCC 26818 Refdinal Nawfa‡ ABSTRAK Benzil penisilin adalah salah satu jenis antibiotika -laktam. Proses biosintesis benzil penisilin di dalam sel Penicillium chrysogenum melibatkan tiga senyawa intermediet yaitu L-Valin, L-Sistein, dan α-aminoadipat yang disintesis dari glukosa. Pada penelitian ini dicoba menggunakan senyawa intermediet tersebut tanpa melalui biosintesis di dalam sel yaitu dengan menambahkannya di luar sel P. chrysogenum ATCC 26818 untuk membentuk benzil penisilin dengan prekursor asam penil asetat. Hasil penelitian yang telah dilakukan menunjukkan P. chrysogenum ATCC 26818 yang telah lebih dipermiabilisasi dapat menghasilkan antibiotika dengan menggunakan senyawa intermedietnya di luar sel. Hasil penelitian ini juga mengungkapkan bahwa tanpa penambahan αaminoadipat, antibiotika dapat dihasilkan. Diduga karena penambahan asam fenil asetat yang bersamaan dengan senyawa intermediet L-sistein dapat langsung berikatan sehingga α-aminoadipat peranannya dalam pembentukan benzil penisilin di dalam sel telah digantikannya. Kata kunci: benzil penisilin, intermediet, permiabel. ABSTRACT Benzyl penicillyn is a member of the -laktam antibiotics. Biosynthesis of the antibiotic in a Penicillium chrysogenum cell involves three intermediate compounds, i.e. L-valin, L-Cystein and α-aminoadipic acids which can be synthesised from glucose. This research used the intermediate compounds without biosynthesis within the cells to produce benzil penicilin antibiotics with phenyl acetate as a precursor. Results of the research showed that P. chrysogenum ATCC 26818 can produce antibiotic after the cells are more permeabilized. The research also showed that the antibiotics can be produced without the addition of -aminoadipic acid. The role of α-aminoadipic acid in antibiotic benzil penicilin synthesis can be replaced by the addition of phenylacetic acid. Keywords: benzyl penicillin, intermediate compounds, permeabilized. 1. PENDAHULUAN Sampai saat ini Indonesia masih kekurangan dalam penyediaan bahan baku untuk pembuatan obat, khususnya obat-obat yang berfungsi sebagai anti mikroba atau dikenal juga dengan obat antibiotika. Untuk mengatasi keadaan ini Indonesia melakukan kerja sama dengan negara lain, baik dalam bentuk barang jadi maupun dalam bentuk setengah jadi, dalam hal ini penyediaan bahan baku untuk pembuatannya. Adanya ketergantungan ini dapat menimbulkan masalah bagi Indonesia baik dalam bidang ekonomi maupun dalam bidang politik. Untuk mengatasi masalah ketergantungan ini, dapat diatasi dengan berbagai upaya seperti menguasai teknologi yang telah ada dan metoda yang digunakan untuk pembuatannya yang disesuaikan dengan yang ada di Indonesia. Untuk tercapainya usaha ini maka perlu dilakukan penelitian-penelitian yang mendukung untuk tujuan produksi dan penggunaan metoda yang baik. Salah satu dari sekian banyak antibiotika yang dibutuhkan sampai saat ini, yang paling banyak digunakan adalah dari golongan penisilin. Selain lebih efektif juga lebih aman atau tidak toksik meskipun dapat menimbulkan alergi pada orangorang tertentu yang disebabkannya. Penisilin pertama kali ditemukan pada tahun 1929 oleh Alexander Fleming yang merupakan hasil metabolit sekunder dari jamur Penicillium notatum. Selanjutnya Jarvis dan Johnson (1950) yang kemudian dilanjutkan oleh Dewey dan Hospotka (1980) yang melakukan penelitian untuk membuat penisilin dengan melakukan cara fermentasi dari jamur P. chrysogenum yang digunakannya. Perkembangan lebih lanjut dari pembuatan penisilin dilakukan oleh Murikawa dkk. (1979) dan Deo dan Gaucher (1984) menggunakan metoda sel amobil dengan kappa karagenan sebagai matriknya. Metode ini menghasilkan banyak keuntungan bila dibandingkan dengan metode sebelumnya yang menggunakan biakan sel cair. Salah satu keuntungannya adalah menghasilkan produk yang lebih banyak dari metode sebelumnya. Penelitian ini juga telah dicobakan oleh Nawfa (1988) yang menggunakan akrilamida sebagai matriknya. Penggunaan sel untuk memproduksi penisilin ini dilakukan dalam keadaan sel utuh, dengan semua proses biosintesis senyawa antara (intermediet) dan penggabungan senyawa ini yang terjadi untuk pembentukan penisilin berlangsung di dalam sel P. chrysogenum penghasilnya yang diproduksi dalam jumlah E-mail: [email protected] Jurusan Kimia, FMIPA ITS, Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya (60111) ‡ Vol. 16, No. 3, Agustus 2005 - Majalah IPTEK 84 terbatas. Cooney dan Acevedo (1977) telah melaporkan jalur yang dilalui pada proses biosintesis benzil penisilin di dalam sel mikroba penghasilnya. Jalur biosintesis tersebut adalah perubahan glukosa dari nutrisinya menjadi senyawa antara (intermediet) berupa senyawa LAmino adipat, L-Sistein dan L-Valin. Adanya senyawa antara yang sudah diketahui tersebut maka pada penelitian ini dicoba menggunakan senyawa tersebut tanpa melalui biosintesis di dalam sel tetapi disediakan di luar sel. Untuk mempermudah senyawa ini masuk ke dalam sel P. chrysogenum maka selnya dijadikan dalam bentuk lebih permiabel. Akibat proses permiabel yang dilakukan sel P. chrysogenum menjadi mati karena senyawa metabolit primer yang ada di dalam sel ikut keluar dari dalam sel tetapi senyawa makromolekul seperti DNA dan enzim (protein) yang berperan untuk pembentukan penisilin tetap ada di dalamnya. Bila benzil penisilin dapat terbentuk maka akan dapat menghasilkan penisilin dengan jumlah yang tidak terbatas karena enzim yang ada dalam sel dapat digunakan berkali-kali (enzim dalam keadaan amobil oleh selnya sendiri). 2. PERCOBAAN 2.1 Melakukan uji kemampuan sel P.chrysogenum ATCC 26818 untuk menghasilkan antibiotika dan menentukan bentuk kurva pertumbuhannya Spora yang diperoleh dari pertumbuhan P.chrysogenum ATCC 26818 pada media agar miring disuspensikan dengan menggunakan larutan fisiologis NaCl 0,5 %. 2,0 ml suspensi spora dimasukan ke dalam 100 ml medium pertumbuhannya dan diinkubasi dengan menggunakan pengocok pada suhu 27C. Dilakukan penyamplingan setiap 24 jam inkubasi dan ditentukan berat basah biomassanya. Pada kondisi fase stasioner yang diperoleh dilakukan uji kandungan antibiotikanya dengan mengambil medium cair hasil fermentasi selanjutnya diuji dengan cara biokimia menggunakan Staphylcocus aureus sebagai mikroba penguji. 2.2 Metoda pengujian kandungan antibiotika benzil penisilin secara biokimia Untuk mengetahui kandungan antibiotika di dalam suatu larutan digunakan metode uji secara biokimia yaitu menggunakan bakteri S. aureus sebagai mikroba pengujinya. Cara pengujiannya adalah sebagai berikut; Cawan petri yang steril diisi dengan suspensi bakteri S.aureus yang diperoleh dari pertumbuhannya pada agar miring. Kemudian dilakukan penggoyangan agar Majalah IPTEK - Vol. 16, No. 3, Agustus 2005 seluruh bakteri membasahi permukaan dasar dari cawan petri. Selanjutnya ditambahkan media pertumbuhannya berupa agar padat yang telah dicairkan (suhu 35oC) dan digoyang-goyang supaya bakteri tercampur homogen dengan media yang ditambahkan. Selanjutnya campuran dibiarkan membeku dan setelah itu pada permukaannya diletakan kertas dis yang berupa lingkaran yang digunakan sebagai tempat larutan yang mengandung antibiotika yang akan diuji. Setelah larutan diteteskan pada kertas dis dilakukan inkubasi pada suhu 30C selama 24 jam. Uji dikatakan positif bila diperoleh daerah bening di sekitar kertas dis. 2.3 Melakukan permiabel sel P. chryso- genum ATCC 26818 Sel P. chrysogenum yang diperoleh pada keadaan stasioner diambil dan dipermiabel dengan metoda yang dikemukakan oleh Kazuhiko dan Kozo (1995) yaitu: 1,0 gram biomassa ditambah campuran 30 mM MES dan 2 mM EDTA, diinkubasi selama 5 menit pada suhu 30C. Untuk mempermiabilisasi ditambahkan campuran etanol dan toluen (konsentrasi akhir 4% dan 1%) dan 0,075% SDS lalu diinkubasi selama 5 menit pada suhu 30oC. Untuk mengetahui sel telah permiabilisasi dilakukan uji terhadap sel yang sudah dipermiabel dengan melakukan fermentasi pada media untuk menghasilkan antibiotika. Sel telah permiabel ditunjukkan dengan tidak menghasilkan antibiotika setelah difermentasikan pada medium produksinya. 2.4 Uji sel P.chrysogenum permiabel untuk menghasilkan antibiotika dengan menggunakan senyawa intermediet di luar sel Sel P. chrysogenum yang permiabel diinkubasikan dengan campuran 15 mM MgCl2, 2mM ATPNa2, 1 mM NADP, 1 mM FAD, 50 mM LValin, 50 mM L-Sistein, 50 mM asam aminoadipat dan 50 mM asam Fenil asetat. Untuk mengetahui peranan α-aminoadipat pada proses pembentukan benzil penisilin, inkubasi dilakukan pada media yang tidak mengandung asam aminoadipat. Setelah diinkubasi selama 15 jam dilakukan uji kandungan antibiotikanya secara biokimia menggunakan Staphylococus aureu. 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil dari penentuan kurva pertumbuhan P.chrysogenum ATTC 26818 diperlihatkan pada Gambar 2 berikut ini; 85 Kurva Pertumbuhan 1 Berat Biomassa ( gram) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Waktu ( hari ) Gambar 2. Bentuk kurva pertumbuhan P. chrysogenum ATCC 26818. Pada kurva pertumbuhan Gambar 2, terlihat setelah 24 jam inkubasi telah terbentuk biomassa dari sporanya dan 48 jam kemudian terjadi sedikit penambahan berat biomassa yang menunjukan telah terjadi pertumbuhan yaitu fase pertumbuhan diperlambat. Pada jam ke 94 (hari ke-4) terlihat penambahan biomassanya semakin besar dan membentuk garis lurus sampai inkubasi 166 jam (hari ke-7), fase ini dikenal dengan fase pertumbuhan dipercepat (fase eksponensial) dan pada jam ke 190 (hari ke-8) terlihat kecepatan penambahan berat biomassa menurun. Keadaan ini dikenal dengan fase stasioner dan 24 jam kemudian (hari ke-9) terjadi penurunan berat biomassa yang mengarah ke fase kematian. Hal ini terjadi karena kandungan nutrisinya mulai menipis sehingga sudah ada sel yang mati (lisis). Pada kurva pertumbuhan ini terlihat fase stasioner diperoleh pada jam ke 190 (hari ke-8) sehingga pada fase ini terhadap medium hasil fermentasinya dilakukan uji kandungan antibiotikanya. Ini dapat dilihat pada Gambar 3. Pada kertas dis yang ditetesi dengan medium hasil fermentasi P. chrysogenum terdapat daerah bening di sekitar kertas dis, ini disebabkan karena tidak dapatnya bakteri S. aureus tumbuh akibat adanya cairan yang mengandung antibiotika penisilin yang menghibisi dan menghalangi proses biosintesa pada pembentukan dinding selnya sehingga sel tidak dapat tumbuh dan memperlihatkan daerah bening di sekitar kertas dis yang diteteskan. Hal yang sama juga diperlihatkan oleh cairan mengandung antibiotika penisilin standar yang digunakan sebagai kontrol. Gambar 3. Foto hasil uji kandungan antibiotika penisilin P. chrysogenum ATCC 26818. Keterangan: A = kertas dis yang ditetesi benzil penisilin standar B = kertas dis yang ditetesi dengan medium hasil fermentasi C = Sel P.Crysogenum Adanya sel P. chrysogenum ATCC 26818 pada fase stasioner ini menghasilkan antibiotika maka selanjutnya sel diambil dan dijadikan permiabel dengan menggunakan campuran pelarut etanol dan toluen dan SDS terlihat untuk sel yang telah dipermiabel terjadi perubahan penampakan warnanya yang sebelum dipermiabel bewarna kekuningan dan setelah dipermiabel berubah jadi warna putih. Hal ini juga terlihat pada larutan yang digunakan pada waktu permiabel yang semula bewarna jernih berubah jadi warna kuning kebiruan yang menandakan adanya senyawa kimia yang berasal dari dalam sel P. chrysogenum yang terekstrak ke dalam pelarut yang digunakan. Dinding sel yang dibentuk oleh senyawa peptidoglikan yang menggabungkan N-asetil muramik dengan N-asetil glukosamin dan ikatan lima glisin dengan penta peptida lainnya membentuk suatu jaringan yang melindungi membran sel yang ada di dalamnya. Adanya penambahan campuran pelarut etanol dan toluen akan dapat mengekstrak protein pembentuk membran sel seperti protein peripheral dan protein integral yang biasanya berfungsi untuk transfer nutrisi diluar sel ke dalam sel dan natrium dodesil sulfat akan dapat mengemulsikan lipid membran sehingga dapat membuat dinding sel jadi lebih permiabel. Terjadinya sel yang lebih permiabel ini juga mengakibatkan molekul-molekul kecil seperti ATP, NADP, FAD senyawa-senyawa intermediet yang sudah disintesa pada waktu pembentukan sel termasuk juga senyawa L-Valin, L-sistein dan α-amino adipat pembentuk penisilin yang sudah ada di dalam sel juga akan keluar sehingga memberikan warna pada larutan hasil permiabel yang dilakukan. Vol. 16, No. 3, Agustus 2005 - Majalah IPTEK 86 Untuk membuktikan sel menjadi permiabel juga telah dicobakan dengan memfermentasikan sel hasil permiabel pada media pertumbuhannya yang menunjukkan sel tidak dapat tumbuh dan tidak dapat menghasilkan antibiotika setelah dilakukan uji secara biokimia menggunakan Staphylococus aureus. P.chrysogenum ATCC 26818 yang telah permiabel setelah dilakukan uji untuk menghasilkan antibiotika dengan menggunakan senyawa intermedietnya di luar sel menunjukan sel mampu menghasilkan antibiotika. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 4. 4. SIMPULAN DAN SARAN Dari hasil penelitian ini dapat diambil kesimpulan sebagai berikut: Jamur P.chrysogenum ATTC 26818 yang digunakan dapat menghasilkan antibiotika dengan fase stasioner dicapai pada hari ke-8. Jamur P.chrysogenum ATCC 26818 selnya dapat dijadikan lebih permiabel dengan perlakuan campuran etanol dan toluen (4:1) dengan 0,5 ml SDS. Jamur P.chrysogenum ATTC 26818 yang permiabel dapat menghasilkan antibiotika dengan menambahkan senyawa intermediet L- valin, Lsistein, L-aminoadipat dan fenil asetat sebagai prekursor benzil penisilin di luar sel. Antibiotika benzil penisilin dapat dibuat dengan tanpa penambahan senyawa intermediet α-aminoadipat secara sel yang dipermiabel, dengan penambahan asam fenilasetat dan L-sistein Pada penelitian ini disarankan untuk melakukan penelitian lebih lanjut untuk memisahkan antibiotika benzil penisilin yang diperoleh dan menentukan struktur untuk membuktikan yang terbentuk adalah benzyl penisilin. Gambar 4. Foto Hasil uji kandungan antibiotika penisilin yang dihasilkan P.chrysogenum ATCC 26818 permiabel. UCAPAN TERIMA KASIH Peneliti banyak mengucapkan terima kasih pada Direktur Jenderal Perguruan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional Indonesia atas pembiayaan penelitian ini. Keterangan: A = Benzil penisilin standar. B = Substrat (media sebelum fermentasi) C = Hasil fermentasi dengan substrat tanpa L- -aminoadipat D = Hasil fermentasi dengan substrat mengandung L- -aminoadipat Hasil uji secara biokimia yang menggunakan mikroba S.aureus terlihat kertas dis yang ditetesi dengan benzil penisilin standar memberikan daerah bening disekitar kertas, sedangkan kertas dis yang ditetesi dengan medium sebelum fermentasi tidak memberikan daerah bening yang digunakan sebagai kontrol untuk uji ini. Hasil kandungan antibiotika pada medium tanpa penambahan dan penambahan senyawa intermediet α-aminoadipat hasil inkubasi menunjukan adanya kandungan antibiotika penisilin yang dihasilkan. Adanya hasil ini diduga adanya peranan senyawa intermediet αaminoadipat pada sintesa benzil penisilin di dalam sel telah digantikan oleh asam fenil asetat yang ditambahkan. Penambahan asam fenil asetat yang bersamaan dengan senyawa intermediet sistein diduga dapat langsung berikatan dan menggantikan peranan aminoadipat pada biosintasa benzil penisilin. Majalah IPTEK - Vol. 16, No. 3, Agustus 2005 DAFTAR ACUAN Cooney, C.L. dan Acevedo, F. (1977), Biotechnology and Bioengineering, Vol. XIX. Demain, A.L. (1967), Biosyntesis of Antibiotics, Vol 1, J.Snell, Ed Academic, New York. Deo, Y.M. dan Gaucher, G.M. (1984), Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXVI. Dewey, D.Y.R. dan Hospotka, S. (1980), Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXII. Jarvis, F.G. dan Johnsosn, M.J. (1950), J.Am.Chem.Soc., Vol. 69. Kazuhiko, T. dan Kozo, O. (1995), Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. LXXIX. Murikawa, Y., Karube, I. dan Suzuki, S. (1979), Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXI. Murikawa, Y., Karube, I. dan Suzuki, S. (1980), Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXII. Nawfa, R. (1988), Produksi Penisilin dengan Teknik Amobilisasi Sel P.chrysogenum, Tesis, ITB, Bandung. Diterima: 25 Januari 2005 Disetujui untuk diterbitkan: 28 Juli 2005
