TES PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN

TES PRAKTIKUM
BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER
Olimpiade Sains Nasional (OSN) XIV
1-7 September 2014, Mataram, Nusa Tenggara
Barat
Part A: Identifikasi plasmid dan elektroforesis DNA
Part B: Analisis pertumbuhan sel
Waktu : 80 Menit
NAMA
SEKOLAH
KELAS
Part A: Identifikasi plasmid dan elektroforesis DNA
Pengantar
Setelah berhasil memperoleh medali emas di IBO 2014, Valen memperoleh
kesempatan gratis melakukan internship di Lab Prof. Tobi. Saat ini Lab Tobi
sedang mengembangkan proses produksi senyawa anti jamur (tobisilin) dari
salah satu bakteri tanah yang terkenal susah dikultur dengan memindahkan
gen penghasil protein untuk sintesis senyawa tobisilin dari bakteri tersebut
(selanjutnya disebut gen X) ke E.coli. Pemindahan gen ke E.coli dimaksudkan
untuk proses produksi yang lebih cepat dan murah.
Valen diminta melakukan proses PCR untuk isolasi gen X dan mengklonnya
ke plasmid pRT (mengandung gen untuk resistensi ampisilin, dan kompatibel
untuk screening biru putih ketika terinsersi oleh gen asing) dengan bantuan
reaksi restriksi dan ligasi. Campuran DNA hasil ligasi selanjutnya
ditambahkan ke sel E.coli kompeten, dan seleksi resistensi ampisilin serta
screening biru putih digunakan untuk mengisolasi koloni E.coli transforman
yang mengandung plasmid pRT-gen X.
Pada praktikum ini anda diminta membantu Valen untuk melakukan salah
satu uji konfirmasi bahwa koloni transforman yang ia isolasi benar
mengandung plasmid pRT-gen X. Konfirmasi dilakukan dengan
menggunakan analisis restriksi dan elektroforesis DNA dari isolat plasmid
yang diperoleh dari kultur transforman.
BamHI
750 bp (gen X)
2850 bp
Plasmid pRT-genX
3600 bp
HindIII
Gambar 1. Plasmid pRT-genX
Tugas dan petunjuk:
1. Waktu ujian adalah 80 untuk part A dan part B
2. Tulis jawaban anda dengan menggunakan pulpen/pena di Lembar
Jawaban yang telah disediakan
3. Lengkapi identitas anda pada lembar soal/jawaban di awal pekerjaan.
Anda dilarang keras bekerja ketika waktu ujian telah selesai. Peserta
yang masih tetap melanjutkan pekerjaan akan memperoleh nilai 0
pada ujian biologi sel dan molekuler
4. Pada tes praktikum ini anda diminta untuk:
- Menyiapkan reaksi restriksi
- Mengelektroforesis sampel DNA hasil restriksi
Menyimpan gel agarose hasil elektroferesis untuk dapat
dikumpulkan dan dinilai oleh asisten
- Menjawab soal teori part B
5. Bagian Protokol berisi metode penyiapan reaksi restriksi dan
elektroforesis DNA
6. Untuk menyalakan alat elektroforesis anda akan dibantu oleh asisten.
JANGAN menyalakan alat oleh anda sendiri.
7. BERHATI-HATILAH dalam bekerja.
- Volume sampel yang diberikan sangat terbatas. Teliti dalam
mengambil dan memindahkan larutan, dan bedakan penggunaan
teknik pipetting menggunakan tombol stop 1 dan stop 2.
- Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 Volt. JANGAN sekalikali memasukkan tangan anda ke dalam gel chamber ketika
elektroforesis sedang berlangsung
-
Penilaian
- Kesesuaian Pita DNA hasil elektroforesis (Nilai 50): Ladder (Nilai @
5), Uncut (Nilai 10), Single cut dengan Bam HI (15), Double cut dengan
BamHI dan HindIII (Nilai 15)
- Tes teori (Nilai 50)
Alat dan Bahan
Bahan
restriction endonucleases RE1 (BamHI) (disimpan dalam kotak es)
restriction endonucleases RE2 (HindIII) (disimpan dalam kotak es)
10X Restriction buffer solution (dilabel B) (disimpan dalam kotak es)
Sampel larutan plasmid (dilabel 1) (disimpan dalam kotak es)
Sterile water (dilabel W) (diletakkan di rak mikrotube)
Gel red-DNA staining solution (dilabel S; di dalam mikrotube berwarna
hitam) (diletakkan di rak mikrotube)
DNA ladder stock solution (dilabel L) (size markers for 75-20,000 bp
range. (disimpan dalam kotak es)
Equipment
DNA electrophoresis gel tank dan power supply (1 power supply untuk 2
participants)
micropipettes dan tips in boxes (p10, p200)
Stopwatch
Ready gel agarose (diletakkan di dalam plastik box
Running buffer
Rak mikrotube
Mikrotube steril
Plastic box (untuk menyimpan gel setelah elektroforesis)
Water bath 37ºC (terdapat dua pada tiap ruangan. Anda akan dibantu oleh
asisten untuk meletakkan dan mengambil sampel ke dan dari Waterbath)
Quantity
1 (5 L)
1 (5 L)
1 (8 L)
3 (5 L)
1 (500 L)
Unit
tube
tube
tube
tube
tube
1 (100 L)
tube
1 (20 L)
tube
1
set
2
1
1
1 (300 mL)
1
3
1
pieces
piece
piece
bottle
piece
pieces
piece
1
set
Floating rack styrofoam
Micro-centrifuge. Untuk spin down dan pencampuran larutan
Pulpen marker (permanent ink)
Kartu Meja
Kertas Label
1
1
1
1
1
Protokol:
I.
Penyiapan reaksi restriksi
1) Untuk melakukan identifikasi plasmid menggunakan analisis
restriksi, anda diminta untuk membandingkan ukuran DNA pRTgen X hasil elektroforesis antara yang tidak dipotong, dipotong
dengan satu enzim restriksi, dan dipotong dengan dua enzim
restriksi. Siapkan sampel larutan DNA anda yang akan
dipisahkan dengan elektroforesis, berdasarkan tabel komposisi
larutan di bawah ini. Sebelum bekerja lakukan spin down pada
bahan enzim dan buffer yang diberikan untuk mengoleksi
semua volume larutan dibagian dasar mikrotube.
No.
1
2
3
4
5*
Sampel larutan DNA
Uncut Single cut Double cut
Sterile water
8
7
6
10 X Restriction buffer solution
1*
1
1
DNA Plasmid
1
1
1
BamHI
0
1
1
HindIII
0
0
1
Total volume
10
10
10
Reagent
l
a
*larutan buffer restriksi ditambahkan karena mengandung komponen yang berfungsi
sebagai loading dye, untuk membantu DNA bisa diload ke dalam sumur gel
electrophoresis
2) Letakkan sampel reaksi restriksi anda pada floating rack
styrofoam dan angkat Kartu Meja Anda untuk meminta asisten
menempatkan sampel anda didalam waterbath incubator 37 oC.
inkubasi dilakukan selama 10 menit. setelah selesai, angkat
kembali kartu anda untuk meminta asisten mengembalikan
sampel ke meja anda
3) Tambahkan hanya 1 μL larutan Gel red-DNA staining masingmasing ke dalam sampel larutan DNA uncut, single cut dan
double cut; dan hanya 2 μL larutan Gel red-DNA staining ke
dalam larutan DNA ladder stock. lakukan spin down singkat
untuk mencampur larutan DNA anda dengan larutan DNA
staining. Sampel larutan ini selanjutnya anda gunakan untuk
running elektroforesis
piece
set
piece
piece
piece
II.
Elektroforesis DNA
1) Letakkan gel agarose anda ke dalam tangki elektroforesis.
Tuangkan seluruh running buffer ke dalam tangki, hingga
merendam gel elektroferesis anda
2) Masukkan masing-masing 10 μL larutan sampel DNA dan
ladder stock ke dalam sumur elektroforesis dengan skema
seperti dibawah ini
DNA
Ladder
Uncut
Single
Cut
Double
Cut
DNA
Ladder
3) Tutup tangki elektroforesis, sambungkan kabel lead dari tangki
anda ke power supply (sesuai masing-masing warna), dan
angkat kartu meja anda untuk meminta bantuan asisten
menyalakan alat elektroforesis. Hitung waktu elektroforesis
selama 30 menit, dan jika telah selesai angkat kembali kartu
anda untuk meminta asisten mematikan alat. Sambil menunggu
elektroforesis anda dapat mengerjakan soal Part B
III.
Penyimpanan sampel agar
1) Setelah kabel lead dari tangki elektroforesis anda dilepaskan
dari power supply, angkat dan pindahkan gel anda pada plastic
box yang disediakan (sebelumnya juga digunakan untuk
menyimpan gel agarose).
2) Tutup plastic box. Tulis Nama lengkap dan No. peserta anda
secara jelas di kertas label, selanjutnya tempel dibagian
samping dari plastic box. Gel yang tidak disimpan pada kotak
plastic dan tidak diberi label identitas tidak akan dinilai
Part B : Analisis pertumbuhan sel
Pada banyak kasus, ekspresi gen rekombinan dapat menurunkan
pertumbuhan organisme inang jika dibandingkan dengan yang tidak
ditransformasi dengan vektor dan gen asing. Informasi kecepatan
pertumbuhan ini nantinya dapat digunakan untuk merancang lebih jauh
kondisi kultivasi yang cocok untuk produksi produk tertentu oleh organisme
tersebut. Untuk memperoleh preliminary data karakteristik pertumbuhan sel
E.coli hasil transformasi dengan plasmid pRT-Gen X Prof. Tobi melakukan
percobaan di bawah ini.
I. Pengaruh kehadiran gen X pada pertumbuhan sel E.coli strain Top1
(high level of recombinant gen expression, unusual cell size)
Kultur starter E.coli transforman pRT-gen X dan non-transforman
diinokulasikan pada medium agar pertumbuhan dengan menggunakan
metode spread. Pengamatan yang dilakukan 8 jam setelah inokulasi awal
menunjukkan adanya 91 colony forming unit (CFU) pada cawan petri A yang
mengandung E. coli non-transforman dan 17 CFU pada cawan petri B yang
mengandung E. coli transforman. CFU merupakan satuan ukuran populasi
bakteri pada media padat, setiap koloni bakteri yang jelas terpisah dari koloni
lainnya dihitung sebagai satu CFU. Koloni bakteri ini awalnya berasal dari
satu sel bakteri yang mengalami pembelahan terus-menerus menghasilkan
sekumpulan bakteri dalam satu koloni.
Di akhir inkubasi, diamati kultur sel E. coli memenuhi cawan petri A dan B
berturut-turut setelah 24 dan 36 jam. Metode penghitungan plate count yang
menggunakan metode pengenceran berseri dilakukan untuk mengetahui
jumlah sel yang ada didalam kedua cawan petri tersebut di akhir pengamatan.
Berikut adalah cara kerja praktikum yang diberikan oleh Prof. Tobi untuk
metode pengenceran berseri :
Alat dan Bahan :
1. 10 buah tabung reaksi
2. 4 buah cawan petri berisi agar LB (media padat pertumbuhan bakteri,
diameter 100 mm)
3. 50 ml larutan M9 (garam fisiologis, media cair pertumbuhan bakteri)
4. Pipet tetes
5. Pemanas spiritus
6. Pipet sedotan
7. Vortex
Metode :
1. Siapkan 6 tabung reaksi. Isi tube 1 dengan 5 ml larutan M9. Isi tube 2 –
6 dengan 4.5 ml larutan M9.
2. Ambil bakteri yang terdapat pada area seluas 1 mm x 1 mm pada
permukaan agar di cawan petri. Masukkan ke dalam tube 1.
Homogenisasi hingga merata menggunakan vortex.
3. Ambil 0.5 ml larutan pada tube 1 dan masukkan ke dalam tube 2.
Homogenisasi hingga rata.
4. Lakukan langkah 3 untuk tube 3 hingga 6.
5. Inokulasi cawan petri pertama dengan mengambil 1ml larutan di dalam
tube 3. Tuang larutan kedalam cawan petri dan sebarkan hingga
merata.
6. Ulangi langkah 5 untuk cawan petri kedua, ketiga dan keempat,
masing-masing menggunakan larutan dari tube 3 – 6.
7. Diamkan kultur pada suhu ruangan. Hitung jumlah CFU yang
terbentuk.
Setelah masa inkubasi 8 jam, didapatkan hasil sebagi berikut :
Cawan A1
(dari tube 3)
Cawan A2
(dari tube 4)
Cawan A3
(dari tube 5)
Cawan B1
(dari tube 3)
Cawan B2
(dari tube 4)
Cawan B3
(dari tube 5)
Cawan A4
(dari tube 6)
Cawan B4
(dari tube 6)
Secara statistik, jumlah CFU yang baik untuk digunakan dalam menghitung
jumlah sel adalah antara 30-300. Jika CFU terlalu banyak sehingga tidak
dapat dibedakan secara jelas dan dihitung jumlahnya secara pasti, maka
jumlah CFU dianggap lebih besar daripada 300.
Q 2.1 (4 poin @ 0.5 point) Berdasarkan hasil pengamatan diatas, lengkapi
tabel yang terdapat pada Lembar Jawaban.
*Pengenceran dihitung relatif terhadap sel pada kultur tabung reaksi 1,
sehingga tingkat pengenceran dapat dihitung sebagai:
𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑙 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑒 1
𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑙 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑒 𝑥
Q 2. 2 (2 point) Berdasarkan hasil plate count, berapakah jumlah sel total
yang terdapat pada cawan petri? (asumsikan π = 3)
Q 2.3 (2 point) Hitung dalam menit waktu yang dibutuhkan oleh sel E.coli
pada cawan A dan B untuk membelah.
Q 2.4 (8 point @ 0.5) Lengkapi grafik pertumbuhan sel bakteri pada Lembar
Jawaban yang menujukkan konsentrasi sel setiap 3 jam.
Q 2.6 Tentukan pernyataan dibawah ini Benar (B) atau Salah (S) berdasarkan
pengaruh ekspresi Tobisilin terhadap pertumbuhan bakteri
No Pernyataan
Waktu generasi E. coli yang membawa plasmid pRT-Gen X lebih lama
1
dibanding E. coli non-transforman
Laju pertumbuhan spesifik E. coli yang membawa plasmid pRT-Gen X
2
lebih besar dibanding E. coli non-transforman
Jika bakteri E. coli non-transforman dan E.coli yang membawa plasmid
3
pRT-Gen X di tumbuhkan pada satu media kultur yang sama, maka
setelah 24 jam, anda tidak dapat lagi menemukan plasmid pRT-Gen X
di dalam kultur sel bakteri tersebut
II.Analisis Pengaruh Tobisilin pada Siklus Pembelahan Sel HeLa
Kemampuan Tobisilin untuk menginhibisi pertumbuhan organisme tangguh
(resilient) seperti jamur, membuat Prof. Tobi berpikir apakah Tobisilin dapat
juga digunakan untuk menginhibisi sel lain dengan kemampuan pertumbuhan
dan daya tahan yang tinggi seperti sel kanker. Prof. Tobi mencoba menyusun
percobaan terkait menggunakan flow cytometry dan menugaskan asistennya,
Hanna, untuk melakukan eksperimen tersebut.
Eksperimen menggunakan kultur sel HeLa (sel kanker manusia) yang selalu
membelah yang diberikan pewarna DAPI untuk berikatan dengan DNA sel
tersebut. Kultur sel diamati menggunakan mikroskop fluoresen. Hasil
pengamatan menemukan adanya 26 sel dengan DNA terkondensasi pada
kultur sel Hela tanpa Tobisilin dan hanya 23 pada kultur sel HeLa dengan
Tobisilin.
Setelah pengamatan dilakukan, kultur dilewatkan pada alat flow cytometer.
Flow cytometer adalah sebuah alat yang dapat menghitung jumlah sel yang
telah diwarnai. Flow cytometer bekerja dengan cara melewatkan sel satupersatu melalui sebuah pipa kapiler kecil yang hanya dapat dilewati oleh satu
sel. Sel dihitung dengan cara menyinari satu bagian pipa kapiler dengan
laser yang menyebabkan fluoresensi pada pewarna DAPI. Fluorensensi yang
dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi pewarna yang terdapat
dalam sel. Tabel dibawah menunjukkan jumlah sel yang didapatkan setelah
hasil penghitungan dengan flow cytometer:
Unit Fluoresensi Relatif
0
40
80
120
140
160
200
240
280
320
360
400
440
480
Jumlah Sel
HeLa
HeLa + Tobisilin
0
0
0
0
0
0
10
17
16
20
174
163
36
32
35
37
32
34
33
33
32
36
36
32
86
90
10
6
Q 3.1. Buat grafik jumlah fraksi sel (dalam persentase dari sel total) terhadap
unit fluoresensi relatif. Gambar grafik fraksi sel Hela dan fraksi sel Hela +
Tobisilin pada satu grafik yang sama. Gunakan lingkaran (O) untuk
menunjukkan fraksi sel Hela, dan kotak (☐) untuk menunjukkan fraksi sel
Hela + Tobisilin.
Q 3.2. Dengan menggunakan data dari grafik, tentukan pada unit fluoresensi
berapa sel dengan masing-masing fase dapat ditemukan.
Q 3.3 Tentukan lama fase sel jika diketahui lama siklus sel adalah 24 jam.
Q 3.4 Dari eksperimen ini, kesimpulan apa yang dapat ditarik tentang dampak
Tobisilin terhadap lama siklus sel HeLa? Beri tanda X pada jawaban yang
tepat!
No
1
2
3
Pernyataan
Tobisilin memperlambat siklus sel HeLa
Tobisilin mempercepat siklus sel HeLa
Tobisilin tidak mempengaruhi panjang siklus sel HeLa
X
IV. Kesimpulan
Q 4.1 Dari Q.1, Q.2 dan Q.3, organisme mana saja yang terpengaruhi siklus
selnya oleh Tobisilin? Beri tanda X pada jawaban sesuai
No
1
2
3
Organisme
Jamur
Bakteri
Hewan
X
Q 4.2 Sintesis zat mana saja dibawah ini yang mungkin menjadi target
aktifitas Tobisilin? Beri tanda X pada jawaban yang sesuai
B
A
C
D
Q 4.3 Menurut Anda, setelah melihat fakta-fakta diatas, alasan apa yang
paling tepat menggambarkan mengapa plasmid Tobisilin (pRT-gen X)
memiliki pengaruh yang diamati pada bakteri? Beri tanda X pada jawaban
yang sesuai
No
1
2
3
4
Pernyataan
Target Tobisilin adalah zat metabolit bersifat universal yang
terdapat pada sel jamur, bakteri dan hewan.
Tobisilin mendegradasi protein siklin pada sel eukariot dan
prokariot
Replikasi dan eksperesi Tobisilin pada sel E. coli
menyebabkan beban tambahan yang cukup besar pada
metabolism normal E. coli
Instabilitas struktural sitoskelet yang diakibatkan oleh
Tobisilin menyebabkan gangguan keseimbangan tekanan
osmotik pada E. coli
X