88 IDENTIFIKASI GEN BABI PADA MARSHMALLOW

ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
IDENTIFIKASI GEN BABI PADA MARSHMALLOW MENGGUNAKAN KIT
OLIPRO DALAM TEKNIK PCR DAN SOUTHERN HYBRIDIZATION PADA CHIP
Hefi Kurnia Sari*, Marlina1, Mutalib,S.A2, Islami, S.N1, Fitria,A1
1. Fakultas Farmasi, Universitas Andalas,Limau Manis, Padang, Indonesia 25162.
2. Fakulti Sains dan Teknologi, Universiti Kebangsaan Malaysia
Bangi, Malaysia 43600
ABSTRAK
Identifikasi gen babi pada (permen lunak) Marshmallow telah dilakukan dalam
penelitian ini. DNA spesifik diamplifikasi menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR).
Identifikasi kualitatif terhadap hasil amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan
elektroforesis gel agarosa. Metode Southern hybridization pada Chip digunakan untuk melihat
hasil pendeteksian secara jelas. Dalam metode ini sejumlah Olipro porcine KIT digunakan
untuk membantu proses pendeteksian. Hasil proses PCR dan Southern Hybridization pada
Chip menunjukkan bahwa semua sampel marshmallow tidak mengandung unsur babi.
Key Words: Marshmallow, Olipro porcine KIT, PCR, Southern hybridization,Chip.
PENDAHULUAN
Persaingan antar industri pangan
semakin ketat. Hal ini terlihat ketika
kebanyakan produsen berlomba-lomba untuk
menarik perhatian masyarakat dengan
menghasilkan produk baru atau produk lama
yang telah dimodifikasi dengan rasa baru.
Namun, untuk dapat meningkatkan penjualan
dan memperluas pemasaran diperlukan
kreativitas dalam menciptakan suatu produk
yang dapat diterima kehalalannya oleh
konsumen (Sartika, 1995).
Bahan
tambahan
yang sering
digunakan dalam proses produksi makanan
adalah gelatin. Penggunaan gelatin dalam
industri pangan saat ini cukup luas, mulai
dari makanan emulsi, pasta, permen lunak,
minuman hingga kapsul. Gelatin sampai saat
ini di Indonesia keberadaannya masih
didatangkan dari hasil impor. Tahun 2003,
Indonesia mengimpor lebih dari 6200 ton
gelatin dari berbagai negara (Perancis,
Jepang, India, Brazil, Jerman, Cina,
Argentina, dan Australia) (Pusat Data dan
Informasi Deperindag 2004).
Kondisi tersebut sangat meresahkan
masyarakat. Karena gelatin yang biasa
digunakan dalam industri pangan umumnya
berasal dari sapi atau babi. Di Indonesia,
gelatin dari babi dilarang penggunaannya
dalam suatu bahan atau produk pangan
karena kondisi kehalalannya dan berkaitan
dengan penduduk Indonesia yang mayoritas
beragama Islam. (Sartika, 1995)
Akhir-akhir ini terjadi kemajuan
teknologi yang pesat dalam bidang biologi
molekuler. Teknologi ini mempermudah
pengujian atau pendeteksian akan adanya
kontaminasi bahan lain diluar bahan aslinya
(Margawati & Ridwan, 2010). Metode yang
biasa
digunakan
berdasarkan
pada
pendeteksian
molekul
DNA
spesifik
menggunakan PCR (Polymerase Chain
Reaction) (Tanabe, et al., 2007).
Marshmallow merupakan salah satu
produk makanan terproses, dibuat dengan
pemanasan tinggi dan pH rendah. Akibatnya,
terjadi degradasi dan hidrolisis enzim pada
jenis produk terproses ini, sehingga membuat
kualitas DNA dalam produk terproses
menjadi rendah (Applewhite, et al., 2012).
Untuk itu dibutuhkan teknik pendeteksian
lanjutan untuk membantu sensitifitas kerja
alat PCR. Maka, pada penelitian ini dipilih
metode Southern hybridization sebagai
metode lanjutan. Dengan metode ini gen
yang terdapat dalam DNA sampel pada
88
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
surgical blade (Xinda®), alumunium foil,
pipet mikro (eppendorf®) 0,1-10 µl ; 10-100
µl; 100 -1000 µl,
timbangan digital,
perangkat elektroforesis (Elite 300®), gel
documentation system (Alpha Imager®),
freezer (Dairei®), ice box, kertas parafilm,
Bio chip (Olipro Biotechnology®), beaker
glass, falcon tube.
produk terproses dapat dideteksi dengan baik
(Sahilah, et al., 2012). Metode southern
hybridization ini menggunakan kit Olipro®
sebagai reagen dalam proses pendeteksian
sampel (Olipro, 2009).
Alat dan Bahan
Alat
Bahan
®
Mesin PCR (eppendorf ), oven
hibridisasi (Olipro Biotechnology®), Orbital
Shaker
(Labnet®),
tabung
eppendorf
®
(eppendorf ) 1.5 ml, tip eppendorf® (10 µl,
100µl,
1000µl),
vortex
(Felt®),
spektrofotometer
maestronano
(maestrogen®), sentrifugator (eppendorf®),
inkubator
autoklaf
(Hirayama®),
(Memmert®), Oven (panasonic®), gelas ukur,
erlenmeyer, tube PCR (eppendorf®),
collection tube (DNeasy® Tissue Kit
(QIAGEN®)),
QIAamp
Spin
column
(DNeasy®
Tissue
Kit
(QIAGEN®))
microcentrifuge tube, pisau pemotong steril/
Marshmallow, kontrol positif (DNA
babi), kontrol negatif (Nuckleas Free Water),
kit isolasi DNeasy® Tissue Kit (QIAGEN,
Hilden, Germany; buffer ATL, buffer AL,
proteinase k, buffer AW1, buffer AW2,
buffer AE), mastermix PCR Olipro® (primer,
dNTP, MgCl2, IC, dan buffer), DNA Taq
Polymerase, aquadest steril, DNA ladder
100bp (Pure Extreme®), loading dye (Pure
Extreme®), Ethanol 100 %, agarose powder,
ethidium bromide, Tris Acetate EDTA (TAE),
Reagen hibridisasi (Olipro®) dan DNA
removal (Oligon®).
METODE PENELITIAN
Amplifikasi PCR
Komponen PCR yang dibutuhkan
untuk proses ini yaitu reagen PCR mastermix
19,6 µl, Taq DNA polymerase 0,5 µl , DNA
template 10µl, dan NFW (nucleas free water)
19,9 µl. Total volume untuk komponen PCR
yang digunakan adalah 50 µl untuk setiap
sampel. Kontrol negatif menggunakan NFW
dan kontrol positif menggunakan DNA babi
masing-masing sebanyak 10 µl. Proses
amplifikasi PCR ini dilakukan sebanyak 47
siklus yang terdiri dari; pradenaturasi 95°C (5
menit), denaturasi 95°C (30 detik), annealing
(penempelan) pada 55°C (30 detik), extension
(pemanjangan) 72°C (30 detik), elongation
(pemanjangan akhir) 72°C 5 menit). Hasil
amplifikasi PCR dapat dilihat dengan teknik
elektroforesis, menggunakan gel agarosa 2,5
% dan buffer TAE 1x pada tegangan 100
Volt selama 39 menit. Untuk memudahkan
pengamatan, gel diwarnai dengan 0.5 µg/ml
Sampel
Empat jenis Marshmallow yang tidak
memiliki label halal dari MUI berasal dari
empat Supermarket yang terdapat di Kota
Padang. Sampel ini dikumpulkan pada bulan
November 2012.
Isolasi DNA
Isolasi DNA menggunakan kit
QIAGEN dengan jumlah total sampel yang
digunakan adalah 20 mg. Sampel di potong
kecil kemudian dimasukkan ke dalam 1,5 ml
tabung eppendrof. Uji kualitatif dilakukan
untuk melihat keberadaan DNA dalam
sampel dengan menggunakan analisis
spektrofotometer
(Maestrogen®). DNA
template disimpan pada suhu
-20°C.
89
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
didenaturasi dengan reagen ke dalam chip
(ketentuan sesuai protocol kit). Setelah itu,
dilihat hasil proses southern hybridization
menggunakan scanner olipro biotechnology®
(OLIPRO, MY) yang mengandung probe
target spesifik gen babi. Hasil positif
mengindikasikan sampel mengandung DNA
babi, hal ini ditunjukkan dengan terdapatnya
2 titik vertikal pada bagian tengah bawah
chip. Dalam chip titik internal control
mengindikasikan bahwa proses PCR dan
southern hybridization berjalan dengan baik.
larutan editium bromida selama 5-10 menit
dan dilihat gambarannya dengan DNA Gel
Documentation system. Pada foto dapat
dilihat pola pemisahan pita-pita DNA yang
panjang amplikonnya
diketahui, dimana
untuk DNA babi adalah 276 bp.
Southern Hybridization pada Chip
Pada teknik ini produk PCR
didenaturasi pada suhu 95°C selama 10
menit. Proses hibridisasi menggunakan
OLIPRO® Porcine Gene Chip (OLIPRO,
MY). Proses hibridisasi dilakukan dengan
pencampuran produk PCR yang telah
HASIL DAN DISKUSI
H) oleh reagen A. Senyawa biotin ini
memiliki afinitas tinggi untuk mengikat
avidin atau streptavidin alkalin fosfat (StrepAP) yang merupakan protein hasil isolasi
dari bakteri Streptomyces avidinii. Suhu
optimum pada oven hibridisasi menyebabkan
produk PCR yang telah berlabel biotin akan
berikatan dengan probe pada membran
nitroselulosa di dalam chip. Dimana probe ini
memiliki nukleotida yang homolog dengan
produk
PCR.
Dengan
penambahan
NBT/BCIP sebagai pewarna yang merupakan
substrat dan akan berikatan dengan enzim
strep-AP. Proses ini akan menimbulkan
perubahan warna pada membran dalam chip
menjadi ungu kebiruan (Olipro®, MY. 2009).
Hasil
amplifikasi
DNA
menggunakan
metode
PCR-southern
hybridization menunjukkan bahwa semua
sampel marshmallow yang di uji negatif
mengandung gen babi. Hal ini ditunjukkan
dengan tidak adanya pita DNA yang spesifik
sama atau sejajar dengan kontrol positif yang
digunakan berupa DNA babi pada 276 bp.
(Gambar 1) dan tidak adanya visualisasi spot
(gambar 2) pada 2 titik vertikal di bagian
tengah paling bawah chip, menandakan pada
sampel tidak terdapat gen babi.
Penampakan titik pada chip terjadi
ketika sequen DNA target pada produk PCR
diberi label dengan senyawa biotin (senyawa
berfluorosensi atau dikenal sebagai vitamin
M NC H1 H2 H3 H4 PC M
300
195
bp
bp
276
bp
90
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
Gambar 1. Hasil gel elektroforesis dari analisis DNA babi. Deteksi sampel menggunakan
PCR OLIPRO porcine kit. M; Marker (penanda ladder 100 bp); PC: kontrol
positif, NC: Kontrol negatif; H1-H4: Sampel negatif mengandung gen babi.
K(-)
K(+)
H1
H3
H4
H2
Gambar 2. Scan process Southern hybridization menggunakan chip (Olipro® porcine kit).
Dimana K(-): kontrol negatif, K(+): kontrol positif, H1-H4: sampel marshmallow.
Tabel 1. Hasil identifikasi pada ke empat sampel marshmallow menggunakan metode PCR
dan Southern hybridization pada Chip
Label
sampel
Jenis sampel
Marshmallow
PCR
H1
H2
H3
Marshmallow BBQ
Marshmallow manis
Marshmallow isi selai
(jam)
Marshmallow gula
-
Metode
Southern
hybridization
-
-
-
H4
akan membantu sensitivitas kerja alat PCR
terhadap proses pendeteksian.
Walaupun proses PCR merupakan
metode yang cepat dan simple, tetapi dengan
adanya metode southern hybridization ini
KESIMPULAN
Pendeteksian DNA babi menggunakan
metode PCR-southern hybridization ini akan
lebih menghasilkan sensitivitas deteksi yang
lebih baik.
UCAPAN TERIMA KASIH
penelitian ini serta Olipro Biotechnology
Sdn. Bhd untuk semua fasilitas lab dan
bimbingannya dalam penelitian ini.
Kami mengucapkan terima kasih kepada
UKM atas bantuan dana yang berasal dari
UKM (Fundamental Research Grant Schene),
Malaysia yang telah bersedia mendukung
91
ISSN: 2339-2592
Prosiding Seminar Nasional Perkembangan Terkini Sains Farmasi dan Klinik III 2013
REFERENSI
2012. Halal market surveillance of
soft and hard gel capsules in
pharmaceutical products using PCR
and southern hybridization on the
biochip analysis. International Food
Research Journal 19(1): 371-37.
Sartika, D. 2009. Pengembangan Produk
Marshmallow Dari Gelatin Kulit Ikan
Kakap Merah (Lutjanus sp.).(skripsi).
Bogor : Institut Pertanian Bogor.
Tanabe, S., Hase, M., Yano, T., Sato, M.,
Fujimura, T., & Akiyama, H. 2007.
A-real-time
quantitative
PCR
detection method for pork, chicken,
beef, mutton, and horseflesh in food.
Bioschi. Biotechnol. Biochem, 71, 12,
3131-3135.
Applewhite, L. A., Rasmussen, R. &
Morrisey,
M.
2012.
Species
identification of seafood. The Seafood
Industry:
Species,
Products,
Processing, and Safety, hlm. 193-212.
West Sussex: Blackwell Publishing
Ltd
Olipro, MY. 2009. Olipro™ Porcine Gene
chip. Diakses pada 10 Maret 2013
dari http://www. oliprobiotech.com.
Pusat Data dan Informasi Departemen
Perindustrian dan Perdagangan. 2004.
Data Impor Gelatin Tahun 1999 2003. Jakarta
Sahilah, A. M, Mohd. Fadly, L., Norrakiah,
A. S., Aminah, A., Wan Aida, W. M.,
Ma’aruf, A. G & Mohd. Khan, A.
92