Ringkasan Pengkajian Keamanan Lingkungan Produk Rekayasa

Ringkasan Pengkajian Keamanan Lingkungan Produk Rekayasa Genetik Vaksin
Vectormune®HVT-NDV&Rispens
I. Pendahuluan
Vaksin Vectormune® HVT-NDV&Rispens adalah vaksin untuk pengendalian dan
penanggulangan penyakit Newcastle Disease (ND) dan Marek’s Disease (MD) yang
sangat virulen pada ayam. Vaksin ini diproduksi oleh Ceva Biomune Veterinary
Biologicals Co., USA, yang akan diedarkan oleh PT Ceva Animal Health Indonesia.
Kandungan vaksin ini adalah virus HVT-ND (Master Seed) dan virus MD strain Rispens.
Virus HVT-NDV merupakan jasad renik PRG virus Herpesvirus of Turkey (HVT) yang
disisipi gen F virus ND.
Virus HVT-ND juga digunakan dalam vaksin PRG Vectormune® HVT-NDV yang telah
terdaftar dan memperoleh Certificate of Free Sale diberbagai Negara seperti Amerika
Serikat (2007), Afrika Utara (2013), Bangladesh (2012), Bolivia (2010), Brazil (2010),
Ekuador (2011), Filipina (2011), Guatemala (2013), Honduras (2012), Kolombia (2010),
Kostarika (2012), Kuwait (2012), Libanon (2011), Malaysia (2012), Mauritus (2011),
Meksiko (2010), Maroko (2012), Mesir (2012), Panama (2012), Peru (2008), Rusia
(2011), Thailand (2010), Tunisia (2012), Turki (2012), Ukraina (2012), Venezuela (2012)
dan Yordania (2011). Sementara untuk vaksin PRG Vectormune® HVT-NDV&Rispens
telah terdaftar dan memperoleh Certificate of Free Sale di Amerika Serikat (2010),
Libanon (2013), Rusia (2013), Srilanka (2013), Turki (2013), Uzbekistan (2013)
danYordania (2013).
Berdasarkan Peraturan Pemerintah No. 21 Tahun 2005 tentang Keamanan Hayati
Produk Rekayasa Genetik, dan Peraturan Menteri Lingkungan Hidup No. 25 Tahun
2012 tentang Pedoman Penyusunan Analisis Risiko Lingkungan Produk Rekayasa
Genetik, maka Tim Teknis Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik (TTKH PRG)
telah melakukan pengkajian keamanan lingkungan vaksin PRG Vectormune® HVTNDV&Rispens. Pengkajian didasarkan pada informasi genetik dan informasi keamanan
lingkungan yang terdiri atas hospes alami dari tetua jasad renik PRG, sifat genetik yang
direkayasa, stabilitas genetik jasad renik PRG, kemampuan penyebaran jasad renik,
dan kemungkinan menimbulkan risiko terhadap lingkungan, sebagaimana diuraikan
dibawah ini.
II. Informasi Jasad Renik PRG
II.1 Deskripsi Umum Jasad Renik PRG
Jasad renik PRG yang digunakan untuk memproduksi vaksin Vectormune® HVTNDV&Rispens adalah Herpesvirus of Turkey (HVT) strain FC-126 sebagai inang yang
disisipi gen F virus Newcastle Disease (ND) strain D-26 sebagai gen donor.
II.2 Informasi Sifat Genetik Jasad Renik
Tetua jasad renik PRG adalah virus HVT strain FC-126, tidak pathogen pada ayam
bahkan dapat memberikan perlindungan terhadap penyakit MD dan ND.
Sebagai donor gen F adalah virus ND strain D-26, yang termasuk dalam strain
lentogenik. Gen F disisipkan di antara untranslated region UL-45 dan UL-46 virus HVT,
sehingga manipulasi ini tidak menghilangkan atau menginaktivasi virus HVT. Jumlah
kopi gen yang disisipkan sebanyak satu gen F (Esaki and Yasuda, 2013; Lamp 4). Gen
F menyandi protein F yang merupakan glikoprotein permukaan virus ND. Fungsi protein
F ini adalah bertanggungjawab pada perlekatan/fusi dengan sel hospes, sehingga
protein F ini dapat menginduksi pembentukan antibodi netralisasi (Esaki and Yasuda,
2013; Lamp 4). Secara detil sekuen gen F virus ND strain D-26 ini dapat dilihat dari Gen
Bank www.ncbi.nlh.nih.gov/genbank/ dengan nomor akses M24692.1 (Lamp 5).
Master seed virus rekombinan HVT-ND telah diuji stabilitas genetiknya secara in vitro
pada Chicken Embryo Fibroblast (CEF) 7x pasase dan secara in vivo dengan 7x
pasase balik pada ayam Specific Pathogen Free (SPF). Hal ini dapat terlihat dari data
pengujian yang tercantum dalam laporan “Back Passage : Genetic Stability And Safety
Of Marek’s Disease-Newcastle Disease, Serotype 3, Live Marek’s Disease Vector”
(Lamp 2).
II.3 Metode Konstruksi Genetik
Untuk melakukan insersi elemen DNA ekstra genus ke dalam genom HVT perlu
disusun plasmid insersi.
Fragmen HindIII/EcoRI dari genom HVT yang terletak diantara UL45 dan UL46
diamplifikasi dengan PCR dengan penambahan tapak restriksi SfiI. Fragmen amplikon
ini diklon ke dalam plasmid pUC18 sehingga menjadi p45/46SfiI.
Fragmen gen F sebesar 1680 bp virus ND strain D-26 diisolasi dari plasmid rekombinan
pXLIII10H dengan menggunakan PCR (Sato et al.,1987; Lamp 9). Untuk
mengekspresikan gen F digunakan promoter Pec yang diinsersikan upstream gen F.
Promoter Pec merupakan rekombinasi dari sekuen enhancer Cytomegalovirus (CMV)
immediate early (IE) promoter dengan sekuen inti chicken beta-actin promoter.
Konstruksi promoter Pec ini ditambah tapak restriksi BglI diujung 5’ dan XbaI diujung 3”.
Sekuen polyA SV40 diisolasi dari plasmid pBK-CMV dan ditambah dengan tapak
restriksi KpnI di ujung 5’ dan SfiI di ujung 3’.
Konstruksi plasmid insersi disusun dengan menyisipkan promoter Pec, fragmen gen F
dan fragmen sekuen polyA ke dalam plasmid p45/46Sfi sehingga menjadi plasmid
p45/46-PecF.
Rekombinan virus HVT-ND diperoleh melalui ko-transfeksi antara virus HVT dengan
plasmid p45/46-PecF ke dalam CEF.
II.4 Karakter Modifikasi Genetik
HVT-ND rekombinan adalah virus Herpesvirus of Turkey (HVT) strain FC-126 yang
disisipi gen F virus Newcastle Disease (ND) strain D-26.
Modifikasi genetik yang berupa penyisipan gen F virus ND ke genom HVT tidak
mempengaruhi virulensi virus tetuanya (HVT) bahkan penyisipan gen F tersebut akan
mengekspresi protein F yang berfungsi untuk memproteksi terhadap infeksi ND.
Rekombinan HVT-ND bersifat stabil yang ditunjukkan dengan uji Southern blot,
Western blot dan Black Plaque Assay (BPA) setelah pasase secara in vitro dan in vivo
7X.
II.5 Kemungkinan terjadinya gen yang disisipkan pada jasad renik PRG untuk
vaksin hewan dipindahkan ke organisme lain.
Gen F yang disisipkan ke dalam virus rekombinan HVT-ND bersifat stabil sesuai
dengan uraian pada butir II.2.
Untuk mengetahui kemungkinan pemindahan gen donor (Gen F) ke organisme lain
telah dilakukan analisis BLAST nukleotida dari gen F virus ND strain D-26 dengan
nomor akses M24692.1.
Hasil analisis menunjukkan bahwa gen F tersebut tidak homolog dengan sekuen gen
organisme lain, oleh karena itu pemindahan gen ke organisme lain tidak dimungkinkan.
II.6 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa :
a. Gen interes (gen F dari virus ND) yang disisipkan dalam virus HVT dapat
diekspresikan dengan baik. Ekspresi protein heterolog ini tidak merubah sifat
virulensi HVT bahkan dapat memberikan perlindungan terhadap penyakit Marek
dan ND.
b. Virus rekombinan HVT-ND mengandung satu kopi gen F yang bersifat stabil
secara genotipe dan fenotipe.
c. Tidak ada kemungkinan penyebaran/pemindahan Gen F yang disisipkan dalam
jasad renik PRG (HVT-ND) ke organisme lain.
III. Informasi Keamanan Lingkungan
III.1 Kemampuan Penyebaran Jasad Renik
Jasad renik PRG dalam Vectormune® HVT-NDV&Rispens mempunyai sifat yang sama
dengan virus HVT tetuanya yaitu tidak patogen dan tidak diekskresikan dalam ekskreta
hewan sehingga tidak menimbulkan kemungkinan risiko terhadap lingkungan ( Zhang Y.
et al., 2013; Lamp 11).
III.2 Informasi Cakupan Inang OrganismeTetua Virus PRG untuk Vaksin.
Tetua virus PRG HVT-ND adalah virus HVT strain FC-126 yang termasuk dalam family
Herpesviridae dan subfamily Alphaherpesvirus. Inang alami tetua HVT adalah ayam,
burung puyuh dan kalkun (Abdul-Careem MF, 2008; Lamp 1).
III.3 Informasi Kajian Molekuler
Sifat genetik yang direkayasa adalah penyisipan gen F virus ND ke dalam virus HVT
pada posisi antara UL 45 dan UL46. Penyisipan ini tidak merubah sifat virulensi HVT
bahkan dapat memberikanperlindungan terhadappenyakit Marek dan ND. Virus
rekombinan HVT-ND mengandung satu kopi gen F yang bersifat stabil secara genotipe
dan fenotipe, serta tidak ada kemungkinan penyebaran/pemindahan gen F yang
disisipkan dalam jasad renik PRG (HVT-ND) ke organisme lain sehingga aman
terhadap lingkungan.
Modifikasi genetik dapat dianalisis dengan salah satu dari metode PCR, sekuensing
dan Southern blot. Sedangkan fenotipe dari rekombinan ini dapat dicirikan dengan
Western Blot atau Black Plaque Assay.
III.4 Kemungkinan dampak negative jasad renik PRG vaksin terhadap lingkungan
Hasil analisis BLAST nukleotida dari gen F tidak ditemukan homologi sekuen genom
organisme lain, sehingga tidak ada kemungkinan transfer gen ke organisme lain (Gen
Bank, 2013; Lamp 5).
Vaksin PRG Vectormune® HVT-NDV&Rispens tidak membentuk spora karena tetua dari
vaksin ini adalah termasuk dalam golongan virus. Virus PRG HVT-ND tidak
diekskresikan dari hewan yang divaksin sehingga tidak berpotensi menyebar ke hewan
non target sehingga tidak ada kemungkinan risiko terhadap lingkungan.
Kesimpulan
Vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens bersifat aman terhadap lingkungan karena tidak
berisiko menyebarkan jasad renik ke lingkungan. Hal ini karena jasad renik PRG dalam
sediaan vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens tidak diekskresikan dari hewan yang
divaksin ke lingkungan.
Berdasarkan kajian stabilitas fenotipe dan genotype jasad renik PRG dalam vaksin
Vectormune HVT-NDV&Rispens dinyatakan stabil.
TTKH PRG Bidang Keamanan Lingkungan menilai bahwa vaksin Vectormune HVTNDV&Rispens yang diajukan adalah aman terhadap lingkungan.
Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data
keamanan lingkungan yang diperoleh hingga saat ini, maka status aman lingkungan
terhadap vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens perlu dikaji ulang.
Apabila setelah ditetapkan aman lingkungan, kemudian produk tersebut terbukti
menimbulkan risiko terhadap kesehatan manusia dan hewan maka pemohon wajib
melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan serta memusnahkan vaksin
Vectormune HVT-NDV&Rispens yang berada di wilayah teritori Indonesia.
Vaksin Vectormune HVT-NDV&Rispens tidak boleh digunakan sebagai vaksin ayam
sampai memperoleh ijin aman lingkungan.
Pustaka
1
2
3
Abdul-Careem M.F. et al. 2008. Cellular and Cytokine Responses in
Feathers of Chickens Vaccinated Against Marek’s Disease. Veterinary
Immunology and Immunopathology. Elsevier. 126. 362-366.
Biomune Co. 2001j. Backpassage : Genetic Stability and Safety.
Dossier of Vectormune HVT ND & Rispens.
Biomune Co. 2001k. Backpassage (Reversion to virulence) Study :
MDV Serotype 1, in SPF Chickens. Dossier of Vectormune HVT ND &
Rispens
4
5
6
7
8
9
10
11
Esaki and Yasuda, 2013, Construction of Marek’s Disease-Newcastle
Disease Vaccine, Serotype 3, Live Marek’s Disease Vector. Ceva
Japan KK.
Gen Bank. 2013. Basic Local Alignment Search Tool. National Center
for Biotechnology Information. US. National Library of Medicine.
Palya V. 2012. New Perspectives Offered by a Recombinant HVT-NDV
Vaccine for the Control of Newcastle Disease in Poultry. Ceva Phylaxia
Veterinary Biologicals Co. Ltd.
Palya V. et al. 2012. Advancement in Vaccination Against Newcastle
Disease: Recombinant HVT- NDV Provides High Clinical Protection and
Reduces Challenge Virus Shedding with the Absence of Vaccine
Reactions. Avian Diseases 56: 282-287, 2012.
Rauw et al. 2009. Improved Vaccination Against Newcastle Disease by
an In Ovo Recombinant HVT-ND Combined with an Adjuvanted Live
Vaccine at Day Old. Elsevier.
Sato H. et al. 1987. Molecular Cloning and Nucleotide Sequence of P,
M and F Genes of Newcastle Disease virus Avirulent Strain D26. Virus
Research. 7. 241-255. Elsevier.
Schat K.A. & Nair V. 2008. Marek’s disease. In: Diseases of Poultry,
Twelfth Edition, Saif Y.M. et al., eds. Blackwell Publishing, Ames Iowa,
USA, 452–514.
Zhang Y. et al., 2013. A Safety Assessment of a HVT-vectored
Newcastle Disease Vaccine in Chickens and Duck.