III. METODOLOGI PENELITIAN A. Tempat dan

III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Pangan, Departemen
Ilmu dan Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor selama 3 bulan,
terhitung dari bulan Februari hingga April 2009.
B. Alat dan Bahan
Bahan utama yang digunakan adalah tulang ikan pepes iradiasi yang
memiliki umur simpan yang berbeda-beda, yaitu tulang ikan pepes iradiasi
dengan masa simpan 2 tahun yang diiradiasi pada tahun 2007 (tulang A),
tulang ikan pepes iradiasi dengan masa simpan 1 tahun yang diiradiasi pada
tahun 2008 (tulang B), dan tulang noniradiasi. Sampel-sampel tersebut
merupakan sampel yang diperoleh dari Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan
Iradiasi BATAN.
Bahan yang digunakan untuk ekstraksi adalah aquades. Serum darah,
eritrosit, dan limfosit diisolasi dari darah manusia yang berasal dari donor
yang sehat. Bahan yang digunakan pada pengujian terhadap hemolisis eritrosit
adalah PBS (phosphate buffer saline), H2O2 0.5%, dan biru trifan. Bahan
kimia yang digunakan pada pengujian terhadap proliferasi limfosit adalah
histopaque (Sigma, USA), RPMI-1640 (Sigma, USA), MTT [3-(4,5dimethilthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] (Sigma, USA) dan
HCl-isopropanol 0.04 N, aquabides, larutan mitogen pokeweed, dan larutan
mitogen LPS. Bahan yang digunakan pada pengukuran kapasitas antioksidan
adalah buffer asetat, metanol, DPPH (diphenyl-β-picrylhidrazine), dan asam
askorbat. Bahan yang digunakan pada pengukuran kadar malonaldehida
adalah larutan HCl 0.25 N, TCA (trichloroacetic acid), TBA (thiobarbituric
acid), BHT (butil hidroksi toluena), dan TEP (1,1,3,3 tetraetoksipropana).
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah sentrifuse CR412,
inkubator VWR Scientific (CO2 5 %, 37oC), Spectrophotometer microplate
reader (Bio-rad model 550), mikroskop (Olympus CH 20), laminar flow hood,
lempeng mikrokultur (well plate) 96 well, kertas saring, membran steril 0.20
m (Sartorius), mikropipet, mikrotip 1000 µl, mikrotip 100 µl, vorteks,
hemasitometer (Bright-line), syringe, hand counter, termometer, penangas air,
tabung eppendorf, tabung vacutainer steril, vacutainer needle, holder,
torniquate, tabung sentrifuse steril 15 ml disposible (Nunc).
C. Metode Penelitian
Metode penelitian terdiri dari tujuh tahap meliputi ekstraksi sampel,
persiapan ekstrak, persiapan media kultur sel, isolasi sel eritrosit dan
pengujian pengaruh ekstrak terhadap hemolisis eritrosit, isolasi limfosit dan
pengujian ekstrak terhadap proliferasi limfosit manusia, dan pengujian ekstrak
terhadap aktivitas antioksidan serta pengukuran kadar malonaldehida.
1. Ekstraksi Tulang Ikan
Ikan pepes iradiasi yang masih berada dalam kemasan dibuka,
dipisahkan antara tulang dan dagingnya. Bagian tulang yang diambil
adalah tulang belakang dan tulang kepala. Bagian tulang diambil sebanyak
10 g dan dihancurkan dengan mortar sampai halus, ditambahkan dengan
aquades dengan perbandingan berat 1:2. Kemudian disentrifuse dengan
kecepatan 3000 rpm selama 5 menit untuk memisahkan padatan dan
cairannya. selanjutnya disaring dengan kertas saring dan diteruskan dengan
membran steril 0.20 µm.
2. Persiapan ekstrak
Ekstrak tulang ikan pepes iradiasi langsung dilakukan pengenceran
bertingkat sehingga diperoleh ekstrak dengan tiga pengenceran yang dapat
dilihat pada Tabel 3, yaitu konsentrasi C1, C2, dan C3. Konsentrasi C1
diperoleh dari hasil ekstraksi pada tahap 1. Konsentrasi C2 diperoleh
dengan menambahkan aquabides pada C1
dengan perbandingan 1:1,
sedangkan konsentrasi C3 diperoleh dengan menambahkan aquades steril
pada ekstrak C1 dengan perbandingan 3:1. Ekstrak yang diperoleh
kemudian segera dianalisis menggunakan sel eritrosit dan sel limfosit.
23
Tabel 2. Pengenceran ekstrak sampel
Jumlah stok sampel
Jumlah aquabides steril
(ml)
(ml)
C1 (pengenceran 0x)
2
0
C2 (pengenceran 2x)
1
1
C3 (pengenceran 4x)
0.5
1.5
Konsentrasi
3. Persiapan Uji In Vitro
a. Persiapan Media Kultur Sel (Agustinisari et al., 1997)
Media yang dipergunakan untuk kultur sel adalah RPMI-1640
(telah mengandung L-glutamine). Bubuk RPMI sebanyak 10.42 g
dilarutkan dalam aquabides, sehingga diperoleh 1 liter larutan RPMI1640. Kemudian ditambahkan 2 g NaHCO3 (sebagai buffer).
Campuran larutan tersebut disterilisasi dengan membran sterilissasi
0.20 µm.
b. Persiapan PBS (Phosphat Buffer Saline)
Dua buah tablet PBS dilarutkan di dalam aquabides sebanyak
500 ml. Kemudian disaring dengan membran steril 0.20 µm.
c. Persiapan Serum Darah AB (Nurrahman et al., 1999)
Darah
segar
diambil dari
donor
yang
bergolongan
AB.
Pengambilan darah dilakukan oleh seorang perawat di klinik Farfa,
Darmaga. Darah sebanyak 7-21 ml dimasukkan ke dalam vacuteiner
steril spesial untuk isolasi serum. Darah kemudian disentrifuse selama
30 menit pada 2500 rpm hingga terpisah menjadi tiga bagian. Bagian
serum yang berada di bagian atas diambil menggunakan mikropipet
dan bagian darah tidak boleh sampai terambil. Serum yang sudah
dipisahkan dipanaskan dalam waterbath suhu 56˚C selama 30 menit
lalu disterilkan menggunakan membran steril 0.20 μm.
24
4. Isolasi Sel Eritrosit dan Pengujian Pengaruh Ekstrak terhadap
Hemolisis Eritrosit secara In Vitro
a. Isolasi Sel Eritrosit (Zhu, 2002)
Eritrosit diisolasi dari darah perifer donor dengan jenis kelamin
laki-laki. Darah donor diambil sebanyak 7-15 ml secara aseptis oleh
seorang perawat di Klinik Farfa, Darmaga. Darah kemudian
dipindahkan ke dalam tabung vacutainer steril yang berisi heparin agar
darah tidak menggumpal. Kemudian, darah dipindahkan ke dalam
tabung sentrifuse di dalam laminar hood secara aseptis untuk
menghindari terjadinya kontaminasi mikroba dan untuk menjaga
keaseptisan proses.
Pemisahan eritrosit awal dilakukan dengan sentrifuse pada
1.500 rpm selama 10 menit, dan akan terlihat ada 3 lapisan di dalam
tabung. Lapisan yang paling atas berwarna kuning adalah plasma
darah, lapisan buffycoat yang terdiri dari leukosit dan platelet berada di
tengah, dan di bagian bawah terdapat eritrosit yang menyusun hampir
45 % dari total volume darah (Gambar 3). Lapisan plasma yang ada di
bagian atas dan buffycoat kemudian dibuang.
Plasma
Buffycoat
Suspensi eritrosit
Gambar 3. Pemisahan sel darah manusia
Sel eritrosit kemudian dicuci sebanyak 3 kali menggunakan
larutan PBS. Sebanyak 1 ml sel eritrosit dicuci dengan 5 ml larutan
PBS lalu disentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit.
Eritrosit akan mengendap di dasar tabung dan larutan PBS akan
25
berwarna kemerahan. Pencucian dilakukan sebanyak 3 kali hingga
larutan PBS menjadi hampir tidak berwarna dan jernih.
Jumlah sel eritrosit yang ada dalam suspensi dihitung
menggunakan hemasitometer dengan pewarna biru trifan. Sebanyak
0.5 ml suspensi eritrosit diambil, lalu ditambah dengan PBS sebanyak
49.5 ml sehingga diperoleh volume total sebesar 50 ml. Dari suspensi
ini sebanyak 20 μl suspensi eritrosit diambil dan ditambah dengan biru
trifan sebanyak 20 μl dan diaduk dengan mikropipet. Kemudian
dilakukan penghitungan sel eritrosit dengan mikroskop pada
perbesaran 400x. Kemudian dilakukan pengenceran sehingga diperoleh
konsentrasi sel 2 x 108 sel/ml. Jumlah sel eritrosit yang hidup harus di
atas 95% agar dapat digunakan untuk uji.
Rumus
perhitungan
jumlah
sel
eritrosit
menggunakan
hemasitometer yaitu :
N = A x FP x 104 sel/ml
Keterangan : N
FP
A
= Jumlah sel eritrosit
= Faktor pengenceran
= Jumlah sel hidup dalam 1 kotak
b. Pengaruh ekstrak tulang iradiasi terhadap hemolisis eritrosit
Disiapkan sel eritrosit stok dengan konsentrasi 2 x 108 sel/ml
dengan jumlah sel hidup lebih besar dari 95 %. Suspensi sel sebanyak
800
μl
dimasukkan
ke
dalam
tabung
eppendorf,
kemudian
ditambahkan ekstrak sebanyak 200 μl. Untuk masing-masing sampel
dilakukan dengan tiga macam konsentrasi dan masing-masing triplo.
Disiapkan juga kontrol positif, yaitu 800 μl eritrosit ditambah dengan
200 μl larutan H2O2 0.5 %. Sedangkan kontrol negatif dibuat dengan
800 μl eritrosit yang ditambah dengan 200 μl PBS.
Tabung eppendorf yang berisi sel dan ekstrak tersebut
kemudian diinkubasi dalam inkubator bersuhu 370C dan kadar CO2
5%. Pengamatan dimulai dari jam ke-0 sampai jam ke-5 yang
dilakukan tiap jam.
26
Pengamatan dilakukan dengan mengambil tabung eppendorf
dan disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit untuk
mengendapkan sel darah merah. Sebanyak 100 μl supernatan diambil
dan diplating pada 96-well plate lalu diukur absorbansinya
menggunakan Spectrophotometer microplate reader pada panjang
gelombang 450 nm. Setiap 1 jam dari jam ke-0 hingga jam ke 5,
tabung eppendorf tersebut diambil dan diperlakukan seperti perlakuan
tersebut di atas.
c. Perhitungan persentase hemolisis
Nilai absorbansi yang diperoleh dari pengukuran kemudian
digunakan untuk menghitung nilai persentase hemolisis eritrosit.
Rumus perhitungan persentase hemolisis eritrosit sebagai berikut:
% hemolisis eritrosit =
Absorbansi sampel
x 100%
Absorbansi kontrol positif
d. Analisis statistik
Data yang diperoleh dari pengujian ekstrak tulang ikan pepes
iradiasi dibandingkan dengan data dari ekstrak tulang ikan noniradiasi
menggunakan analisis pengujian statistik. Analisis statistik yang
digunakan adalah ANOVA dengan nilai selang kepercayaan 95%.
Apabila terdapat perbedaan yang nyata maka dilanjutkan dengan uji
Dunnet.
5. Isolasi Limfosit dan Pengujian Ekstrak Tulang Iradiasi terhadap
Limfosit secara In Vitro.
a. Isolasi Limfosit (Nurrahman et al., 1999)
Darah donor sebanyak 21-27 ml diambil secara aseptis di klinik
Farfa, Dramaga, Bogor oleh seorang perawat. Darah kemudian
dimasukkan ke dalam tabung vacutainer steril yang didalamnya
terdapat antikoagulan. Darah kemudian dipindahkan ke dalam tabung
sentrifuse secara aseptis di dalam laminar flow hood.
27
Pemisahan limfosit awal dilakukan dengan sentrifuse darah
dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Darah akan terpisah
menjadi tiga bagian, yaitu lapisan plasma, buffycoat, dan eritrosit.
Setelah itu, diambil lapisan buffycoat menggunakan mikropipet dan
dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse steril yang berisi histopaque.
Buffycoat dilewatkan secara hati-hati di atas histopaque melalui
dinding tabung (perbandingan buffycoat dan histopaque = 1:1).
Dilakukan kembali sentrifuse 2500 rpm selama 30 menit. Diambil
lapisan bagian atas dan dicuci dengan penambahan 5 ml larutan media
RPMI. Campuran ini kemudian disentrifus 1500 rpm selama 10 menit
dan dicuci sebanyak dua kali, sehingga didapatkan sel limfosit.
Suspensi sel limfosit kemudian dihitung menggunakan hemasitometer
dengan pewarnaan biru tripan dan ditepatkan menjadi 2 x 106 sel / ml.
Setelah itu ditambahkan serum darah AB sebanyak 10%.
Lapisan buffycoat
Sel darah merah
Gambar 4. Hasil pemisahan sel darah manusia
Rumus
perhitungan
jumlah
sel
eritrosit
menggunakan
hemasitometer yaitu :
N = A x FP x 104 sel/ml
Keterangan :
N = jumlah sel limfosit / ml
A = Jumlah sel hidup dalam 1 kotak
FP = Faktor Pengenceran
28
b. Pengujian terhadap Limfosit dengan Metode MTT (Meiriana,
2006)
Disiapkan suspensi sel limfosit dengan konsentrasi sel sebesar
6
2 x 10 sel/ml dan ditambah dengan serum AB sebanyak 10% dari
volume suspensi sel. Ekstrak sampel dimasukkan ke dalam well plate
sebanyak 20 l dan ditambahkan dengan suspensi sel limfosit
sebanyak 80 l. Dibuat juga kontrol positif, yaitu LPS dan pokeweed
sebanyak 20 l ditambah dengan 80 l sel limfosit, sedangkan kontrol
negatif dibuat dengan 20 l larutan RPMI ditambah dengan 80 l sel
limfosit. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 370C dan kadar CO2
5% selama 72 jam. Enam jam sebelum masa inkubasi berakhir, kultur
sel ditambahkan 10 l larutan MTT 0.5 %. Setelah masa inkubasi
berakhir, pada masing-masing sumur kultur sel, ditambahkan dengan
100 l HCL-Isopropanol 0.04 N untuk melarutkan kristal formazan
yang terbentuk. Setelah itu dilakukan pengukuran absorbansi pada
panjang gelombang 570
nm
menggunakan
Spectrophotometer
microplate reader. Nilai absorbansi yang terbaca bersifat proporsional
terhadap jumlah sel yang hidup. Indeks Stimulasi (I.S) dihitung
menggunakan persamaan berikut :
IS =
Absorbansi sampel
Absorbansi kontrol negatif
e. Analisis statistik
Data yang diperoleh dari pengujian ekstrak tulang ikan pepes
iradiasi dibandingkan dengan data dari ekstrak tulang ikan noniradiasi
menggunakan analisis pengujian statistik. Analisis statistik yang
digunakan adalah ANOVA dengan nilai selang kepercayaan 95%,
apabila terdapat perbedaan yang nyata maka dilanjutkan dengan uji
Dunnet.
29
6. Analisis Kapasitas Antioksidan (Kubo et al., 2002)
Analisis kapasitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan
metode DPPH. Larutan DPPH dibuat dengan melarutkan 30 mg serbuk
DPPH ke dalam metanol sebanyak 25 ml. Kemudian diambil sebanyak
400 l larutan DPPH tersebut dan ditambahkan dengan 4 ml bufer asetat
dan 7.50 ml metanol. Campuran kemudian divorteks. Setelah itu
ditambahkan 100 l sampel atau larutan standar. Larutan kemudian
divorteks dan didiamkan selama 20 menit di ruang gelap. Absorbansi
diukur pada panjang gelombang 517 nm. Kontrol negatif yang digunakan
adalah metanol, sedangkan kontrol positif yang digunakan adalah asam
askorbat dengan konsentrasi 0, 50, 100, 250, 500, dan 1000 ppm Kapasitas
antioksidan diperoleh dengan menggunakan perhitungan sebagai berikut:
Kapasitas antioksidan (%) = Absorbansi kontrol negatif – Absorbansi sampel
Absorbansi kontrol negatif
7. Pengukuran Kadar Malonaldehida (Seligman et al., 1977)
Sebanyak 2 ml ekstrak sampel dan kontrol yang akan diukur
ditambahkan dengan 2 ml larutan HCl 0.25 N yang mengandung 15%
TCA, 0.38% TBA, dan 0.5% BHT. Campuran tersebut kemudian
dipanaskan dalam waterbath suhu 80˚C selama 30 menit kemudian
didinginkan pada suhu ruang. Setelah dingin, sampel kemudian
disentrifuse pada 3000 rpm selama 15 menit. Bagian supernatan dari
sampel diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang
532 nm. Hasil pengukuran sampel kemudian dibandingkan dengan kurva
standar TEP (1,1,3,3 tetraetoksipropana) yang memiliki variasi konsentrasi
0, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, dan 250 pmol/ml.
30
x 100 %