Uji Kualitatif Etanol yang Diproduksi Secara Enzimatis

Prosiding Skripsi Semester Genap 2010/2011
SK
SK-091304
Uji Kualitatif Etanol yang Diproduksi Secara Enzimatis
Menggunakan Z. Mobilis Permeabel
Dian Pinata *, Refdinal Nawfa
Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Teknologi Sepuluh Nopember
Abstrak
Pada penelitian ini telah dilakukan permeabilisasi terhadap sel Zymomonas mobilis dan produksi etanol secara
enzimatis dengan menggunakan sel Z. mobilis permeabel yang didapatkan. Permeabilisasi dilakukan dengan menggunakan
perbandingan etanol:toluen = 4:1 dan konsentrasi glukosa yang digunakan dalam proses produksi etanol sebesar 10%. Sel
Z.mobilis permeabel dapat menghasilkan etanol yang ditandai dengan terjadinya pengurangan substrat glukosa, yang
diperoleh dari kerja enzim pembentuk etanol yang terdapat pada sel permeabel. Selain itu juga ditandai dengan adanya
perubahan warna kalium dikromat, dari warna jingga menjadi berwarna hijau kebiruan, setelah penambahan supernatan yang
diduga mengandung etanol.
Kata kunci : Etanol, Z. Mobilis, enzim, permeabilisasi
Abstract
Permeabillization of Zymomonas mobilis cell and ethanol production using permeabilized Z. mobilis have been
studied in this research. This research using ratio ethanol: toluen = 4:1 in the cell permeabillization process and the
substrate concentration for ethanol production was 10 %. Permeabilized Z.. mobilis cell can produced ethanol, indicated by
the decreased of glucose concentration, received from the work of enzymes from permeabilized cell. And also indicated by
the changed of potassium dichromate’s color, after added with supernatant suggested contain with ethanol.
Keywords : Ethanol, Z.. mobilis, enzyme, permeabillization,
1.
Pendahuluan
Energi merupakan salah satu permasalahan utama
dunia pada abad ke-21. Sampai saat ini bahan bakar
minyak masih menjadi konsumsi utama negara-negara
dunia. Amerika Serikat sebagai konsumen terbesar
minyak bumi dunia dengan tingkat konsumsi 25 juta
barrel/hari, tetapi hanya memproduksi 7,5 juta
barrel/hari. Oleh karena itu ketersediaan minyak bumi
adalah hal yang sangat vital untuk menjaga
keberlangsungan industrinya.
* Corresponding author Phone : +6282139965328,
e-mail: [email protected]
1
Alamat sekarang : Jurusan Kimia, Fakultas MIPA,
Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya.
Untuk mengatasi kurangnya pasokan minyak bumi,
penggunaan bahan bakar alternatif
harus segera
dilakukan terutama yang berbentuk cair, karena
masyarakat sudah sangat familiar dengan bahan bakar
cair. Salah satu bahan bakar alternatif tersebut adalah
Bioetanol.
Etanol adalah cairan tak berwarna yang
mudah menguap dengan aroma yang khas. Terbakar
tanpa asap dengan lidah api berwarna biru yang kadangkadang tidak dapat terlihat pada cahaya biasa. Sifat-sifat
fisika etanol utamanya dipengaruhi oleh keberadaan
gugus dan pendeknya rantai karbon etanol. Gugus dapat
Prosiding Kimia FMIPA
berpartisipasi ke dalam ikatan hidrogen, sehingga
membuatnya cair dan lebih sulit menguap dari pada
senyawa organik lainnya dengan massa molekul yang
sama ( Rahman,A., 1994).
Perkembangan industri yang semakin meningkat
dalam dekade terakhir ini akan tidak menutupi
kemungkinan kebutuhan etanol akan semakin meningkat.
Oleh karena itu perlu dipikirkan sejak dini cara agar
produksi etanol dapat dilakukan secara berkelanjutan
dengan hasil yang maksimal. Keterbatasan tersebut
memunculkan ide isolasi dan purifikasi, kemudian
imobilisasi enzim. . Immobilisasi enzim digunakan
untuk:
meningkatkan
proses
maupun
untuk
menghasilkan sesuatu yang baru (Peter, 1997).
Permeabilisasi merupakan suatu proses
mengubah permeabilitas membran dari semipermeabel
menjadi permeabel. Pada poses ini substansi sel seperti
glukosa, nukleotida, dan mikromolekul lainnya keluar
dari sel sementara untuk makromolekul seperti enzim
masih tertinggal di dalam sel (Kazuhiko dan Kozo,
1995). Enzim inilah yang nantinya akan digunakan dan
dioptimasikan penggunaannya dalam proses produksi
etanol. . Permeabilisasi sel dapat digunakan untuk
memproduksi sistem biotransformasi alternatif yang
murah untuk memurnikan sistem enzim. Secara kimia
pelarut organik dapat digunakan untuk melarutkan cell
envelope yang akan menyebabkan permeabilisasi.
Dimana pelarut ini tidak akan memindahkan seluruh
dinding sel, hanya beberapa enzim yang akan dilepaskan,
bergantung pada keselektifitasannya. Metode lainnya
adalah penggunakan deterjen untuk penghancuran
dinding sel. Deterjen yang sering digunakan adalah
sodium dodecyl sulphate (SDS), cetyltrimethyl
ammonium bromide (CTAB), Tween and Triton X100.
Penggunaan deterjen akan mengakibatkan disorganisasi
membran sel.
Deterjen akan melarutkan sebagian
membran sel dan mengekstraksi enzim ikatan membran.
Keuntungan metode ini adalah memproduksi larutan
kaya enzim dengan sejumlah kecil protein non katalitik
dan metode pemurnian yang sederhana (Edebo, 1969).
Permeabilisasi pada jamur pertama kali
dikembangkan pada ragi dengan menggunakan pelarut
organik. Larutan campuran etanol toluen digunakan
sebagai agen permeabilisasi pada penelitian enzimatik
dalam S.cerevisiae untuk menguji aktivitas enzim dalam
sel memproduksi alkohol. Beberapa peneliti menggunaan
campuran pelarut organik dan deterjen untuk
permeabilisasi S. cerevisiae yang digunakan sebagai
biokatalis industri. Permeabilisasi dengan campuran
etanol toluen memiliki kecocokan pada pengujian enzim
dari jamur (Chelico, Linda, dan George, Khachatourians,
2003).
Pada penelitian ini akan dilakukan variasi
temperatur dan pH terhadap pembuatan etanol secara
enzimatis. Sehingga akan diketahui pengaruh temperatur
dan pH terhadap produksi etanol secara enzimatis dengan
menggunakan Zymomonas mobilis.
Kadar etanol
ditentukan
dengan
menggunakan
metode
spektrofotometri, setelah sebelumnya etanol direaksikan
dengan asam dikromat.
2. Metode Penelitian
2.1 Alat dan Bahan
2.1.1 Peralatan
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini
adalah erlenmeyer dan cawan petri untuk penumbuhan
bakteri pada media cair dan padat, laminary air flow
sebagai ruang steril untuk pembuatan
media dan
pemindah biakan, autoclave untuk sterilisasi basah pada
tekanan 1 atm dan suhu 121oC, inkubator dan rotary
shaker yang digunakan untuk inkubasi biakan, sentrifuge
untuk pemisahan supernatan dengan biomassa bakteri,
spektrofotometer UV-VIS untuk mengukur absorbansi
larutan, frezze dryer, neraca analitik untuk menimbang
berat kering biomassa dan bahan, serta peralatan gelas
dan peralatan tambahan lain yang lazim digunakan dalam
penelitian.
2.1.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian
ini adalah bakteri Z.mobilis,. Media padat dengan
menggunakan nutrien agar (NA) 20 g/L sebagai media
regenerasi dan penumbuhan bakteri
Media komplek untuk stater uji fermentasi
awal terdiri dari glukosa 8 %, yeast ekstrak 0,1 %,
KH 2 PO 4 0,2 %,(NH4) 2 SO 4 0,4 %,dan MgSO 4 7H 2 O 0,1
%. ( Vullo dan Wachsman, 2005). Untuk melakukan
Prosiding Kimia FMIPA
peningkatan permeabilitas sel dilakukan dengan
menggunakan bahan: EDTA, etanol, toluen, sodium
didioksi sulfat (SDS). Untuk pembuatan etanol secara
enzimatis menggunakan campuran Glukosa, MgCl 2 ,
ATPNa 2 , dan NAD. DNS digunakan untuk penentuan
kandungan sisa substrat (glukosa) dengan metoda
kolorimetri.
2.2Prosedur Kerja
2.2.1 Regenerasi Bakteri Z.mobillis
Biakan murni Z.mobillis diremajakan pada agar
miring yang telah disterilisasi pada suhu 121 OC dan
tekanan 1 atm selama 15 menit, selanjutnya diinkubasi
pada suhu 30 oC selama 48 jam. Z.mobilis pada media ini
menjadi stok kultur yang diregenerasi pada media yang
baru sebelum digunakan.
2.3.2 Penentuan Kurva Pertumbuhan Z.mobilis
Inokulum dari media agar miring dipindahkan
kedalam 50 ml media komplek sebanyak satu jarum ose.
Kemudian diinkubasi pada suhu 30 oC selama 24 jam
dengan menggunakan pengocok pada kecepatan 100
rpm. Setelah itu medium dipindahkan kedalam 500 ml
media komplek yang baru. Selanjutnya difermentasikan
lagi selama 24 jam dengan melakukan penyamplingan
setiap 2 jam. Berdasarkan hasil penyamplingan
ditentukan gambar kurva pertumbuhannya. Terhadap
hasil fermentasi dilakukan pemisahan antara biomassa
dengan supernatannya dengan menggunakan sentrifuge
pada kecepatan 3.000 rpm.
Selanjutnya terhadap
supernatan dilakukan penentuan sisa substrat (glukosa)
dengan metoda kolorimetri
menggunakan DNS.
Selanjutnya dilakukan pemisahan etanol dengan
menggunakan kloroform dan ditentukan kandungan
etanolnya dengan menggunakan kalium bikromat secara
kolorimetri.
Dilihat hubungan sisa substrat (gukosa) dan
kadar etanol yang dihasilkan yang diperoleh dari hasil
penyamplingan untuk mengetahui waktu maksimum
untuk menghasilkan etanol yang tinggi. Setelah diperoleh
waktu
maksimum untuk menghasilkan etanol,
selanjutnya dilakukan kembali fermentasi untuk
mendapatkan biomassa yang lebih banyak dengan lama
waktu fermentasi yang telah diperoleh sebelumnya.
Biomassa yang diperoleh digunakan sebagai
sumber
enzim dengan perlakuan peningkatan permeabilitas sel.
2.2.3 Penentuan Gula Reduksi Secara Kolorimetri
Sebanyak 3 ml larutan sampel ditambahkan
dengan 3 ml reagen DNS di dalam tabung reaksi.
Kemudian dipanaskan selama 10 menit, dalam keadaan
tabung tertutup rapat oleh alumunium foil. Ditambahkan
1 tetes garam Rochelle untuk mempertegas warna yang
dihasilkan. Diambil 1 ml larutan dan diencerkan menjadi
10 ml. Selanjutnya diukur absorbansinya pada 530 nm.
Kurva standar gula reduksi dibuat dengan
menggunakan kadar glukosa 2 %, 4%, 6%, 8%, dan 10%,
dengan cara yang sama seperti yang telah dijelaskan
sebelumnya.
2.2.4 Fermentasi Pada Media Kompleks Untuk
Produksi Biomassa
Inokulum dari media agar miring dipindahkan
kedalam 50 ml media komplek sebanyak satu jarum ose.
Kemudian diinkubasi pada suhu 30 oC dengan waktu
yang diperoleh dari kurva pertumbuhan bakteri. Setelah
itu medium dipindahkan kedalam 500 ml media komplek
yang baru. Selanjutnya difermentasikan lagi dengan
waktu yang sama. Terhadap hasil fermentasi dilakukan
pemisahan antara biomassa dengan supernatannya
dengan menggunakan sentrifuge pada kecepatan 3.000
rpm. Biomassa yang dihasilkan kemudian dikeringkan
menggunakan frezze dryer dan ditimbang berat
keringnya.
2.2.5 Permeabilisasi Sel Z.mobillis
Sel Z.mobillis yang diperoleh dari hasil
sebelumnya diambil sebanyak 0,1 gram dan
dipermeabilisasi dengan cara menambahkan 2 mM
EDTA lalu diinkubasi selama 5 menit pada suhu 30°C
kemudian ditambahkan campuran 0,075% SDS dan
etanol : toluen dengan variasi perbandingan konsentrasi
1:4. Kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu
30°C. Sel Z.mobillis yang telah dipermeabilisasi
dipisahkan dari supernatannya dengan disentrifuge pada
kecepatan 3000 rpm, suhu 30°C selama 5 menit
2.2.6 Produksi Etanol Menggunakan Z. mobilis
Permeabel.
Sel Z. mobillis yang telah dipermeabilisasi,
sebanyak 1,0 gram diinkubasi dengan 10 mL larutan
campuran 15 mM MgCl 2 , 2 mM ATPNa 2 , 1 mM
NAD,dan 10% glukosa pada suhu ruangan selama 15
menit.
Kemudian sel dipisahkan dari supernatannya
dengan menggunakan sentrifuge pada kecepatan 3000
rpm. Sebagian supernatan digunakan untuk mengetahui
sisa kandungan substrat glukosa sebagai indikator
terbentuknya etanol dan sebagian yang lain untuk uji
etanol secara kualitatif.
2.2.7 Uji Etanol Secara Kualitatif
Uji Etanol secara kualitatif dilakukan
dengan mengambil 1 ml supernatan ke dalam tabung
reaksi, kemudian ditambahkan dengan 1 ml larutan
kalium dikromat. Larutan kalium dikromat dalam
suasana asam dibuat dengan cara 56 ml H 2 SO 4 6 N
diencerkan hingga 100 ml. Kemudian ke dalam larutan
ditambahkan 0,2942 gram padatan K 2 Cr 2 O 7 dan
diencerkan sampai 200 ml, larutan ini berwarna jingga
(Mustanir, 1991). Diamati perubahan warna yang terjadi
setelah penambahan kalium dikromat.
3.Hasil dan Diskusi
3.1 Regenerasi Z.mobilis
Penelitian ini menggunakan mikroorganisme
berupa bakteri Z. Mobilis sebagai mikroorganisme
penghasil etanol. Z.mobilis merupakan baketeri gram
negatif yang dapat bekerja dalam suasana anaerobik dan
adanya gula primer yaitu glukosa. Z.mobilis merupakan
bakteri anaerob fakultatif. Bakteri anaerobik adalah
organisme yang tumbuh tanpa oksigen molekular.
Anaerobik fakultatif adalah bakteri yang masih bisa
hidup ditempat yang mengandung oksigen.
Prosedur kerja aseptis dilakukan dengan
prinsip seminimal mungkin tidak terjadi kontaminasi dan
tercampurnya bahan yang tidak diinginkan. Metode
regenerasi dan penyimpanan bakteri haruslah tepat agar
galur dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama,
bebas dari mikroorganisme lain (murni) dan tidak
menurunkan aktivitasnya.
Prosiding Kimia FMIPA
Media pertumbuhan merupakan tempat untuk
menumbuhkan mikroorganisme.
Mikroorganisme
memerlukan
nutrisi untuk memenuhi kebutuhan
energinya, bahan pembangun sel, serta untuk sintesa
protoplasma dan bagian-bagian sel lain.
Setiap
mikroorganisme memiliki sifat fisiologi tertentu
sehingga memerlukan nutrisi yang tertentu pula. Media
harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk
metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H,
O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur
pelikan/trace element. Sumber karbon dan energi yang
dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik
esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof
memerlukan sumber karbon organik antara lain dari
karbohidrat, lemak, protein dan asam organik. Sumber
nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa
bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan
sumber N anorganik seperti urea.
Media padat yang digunakan pada penelitian
ini adalah nutrien agar. Nutrien agar terdiri atas agar,
pepton, dan beef ekstrak. Agar, agar dapat diperoleh
dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat
dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah
sebagai pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan
oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Jika
dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk
melarutkannya harus diaduk dan dipanasi, pencairan dan
pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama
dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang
asam. Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein
hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein,
lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya
tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara
memperolehnya. Beef extract. Beef extract mengandung
basa organik terbuat dari otak, limpa, plasenta dan
daging sapi.
3.2 Hasil Kurva Pertumbuhan Bakteri
Pertumbuhan Z.mobilis dimonitor sebagai
fungsi waktu sehingga didapatkan kurva pertumbuhan
Z.mobilis pada gambar 3.1
Gambar 3.1 Kurva Pertumbuhan Z. mobilis
Kurva pertumbuhan di atas menunjukkan
bahwa Z. mobilis hampir tidak melakukan adaptasi atau
tidak memiliki fase lag. Hal ini dapat disebabkan karena
media starter untuk awal media pertumbuhan sama
dengan media fermentasinya. Akibatnya usia sel relatif
homogen, sehingga waktu adaptasinya dapat dikatakan
amatlah singkat bahkan tidak memerlukan adaptasi.
Tetapi jika nutrien yang tersedia dan kondisi lingkungan
yang baru sangat berbeda dengan sebelumnya,
diperlukan waktu penyesuaian untuk mensintesis enzimenzim yang dibutuhkan untuk metabolisme. Selain itu
jumlah inokulum juga mempengaruhi hal ini, dimana
jumlah sel yang semakin tinggi akan mempercepat
proses adaptasi. Pertumbuhan Z. mobilis langsung
memasuki fase log yang puncaknya berada pada waktu
22 jam. Pada fase ini sel bakteri membelah dengan
cepat, dimana pertambahan jumlahnya mengikuti kurva
logaritmik. Pada fase ini kecepatan pertumbuhan sangat
dipengaruhi oleh medium tempat tumbuhnya seperti pH
dan kandungan nutrien, suhu dan kelembaban udara.
Pada fase ini sel membutuhkan energi lebih banyak
dibandingkan dengan fase lainnya, selain itu sel paling
sensitif terhadap keadaan lingkungan. Bila kita ingin
mengadakan biakan yang cepat tumbuh, maka bakteri
pada fase ini baik sekali untuk dijadikan inokulum.
Sehingga pada waktu 22 jam inilah pemanenan bakteri
dilakukan, karena jumlah sel yang hidup pada fase
tersebut merupakan jumlah sel yang hidup optimal dan
memiliki aktivitas yang sangat aktif dalam mengkonversi
substrat glukosa menjadi produk etanol.
Hal ini juga diperkuat dengan adanya data sisa
gula reduksi sel bebas Z.mobilis, yang juga dihitung
bersamaan dengan pembuatan kurva pertumbuhan
bakteri. Kadar etanol dan sisa gula reduksi sel bebas
Z.mobilis dapat dilihat pada grafik berikut:
Media yang digunakan pada proses fermentasi
ini merupakan media kompleks yang disebut juga
undefined media atau nonsynthetic media. Media ini
selain mengandung media minimal yang terdiri dari
KH 2 PO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 dan MgSO 4. 7H 2 O, juga
mengandung bahan-bahan kompleks seperti ekstrak
yeast, ekstrak beef, dan pepton. Semua bahan-bahan
tersebut tidak diketahui secara pasti komposisi kimianya.
Pada penelitian ini bahan kompleks yang ditambahkan ke
dalam media adalah ekstrak yeast. Sehingga media ini
dapat disebut juga sebagai media ekstrak yeast.
Fermentasi hanya dilakukan selama 22 jam,
sesuai dengan waktu dimana jumlah selnya optimum dan
memiliki aktifitas yang sangat aktif dalam memproduksi
etanol. Fermentasi ini dilakukan dengan menggunakan
metode batch dan dilakukan secara anaerob. Z.mobilis
mampu melakukan fermentasi pada keadaan anaerob
dibuktikan dengan mengendapnya hampir seluruh bakteri
pada dasar tabung fermentasi. Setelah dipisahkan antara
biomassa dan supernatannya, biomassa dikeringkan
dengan menggunakan frezee dryer dan ditentukan berat
keringnya. Biomassa keringnya ditunjukan seperti pada
gambar berikut:
Gambar 3.3. Biomassa kering
Gambar 3.2 Grafik Sisa Gula Reduksi Sel Bebas
Z.mobilis
Grafik menunjukan bahwa pada jam ke 22 sisa
gula reduksinya makin sedikit, diasumsikan semakin
banyak gula yang digunakan untuk produksi etanol.
Berdasarkan kesetimbangan ATP, stoikiometri
produksi etanol dengan menggunakan substrat glukosa
dapat dituliskan sebagai berikut:
2 C 2 H 5 OH +2CO 2 +ATP
C 6 H 12 O 6 + ADP + Pi
Berdasarkan hal tersebut dapat diketahui
bahwa secara teoritis yield etanol adalah 0,51 gram
etanol per gram glukosa (El-Mansi, 2007).
Di atas 22 jam bakteri telah memasuki fase
stasioner. Pada fase ini jumlah populasi sel tetap karena
jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang
mati. Ukuran sel pada fase ini lebih kecil karena sel tetap
membelah meskipun zat nutrisi sudah habis. Karena
kekurangan zat nutrisi, maka kemungkinan sel tersebut
mempunyai komposisi berbeda dengan sel yang tumbuh
pada fase logaritma . Pada fase ini sel-sel menjadi lebih
tahan terhadap keadaan ekstrem seperti panas, dingin,
radiasi dan bahan kimia. Selanjutnya bakteri akan
menghadapi fase kematian, dimana sebagian populasi
bakteri mulai mengalami kematian karena sebab, yakni:
(1) nutrien di dalam medium sudah habis, (2) energi
cadangan di dalam sel habis. Jumlah sel yang mati
semakin lama akan semakin banyak, dan kecepatan
kematian dipengaruhi kondisi nutrien, lingkungan dan
jenis bakteri.
3.3 Fermentasi Pada
Produksi Biomassa
Media
Prosiding Kimia FMIPA
Kompleks
Untuk
Berat biomassa kering yang diperoleh sebesar 4 gram.
3.4 Permeabilisasi Sel Z. Mobilis
Permeabilisasi merupakan suatu proses mengubah
permeabilitas membran dari semipermeabel menjadi
permeabel. Pada poses ini substansi sel seperti glukosa,
nukleotida, dan mikromolekul lainnya keluar dari sel
sementara untuk makromolekul seperti enzim masih
tertinggal di dalam sel. Salah satu keuntungan dari
peningkatan permeabilitas sel adalah lingkungan dapat
dikontrol dengan mengubah media eksternal, sehingga
kondisi optimal dapat ditentukan (Kazuhiko dan Kozo,
1995). Permeabilisasi dilakukan dengan menggunakan
toluen-etanol yang merupakan pelarut organik. Pelarut
organik ini berperan dalam membuat kanal-kanal pada
membrane sel, sebagai jalur keluar masuk nutrisi dan
enzim. Toluen dan etanol akan memperlemah struktur
sel yang ditandai dengan banyaknya protein yang
dilepaskan dari dalam sel. Penambahan kedua pelarut
pertama-tama akan menghancurkan membran protein
yang ada pada sel. Aksi tersebut akan memeperlemah
membran sel sehingga akan mengijinkan
protein
sitoplasmik keluar dalam jumlah yang besar dari dalam
sel. Hal tersebut dapat menghancurkan dinding sel.
Selain kedua pelarut tersebut pelarut lainnya yang biasa
digunakan adalah toluene, eter, feniletil alcohol DMSO,
benzene, methanol dan kloroform. Bahan kimia lain
yang digunakan dalam proses permeabilisasi ini adalah
EDTA (bahan pengkelat) yang digunakan luas untuk
merubah permeabilitas mikroorganisma gram negative,
dalam percobaan ini adalah Z. mobilis. Keefektifannya
adalah berkat kemampuannya dalam mengikat ion
divalen Ca dan Mg. Kation tersebut menstabilisasikan
struktur membranluar dengan cara mengikatkan
polisakarida yang satu dengan yang laimmya.
Penghilangan kation tersebut oleh EDTA akan
meningkatkan permeabilitas dari dinding luar sel. SDS
berfungsi sebagai detergen dimana penggunaan deterjen
akan mengakibatkan kerusakan membran sel dan
melarutkan lipida-lipida yang ada.
Deterjen akan
melarutkan sebagian membran sel dan mengekstraksi
enzim ikatan membran. Keseluruhan kerja tersebut akan
membuat membran sel menjadi terpermeabilisasi dan sel
akan mengeluarkan mikronutrien yang dimilikinya
seperti NADH, ATP, FAD, garam-garaman dan protein.
Keluarnya mikronutrien ini ditandai dengan warna sel
yang semakin pucat sementara filtrat akan berwarna lebih
keruh (kekuningan).
Pada percobaan ini penulis
menggunakan perbandingan etanol:toluen = 4:1, yang
merupakan perbandingan toluen dan etanol yang terbaik
untuk proses permeabilisasi, berdasarkan percobaan yang
telah dilakukan oleh Kozo (1995).
Gambar 4.4
menunjukan hasil permeabilisasi Z. mobilis.
Keluarnya mikronutrien ini ditandai dengan
warna sel yang tadinya berwarna kekuningan berubah
menjadi semakin pucat (putih) sementara filtrat yang
mula-mula berwarna jernih akan berubah warna menjadi
lebih keruh (kekuningan). Hal ini menunjukan bahwa
terdapat senyawa kimia dari dalam sel Z. Mobilis yang
terekstrak ke dalam pelarut. Adanya kandungan protein
yang dilepaskan oleh sel Z. Mobilis dapat dihitung
dengan menggunakan spektrofotometer, yaitu dengan
mengukur absorbansi filtrat pada panjang gelombang 270
nm, yang merupakan panjang gelombang dari serapan
asam amino tirosin dan triptopan (Okuma,1990). Dimana
serapan dari supernatan adalah sebesar 0,295,
menandakan adanya protein yang terekstrak ke pelarut.
sekunder dari sel Z. mobilis . Hal itu disebabkan karena
selnya telah mati dalam proses permeabilisasi. Etanol
yang dihasilkan oleh Z. mobilis permeabel dihasilkan
oleh enzim yang telah teramobilisasi oleh selnya sendiri.
Hal itulah yang menyebabkan hasil produksi etanol
dengan menggunakan Z. mobilis permeabel lebih banyak
dibandingkan dengan yang dihasilkan oleh Z. mobilis
yang tidak permeabel. Produksi etanolnya sendiri masih
mengikuti jalur Entner Doudoroff. Berdasarkan jalur ini
mula- mula glukosa dioksidasi oleh ATP menjadi
glukosa-6- fosfat oleh dengan menggunakan bantuan
enzim heksokinase , sementara ATPnya sendiri tereduksi
menjadi ADP.
Selanjutnya terjadi oksidasi gugus
aldehid dari glukosa 6-fosfat menjadi 6-fosfoglukonat
dan NADPH2, reaksi ini melibatkan enzim glukosa-6fosfat dihidrogenase. Setelah itu akan terjadi dehidrasi
dari 6-fosfat glukonat menjadi 2-keto-3-deoksi-6fosfoglukonat (KDPG).
Reaksi ini terjadi dengan
menggunakan enzim 6- fosfoglukonat dehidratase.
Kemudian terjadi pemecahan KDPG oleh enzim KDPG
aldolase menghasilkan piruvat dan gliseraldehid 3-fosfat.
Piruvat inilah yang nantinya akan menghasilkan
asetaldehid dan selanjutnya menghasilkan etanol.
Sel Z. mobilis diinkubasi dalam mikronutrien
– mikronutrien selama 15 menit dalam suhu ruangan,
sel kemudian dipisahkan dari supernatannya dengan
menggunakan sentrifuge pada kecepatan 3000 rpm.
Supernatan kemudian diuji sisa kandungan substrat
glukosanya.
Hasil pengujian menunjukan bahwa
terdapat sisa kandungan glukosa sebesar 8,659 g/L. Hal
tersebut menunjukan bahwa terdapat glukosa yang
berkurang jumlahnya, diasumsikan bahwa glukosa
tersebut digunakan untuk produksi etanol. Etanol yang
dihasilkan berdasarkan perhitungan adalah sebesar 0,69
gram. Untuk mengetahui keberadaan etanol, supernatan
selanjutnya digunakan untuk uji etanol secara kualitatif.
3.6 Uji Kualitatif Kadar Etanol
Adanya etanol dalam suatu larutan diuji secara
oksidasi dengan menggunakan larutan K 2 Cr 2 O 7 .
Prinsip yang digunakan adalah reaksi redoks antara
etanol dengan kalium dikromat dalam suasana asam.
Reaksi
yang
terjadi
adalah:
3 C 2 H 5 OH + 2K 2 Cr 2 O 7 + 8H 2 SO 4
3 CH 3 COOH + 2Cr 2 (SO 4 ) 3 +11 H 2 O +
2K 2 SO 4
(a)
(b)
(c)
Gambar 4.4 (a) Sel Z.mobilis yang diinkubasi dalam
pelarut pada proses permeabilisasi, (b) Supernatan hasil
permeabilisasi, (c) Sel Z.mobilis Permeabel
3.5 Produksi Etanol Menggunakan Z. Mobilis
Permeabel
Produksi etanol menggunakan Z.
mobilis permeabel dilakukan dengan cara menambahkan
terlebih dahulu mikronutrien-mikronutrien yang telah
keluar dari sel pada proses permeabilisasi. Mikronutrien
ini diantaranya adalah MgCl 2 , ATPNa 2 , NAD,dan
glukosa 10%. Tanpa adanya mikronutrien ini produksi
etanol tidak dapat terjadi. Disini MgCl 2 berperan sebagai
kofakrtor dalam proses produksi etanol. Koenzim
ATPNa 2 berfungsi untuk menghantarkan gugus fosfat,
sementara NAD berfungsi adalam transfer hidrogen.
Glukosa merupakan substrat yang secara metabolik akan
diubah susunan kimianya oleh enzim untuk
menghasilkan etanol Pada produksi etanol dengan
menggunakan Z. mobilis
permeabel, etanol yang
dihasilkan bukan lagi merupakan hasil metabolit
Prosiding Kimia FMIPA
Reaksi ini ditandai berubahnya warna kalium
dikromat yang mula- mula berwarna jingga menjadi
hijau kebiruan
(Jungreis, 1926).
Gambar 4.5
menunjukan perubahan warna dari kalium dikromat
sebelum dan sesudah penambahan etanol.
Gambar 4.5 (a) Kalium dikromat dan (b)
Kalium dikromat dengan penambahan etanol
Gambar 4.5 menunjukan bahwa ion Cr (VI)
yang mula- mula berwarna jingga telah tereduksi oleh
etanol menjadi ion Cr (III) yang berwarna hijaukebiruan.
Hal ini juga diperkuat dengan melihat
absorbansi kedua larutan pada panjang gelombang 480
nm yang merupakan panjang gelombang serapan ion Cr
(VI). Absorbansi ion Cr (VI) mula- mula adalah sebesar
0,180, kemudian setelah direaksikan dengan etanol
absorbansinya turun menjadi 0,070. Data absorbansi ini
mengindikasikan bahwa sebagian ion Cr (VI) telah
tereduksi menjadi ion Cr (II). Masih terdeteksinya ion
Cr (VI) menunjukan bahwa kalium dikromat yang
digunakan merupakan kalium dikromat
4. Kesimpulan
Kesimpulan yang diperoleh berdasarkan hasil
penelitian adalah sel Z.mobilis permeabel dapat
menghasilkan etanol yang ditandai dengan terjadinya
pengurangan substrat glukosa, yang diperoleh dari kerja
enzim pembentuk etanol yang terdapat pada sel
permeable
Ucapan Terima Kasih
1. Drs. Refdinal Nawfa, M.S selaku dosen
pembimbing atas dukungan, bimbingan dan
motivasi yang diberikan
2. Dra. Yulfi Zetra, M.Si., selaku koordinator tugas
akhir
3. Kedua Orang Tua atas dukungan dan doanya
4. Semua pihak yang mendukung yang tidak dapat
saya sebutkan satu persatu hingga terselesainya
penelitian ini
Daftar Pustaka
B. Sikyta, (1983), Methods in Industrial Microbiology,
Ellis Horwood Ltd, Toronto
Beck, James S, (1980), Biomembrans. Fundamentals in
relation to human biology, Hemisphere
Publishing Coorporation, Washington
Becker, Wayne M, (1986), The World of The Cell,The
Benjamin Cummings Publishing Company,
Inc.Menlo Park, California
Cahyanto, (2008), Tinjauan Spektrofotometer, Erlangga,
Jakarta
Chelico, Linda, dan George, Khachatourians, (2003),
Permeabilization of Beauveria bassiana
Blastospores for in Situ Enzymatic Assay, J.
Mycology, Vol. 95, N0. 5, The Mycologycal
Society of America, pp: 976-981
Conway, (1939), Micro-diffusion Analysis and
Volumetric Error, Crosby Lockwood, London ,
p. 435.
C.R. Engler, (1985), Comprehensive biotechnology,
Ellis Horwood, Toronto chapter 20, pages 305–
324
Day, R. A. Jr and A. L. Underwood, (1998),
Kimia Analisa Kuantitatif, Edisi revisi,
terjemahan R. Soendoro, dkk. Erlangga ,
Jakarta
Dwidjoseputro, (1995),
Dasar-dasar Mikrobiologi,
Erlangga, Jakarta
Hadi Anim, ( 2009), Spektrofotometri, Erlangga, Jakarta
Hadioetomo, Ratna Siri, (1993), Mikrobiologi Dasar
dalam Praktek, PT Gramedia Pustaka Utama,
Jakarta
Irawan, (2008), Teknik Pewarnaan Mikroba, UI Press,
Jakarta
Prosiding Kimia FMIPA
J. Darbyshire, (1977), Large scale enzyme extraction
and recovery, volume 5 of Topics in Enzyme and
Fermentation Biotechnology,. John Wiley and
Sons, Toronto, chapter 3, pages 147–186
Kazuhiko T and Kozo O, ( 1995), Recontruction of
Ethanol Fermentation In Permiabilized Cells
of The Yeast Sacaromices cereviseae, Jurnal Of
Fermentation and Bioengineering, Vol. 79, No.1
Keenan R, (1992), Kimia untuk Universitas, Erlangga,
Jakarta
L. Edebo, (1969), Disintegration of Cells, Fermentation
Advances. Academic Press, pages 249–271
Martin, D.W., D.A. Mayes., and V.W. Rodwell, (1983),
Harper’s Review of Biochemistry. Lange
Singapore: Medical Publication
Matthew Ng, (2001), Cell Permeabilization Using
Supercritical Carbon Dioxide, the University
of Waterloo, Ontario
(2004),
Kimia SMA Kelas XI,
Michael Purba,
Erlangga, Jakarta
P. Gunasekaran and K.C. Raj, (1999),
Ethanol
fermentation technology - Zymomonas mobilis,
Current Science, 77(1):56–68
Peter Chen, (1997), Microorganisms & Biotechnology,
John Murray Ltd., London
Primrose, S.B, (1987), Modern Biotechnology,
Blackwell Scientific Publications. Oxford
Riyadi W, (2008), Perbedaan Spektrometri dan
Spektrofotometri, Erlangga, Jakarta
Salisbury, Frank B. dan Ross, Cleon W, (1995),
Fisiologi Tumbuhan, Jilid I. Terjemahan, ITB,
Bandung
Schlegel,H.G. dan Schmidt, K, (1994), Mikrobiologi
Umum. Gadjah Mada University Press ,
Yogyakarta.
Swings, J. and De Ley, J, ( 1977), Bacteriol. Rev., 41, 1–
46.
Timotius, K.H, (1982), Mikrobiologi Dasar; Universitas
Kristen Satya Wacana, Salatiga
Waites, M.J., Morgan, N.L., Rockey, J.S., and Gary
Higton, (2001). Industrial Microbiology: An
Introduction.: Blackwell scie
Waluyo,Lud.Drs.M.Kes, (2004), Mikrobiologi Umum.,
Universitas Muhammadiyah Press, Malang