OPTIMALISASI pH PRODUKSI ENZIM AMILASE BAKTERI

OPTIMALISASI pH PRODUKSI ENZIM AMILASE BAKTERI
ENDOFITIK Pseudomonas stutzery LBKURCC46
Marsiti1, Silvera Devi2, Saryono2
1
Mahasiswa Program Studi S1 Kimia
2
Bidang Biokimia Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau
Kampus Bina Widya Pekanbaru, 28293, Indonesia
[email protected]
ABSTRACT
Amylase is an hydrolase enzyme which hydrolyze starch into maltose and glucose.
Amylase has been produced by Pseudomanas stutzery LBKURCC45, LBKURCC46,
and LBKURCC55, the endophytic bacteria. Amylase activity was determined based on
the reducing sugars formed from starch hydrolisis by amylase with the DNS
(dinitrosalicylic acid) method on a UV-Vis spectrophotometer at 540 nm. The highest
amylase activity at pH 7.0, 40°C and agitation of 120 rpm was shown by LBKURCC46
bacteria. Furthermore, the optimization of amylase production by LBKURCC46
bacteria was conducted at various pHs (6.0; 6.5; 7.0; 7.5). The results showed that the
optimum activity was 27.5308 x 10-3 U/mL at pH 6.5.
Keywords : Amylase, DNS, Pseudomanas stutzery
RINGKASAN
Amilase adalah enzim hidrolase yang menghidrolisis amilum menjadi maltosa dan
glukosa. Produksi enzim amilase dilakukan terhadap Pseudomanas stutzery
LBKURCC45, LBKURCC46, dan LBKURCC55 yang merupakan bakteri endofitik
strain lokal. Aktivitas amilase yang dihasilkan dihitung berdasarkan gula pereduksi
yang terbentuk dari proses hidrolisis substrat amilum oleh enzim amilase dengan
metode DNS (asam dinitrosalisilat), menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang 540 nm. Analisis aktivitas amilase tertinggi dari ketiga bakteri
endofitik yang diproduksi pada pH 7,0 suhu 40°C dan agitasi 120 rpm diperoleh bakteri
LBKURCC46. Selanjutnya dilakukan optimalisasi produksi enzim amilase bakteri
LBKURCC46 pada variasi pH (6,0; 6,5; 7,0; 7,5). Hasil penelitian menunjukkan bahwa
aktivitas enzim amilase optimum diperoleh pada pH 6,5 sebesar 27,5308 x 10-3 U/mL.
Kata kunci : Amilase, DNS, Pseudomanas stutzery
PENDAHULUAN
Enzim amilase merupakan enzim
ekstraselular yang memecah ikatan α-1,4
secara acak dari bagian dalam pada
molekul amilum dan menghasilkan
produk dengan berat molekul yang lebih
rendah seperti maltosa dan glukosa
(Lily, 2012; Melliawati, 2006). Enzim
amilase memiliki nilai komersial tinggi,
1
sehingga banyak digunakan dalam
berbagai bidang industri seperti industri
pati, alkohol, kertas, tekstil, pangan dan
industri farmasi (Sebayang, 2005., Karri
et al., 2014). Dalam industri pangan,
enzim amilase dimanfaatkan untuk
hidrolisis pati dan hasil hidrolisisnya
dapat digunakan untuk produksi sirup
glukosa yang mempunyai tingkat
kemanisan relatif tinggi, serta untuk
pembuatan roti, dan makanan bayi
(Setiasih et al., 2006).
Salah satu sumber enzim yang
banyak di gunakan adalah dari mikroba,
terutama berasal dari kultur Aspergillus,
Bacillus, Clostridium, Pseudomonas,
Rhizopus dan Streptomyces (Pandey et
al., 2000) dan pada tahun 2012 Robi’a
juga berhasil menemukan beberapa
bakteri
endofitik
yang
mampu
menghasilkan enzim amilase. Bakteri
endofitik adalah bakteri yang hidup
dalam
jaringan
tanaman
tanpa
membahayakan tanaman inangnya.
Setiap tanaman tingkat tinggi dapat
mengandung beberapa mikroba endofitik
yang juga mampu menghasilkan
senyawa metabolit sekunder sesuai
dengan tanaman inangnya, hal ini diduga
sebagai akibat koevolusi atau transfer
genetik (genetic recombination) dari
tanaman inang kepada mikroba endofitik
(Radji, 2005)
Bakteri endofitik Pseudomanas
stutzery LBKURCC45, LBKURCC46
dan LBKURCC55 yang telah diisolasi
dari umbi tanaman dahlia (Dahlia
variabilis)
oleh
robi’a
(2012)
menunjukkan bahwa bakteri ini mampu
menghasilkan enzim amilase dengan
cara menghidrolisis amilum yang
ditandai dengan adanya zona bening
disekitar koloni bakteri. Oleh karena itu
pada penelitian ini dilakukan produksi
enzim amilase dari bakteri endofitik
Pseudomonas stutzery LBKURCC45,
dan
LBKURCC46,
LBKURCC55
menentukan aktivitas amilase yang
dihasilkannya. Salah satu isolat yang
menghasilkan aktivitas enzim amilase
tertinggi dilakukan optimalisasi pH, suhu
dan agitasi.
METODE PENELITIAN
a.
Alat yang digunakan
Alat-alat yang yang digunakan
dalam penelitian ini antara lain:
timbangan analitik, mikropipet, jarum
ose, Autoklaf (All American Model No.
2X), Waterbath (Grand Instrument Type
SUB 28), Incubator (Memmert), pH
meter (Hanna Instrument H18014),
Vortex (H-VM-300), Shaking Incubator
(manufacturer of Lab, Ind. Dan Vac
Instrument), Spektrofotometer UV-VIS
(Thermo Scientific Model Genesys 10S)
dan peralatan gelas lainnya, sesui dengan
prosedur kerja.
b. Bahan yang digunakan
Isolat
bakteri
endofitik
Pseudomonas stutzery LBKURCC45,
LBKURCC46 dan LBKURCC55 yang
merupakan koleksi Laboratorium Enzim,
Fermentasi dan Bio Molekuler FMIPA
UR. Bahan-bahan kimia yang digunakan
yaitu akuades, aluminium foil, Nutrient
agar (Merck, No. cat. 1.05450.0500),
Nutrient broth (Merck, No. cat.
1.05443.0500), NaN3, filter glass fiber
(Whatman GF/C), glukosa, amilum,
buffer posfat, reagen Dinitrosalisilat
(DNS) dan bahan-bahan lain yang
digunakan adalah bahan tingkat analisis
sesui metoda kerja.
2
c.
Peremajaan bakteri
Media Nutrien Agar (NA) miring
disterilisasi
menggunakan
autoklaf
dengan tekanan 15 lb, suhu 121°C
selama 20 menit. Kemudian masingmasing kultur stok isolat Pseudomonas
stutzery LBKURCC45, LBKURCC46
dan LBKURCC55 diambil satu ose
secara aseptis dari stok Nutrient broth
(NB) dan diinokulasikan kedalam media
NA dan diberi label, selanjutnya
diinkubasi pada suhu 37oC selama 24
jam dalam inkubator.
d. Pembuatan
endofitik
inokulum
bakteri
Bakteri hasil peremajaan diambil
satu ose secara aseptis dan dimasukkan
kedalam 50 mL media cair NB.
Kemudian diinkubasi dalam shaking
incubator dengan kecepatan agitasi 120
rpm pada suhu 40oC selama 12 jam.
Suspensi bakteri ini digunakan sebagai
starter, selanjutnya dilakukan pengukuran
OD (Optical Density) menggunakan
spektrofotometer
UV-Vis
dengan
panjang gelombang 660 nm.
e.
Pembuatan media cair
produksi enzim amilase
untuk
Produksi enzim amilase digunakan
media NB mengandung amilum 1%
(w/v). Pseudomonas Stutzery dari
masing-masing kultur yang telah
diremajakan, diambil 10% kemudian
diinokulasi dalam 100 mL media
produksi NB mengandung amilum 1%
(w/v) dan diinkubasi dalam shaker
incubator pada 120 rpm dan suhu 40°C
selama 12 jam (Sarah, et al., 2010).
Setelah 12 jam, media kultur yang
berisi ekstrak kasar enzim didinginkan
pada suhu 4°C selama kurang lebih 1
jam, kemudian disentrifugasi 9500 rpm
selama 15 menit (Sumrin et al., 2011).
Ekstrak kasar enzim disaring dengan
filter glass fiber (Whatman GF/C).
Ekstrak kasar yang diperoleh diambil
dengan mikropipet untuk di uji aktivitas
enzimnya. Jika enzim tidak langsung
digunakan untuk analisis aktivitas enzim,
maka ditambahkan NaN3 hingga
konsentrasi larutan menjadi 0,02% (w/v)
kedalam setiap larutan ekstrak kasar
enzim amilase.
f.
Penentuan aktivitas enzim amilase
menggunakan metode DNS
Tabung uji, kontrol dan blanko
dilakukan secara bersamaan. Tabung uji
diisi dengan 1,0 mL substrat amilum 1%,
tabung kontrol dibiarkan kosong
sedangkan blanko diisi dengan 2,0 mL
buffer posfat 0,05 M pH 7,0. Ketiga
tabung dimasukkan ke dalam waterbath
dan diinkubasi pada suhu 40°C selama 5
menit. Setelah diinkubasi selama 5
menit, ke dalam tabung uji dan kontrol
masing-masing ditambahkan 1,0 mL
ekstrak kasar enzim dan diinkubasi
kembali dalam waterbath dengan suhu
40°C selama 15 menit.
Setelah diinkubasi selama 15 menit,
masing-masing tabung (uji, kontrol dan
blanko) ditambahkan 2,0 mL DNS dan
pada tabung kontrol ditambahkan 1,0
mL substrat amilum 1%, kemudian
ketiga tabung ini dimasukkan kedalam
waterbath pada suhu 100°C selama 10
menit. Selanjutnya larutan didinginkan
dan diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 540 nm (Anam, 2010).
Bakteri yang menghasilkan aktivitas
enzim amilase tertinggi dilakukan
optimalisasi pH untuk produksi enzim
amilase.
3
g.
Optimalisasi pH produksi enzim
amilase
HASIL DAN PEMBAHASAN
a.
Isolat bakteri yang menghasilkan
aktivitas enzim amilase tertinggi diambil
10% dan dimasukkan kedalam 50 mL
media produksi enzim dengan variasi pH
media (6,0; 6,5; 7,0 dan 7,5), kemudian
diinkubasi dalam shaking incubator pada
120 rpm dan suhu 40°C selama 12 jam.
Selanjutnya media yang berisi ekstrak
kasar enzim tersebut didinginkan pada
suhu 4°C dalam lemari pendingin,
kemudian disentrifugasi selama 15 menit
dengan kecepatan 9500 rpm (Sumrin et
al., 2011). Ekstrak kasar enzim disaring
dengan filter glass fiber (Whatman
GF/C). Ekstrak kasar enzim amilase
yang diperoleh ditentukan aktivitasnya.
Penentuan aktivitas enzim amilase
tertinggi
dari
bakteri
LBKURCC45, LBKURCC46 dan
LBKURCC55
Aktivitas ekstrak kasar enzim
amilase yang dihasilkan dari ketiga isolat
ditentukan berdasarkan jumlah gula
pereduksi yang dihasilkan dari reaksi
antara amilase dengan amilum 1%
sebagai substratnya tiap satuan waktu.
Kadar gula pereduksi ditentukan dengan
metode DNS (Dinitrosalisilyc acid).
Hasil aktivitas amilase dari ketiga isolat
pada pH 7,0 suhu 40°C dan agitasi 120
rpm dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Aktivitas ekstrak kasar enzim amilase yang dihasilkan dari tiga isolat
Pseudomonas stutzery pada pH 7 media produksi
Isolat
Aktivitas Enzim Amilase x 10-3 (U/mL)
LBKURCC45
10,8642
LBKURCC46
15,1851
LBKURCC55
9,6296
Data aktivitas ekstrak kasar enzim
amilase yang diperoleh menunjukkan
bahwa isolat Pseudomonas stutzery
LBKURCC46 menghasilkan aktivitas
enzim amilase tertinggi sebesar (15,1851
x 10-3) U/mL dibandingkan dua isolat
lainnya. Sehingga untuk optimalisasi pH,
suhu dan agitasi produksi enzim amilase
digunakan isolat Pseudomonas stutzery
LBKURCC46.
b. Penentuan pH optimal untuk
produksi enzim amilase dari isolat
LBKURCC46
Produksi enzim amilase dari isolat
bakteri LBKURCC46 dilakukan dengan
variasi pH media produksi yaitu 6,0; 6,5;
7,0; dan 7,5 menggunakan buffer posfat
0,05 M pada suhu 40°C dan agitasi 120
rpm. Dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Aktivitas ekstrak kasar enzim amilase yang dihasilkan dari Pseudomonas
stutzery LBKURCC46 pada variasi pH media produksi
Variasi pH
Aktivitas Enzim Amilase x 10-3 (U/mL)
6,0
7,5308
6,5
7,0
27,5308
15,1851
7,5
5,5555
4
Tabel 2 menunjukkan bahwa
semakin tinggi pH maka aktivitas enzim
semakin meningkat, setelah pH optimum
aktivitas enzim mulai menurun dengan
kenaikan pH. Menurut Asnani dan Puji
(2009) perubahan pH atau pH yang tidak
sesuai akan menyebabkan rusaknya
struktur sekunder dan tersier (denaturasi)
pada enzim. Perubahan pH ini
menyebabkan
berubahnya
struktur
katalitik
pada permukaan enzim
sehingga akan berpengaruh terhadap
bagian aktif enzim untuk membentuk
kompleks enzim substrat. Penyebab lain
turunnya aktivitas enzim menururt
Nisa et al. (2013) adalah perubahan
muatan enzim beserta substratnya. Hal
ini terjadi karena adanya perubahan sifat
ionik yang terdapat pada gugus karboksil
dan gugus amino pada enzim. Perubahan
muatan pada enzim dapat mempengaruhi
aktivitas enzim, pada nilai pH rendah
enzim
mengalami
protonasi
dan
kehilangan muatan negatifnya. Hal yang
sama pada pH tinggi substrat akan
terionisasi dan kehilangan muatan
positifnya.
KESIMPULAN
Aktivitas enzim amilase masingmasing isolat Pseudomonas stutzeri pada
kondisi fermentasi pH 7,0 suhu 40°C dan
agitasi 120 rpm yaitu LBKURCC45
sebesar (10,8642 x 10-3) U/mL,
LBKURCC46 sebesar (15,1851 x 10-3)
U/mL dan LBKURCC55 sebesar
(9,6296 x 10-3) U/mL, jadi isolat yang
memiliki aktivitas enzim amilase
tertinggi adalah bakteri Pseudomonas
stutzery LBKURCC46.
Hasil optimalisasi produksi enzim
amilase diperoleh pada pH 6,5 sebesar
(27,5308 x 10-3) U/mL.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapakan terima kasih
kepada Ibu Dra. Silvera devi, Sy, M.Si
dan Bapak Prof. Dr. Saryono, M.Si yang
telah berkenan membimbing dan
memotivasi serta membantu penelitian
dan penulisan karya ilmiah ini.
DAFTAR PUSTAKA
Anam, K. 2010. Laporan Praktikum
Mikrob dan Potensinya, Produksi
Enzim
Amilase.
Bioteknologi
Sekolah
Pascasarjana.
Institut
Pertanian Bogor, Bandung.
Asnani, A dan Puji, L. 2009. Aktivitas
Amilase, Lipase dan Protease dari
Cacing Peryonic excavates. Jurnal
Molekul. 4: 115-121.
Karri, S., Sridhar, G, T., Renuka dan
Sunny, D. 2014. Screening and
Production Optimisation of αamylase from Aspergillus Strains by
Using Solid State Fermentation.
International Journal of Current
Microbiology
and
Appliyed
Sciences. 3(4): 623-631.
Lily, M.K., Ashutosh ,B., Kamlesh K.B.,
dan Koushalya D. 2012. Production,
Partial
Purification
and
Characterization of α-Amilase from
High Molecular Weight Polycyclic
Aromatic Hydrocarbons (HMWPAHs) Degrading Bacillus subtilis
BMT4i (MTCC 9447). Turkish
Journal of Biochemistry. 37(4):
463–470.
Melliawati, R., Ricky S, S., and
Bambang, S. 2006. Pengkajian
Kapang Endofit Dari Taman
Nasional Gunung Halimun Sebagai
5
Penghasil Glukoamilase. Berk. Panel.
Hayati. 12: 19-15.
Nisa, K., Wuryanti dan Taslimah. 2013.
Isolasi,
Karakterisasi
dan
Amobilisasi
α-amilase dari
Aspergillus niger FNCC 6018.
Chem Info. 1:141-149.
Prosiding Kimia FMIPA. Institut
Teknologi Sepuluh Nopember,
Surabaya.
Sebayang, F., Nisa, K., Wuryanti dan
Taslimah.
2013.
Isolasi,
Karakterisasi dan Amobilisasi αamilase dari Aspergillus niger
FNCC 6018. Chem Info. 1:141-149.
Pandey, A., Nigam, P., Soccol, C.R.,
Soccol, V.T., Singh, D., dan Mohan,
R. 2000. Advances in Microbial
Amylases.
Biotechnol.
Appl.
Biochem. 31: 135-152.
Setiasih, S., Budiasih, W., dan
Trismilah.
2012.
Karakterisasi
Enzim α-Amilase Ekstrasel dari
Isolat Bakteri Termofil SW2. Jurnal
Kimia Indonesia. 1(1): 22-27.
Robi’a. 2012. Skrining Bakteri Endofitik
dari Umbi Tanaman Dahlia (Dahlia
variabilis).
Skripsi.
FMIPA
Universitas Riau, Pekanbaru.
Sumrin, A., Waqar, A., Bushra, I.,
Muhammad, T.S., Sana, G.,
Humera, K., Imran S., Shah, J.,
Sultan, A., Mureed, H., dan Sheikh,
R. 2011. Purification and Medium
Optimization of α-amilase from
Bacillus subtilis 168. African
Journal of Biotechnology. 21192129.
Sarah., Surya, R.P., dan Herdayanto,
S.P., 2010. Isolasi α-Amilase
Termostabil dari Bakteri Termofilik
Bacillus
stearothermophilus.
6