SENYAWA FITOALEKSIN DARI TUMBUHAN OBAT

Senyawa Fitoaleksin … (Partomuan Simanjuntak)
SENYAWA FITOALEKSIN DARI TUMBUHAN OBAT INDONESIA
“DEKAR”, Caesalpinia major (FABACEAE)
Partomuan Simanjuntak
Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong
Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila, Jakarta
Abstract
Some furan diterpene type compounds have been isolated and elucidated as caesaldekarin a, b, c,
d, e and f from Caesalpinia major. Recently, a phytoalexin compound, 12-oxy-7-oxosandaracopymaradiene has been isolated and identified from the same plant. The structure was
elucidated based on interpretation by infrared, nuclear magnetic resonance (1H-NMR, 13C-NMR)
and two-dimensional NMR (1H-1H COSY and 13C-1H COSY) and mass spectroscopy.
Key words:
Indonesian medicinal plant; Phytoalexin; 12-oxy-7-oxosandaracopy- maradiene;
Caesalpinia major; Fabaceae
PENDAHULUAN
Fitoaleksin “Phytoalexin” didefinisikan
sebagai senyawa kimia yang mempunyai berat
molekul rendah yang memiliki sifat antimikroba atau
antiparasit. Senyawa ini diproduksi oleh tanaman
pada waktu mengalami infeksi atau cengkraman
(stress) lingkungan.
Senyawa fitoaleksin seperti orizaleksin A, B,
dan C telah berhasil diisolasi dan dielusidasi struktur
kimianya dari daun Pyricularia oryzae yang
terinfeksi (2,6).
Substansi fitoaleksin lainnya dari tumbuhan
P. oryzae yang pernah diteliti adalah momilakton A
dan B. Senyawa kimia ini dapat terjadi sebagai
fitoaleksin dalam coleoptile beras yang teriradiasi
oleh ultra-violet (1).
Fitoaleksin yang merupakan hasil dari
metabolisme sekunder, mempunyai struktur kimia
yang bermacam-macam tergantung pada species
tanaman yang mensintesisnya. Berdasarkan hasil
penelitian yang telah dilaporkan, senyawa fitoaleksin
dapat
diidentifikasi
menurut
penggolongan
senyawanya, misalnya Leguminosae membentuk
fitoaleksin yang berupa golongan senyawa
isoflavonoid, famili terong-terongan menghasilkan
senyawa seskuiterpen, sedangkan dari famili
Compositae membentuk poliasetilen dan lain-lain.
Dari tumbuhan famili Fabaceae yaitu
tanaman Caesalpinia major, yang dalam tulisan ini
akan dilaporkan bahwa senyawa fitoaleksin yang
terisolasi dan teridentifikasi adalah merupakan
senyawa golongan diterpen.
Caesalpinia major Dandy ex Excel
(Fabaceae) adalah suatu tumbuhan memanjat yang
banyak terdapat di hutan dan di pinggir-pinggir
sungai. Tumbuhan ini di Ruteng, Pulau Flores, Nusa
Tenggara Timur secara tradisional digunakan sebagai
58
obat kuat (tonikum), antelmentik dan juga untuk
menyembuhkan sakit pinggang (3).
Dari penelitian sebelumnya telah dilaporkan
bahwa dari tumbuhan “Dekar” (nama daerah),
Caesalpinia major telah berhasil diisolasi dan
dielusidasi enam senyawa kimia diterpen tipe kasan
yaitu caesaldekarin a (1), b (2), c (3), d (4), e (5) dan
caesaldekarin f (6) (4,5,7). Dalam tulisan ini akan
dilaporkan bahwa selain senyawa kimia tersebut di
atas, juga mengandung suatu senyawa kimia
fitoaleksin yang dinamakan sebagai 12-oksi-7-oksosandarakopimaradiena (7). Hasil reaksi pengubahan
“conversion reaction” senyawa 7 dalam bentuk reaksi
asetilasi dan reaksi hidrogenasi juga akan dilaporkan.
BAHAN DAN METODE
Bahan.
Simplisia akar “Dekar”, Caesalpinia major dalam
penelitian ini dikumpulkan dari Desa Ruteng, Pulau
Flores, Nusa Tenggara Timur. Determinasi dilakukan
di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian BiologiLIPI Bogor dan spesimennya disimpan di Herbarium
tersebut. Pelarut-pelarut kimia seperti metanol, nheksan, etil asetat adalah kualitas teknis yang
digunakan hanya untuk pelarut dalam mengekstraksi,
pelarut pengembang (eluen) pada kromatografi lapis
tipis (KLT) dan untuk kromatografi kolom,
sedangkan untuk kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) digunakan pelarut kualitas HPLC grade
(Lichrosolv).
Bahan kimia seperti dimetilaminopiridin
(DMAP) yang digunakan sebagai katalisator dalam
reaksi esterifikasi, asam asetat anhidrid yang
digunakan untuk reaksi asetilasi, dan natrium
boronhidrida (NaBH4) yang digunakan sebagai
reduktor dalam reaksi hidrogenasi yang semuanya
merupakan bahan kimia produksi dari Sigma Co.
Jurnal Bahan Alam Indonesia ISSN 1412-2855 Vol. 1, No. 2, Juli 2002
Instrumentasi.
Data-data spektra dalam elusidasi struktur
kimia diperoleh dengan menggunakan spektrometer
Hitachi 330 untuk pengambilan data spektra ultra
violet,
spektrometer
JASCO
FT/IR
untuk
pengambilan data spektra infra merah, spektrometer
JMS HX-100 untuk pengambilan data spektra massa
(FAB-MS), Spektrometer NMR JEOL EX-270, dan
NMR GX-500 untuk pengambilan data spektra satu
dimensi resonansi magnet inti (RMI proton dan
13
Karbon), dan dua dimensi seperti 1H-1H COSY,
13
C-1H COSY. Pemurnian senyawa kimia dilakukan
pada alat HPLC Hitachi L-4200 UV/VIS Detektor
dengan pompa Shimadzu LC-6A, dan kolom Zorbax
Sil (7,5 x 30 mm).
O
O
O
OH
H
H
H
H
H
H
OH
H3COOC
OR
Caesaldekarin c (3)
Caesaldekarin a, R=Ac (1)
Caesaldekarin b, R=H (2)
OH
OH
Caesaldekarin d (4)
OH
O
O
15
OAc
H
H
1
H
16
11
10
20
O
AcO
OH
Caesaldekarin e (5)
OH
H
Caesaldekarin f (6)
12-oksi-7-okso-sandara
kopimaradiena (7)
Gambar 1. Senyawa Kimia Hasil Isolasi Dari Tumbuhan “Dekar”, Caesalpinia major
(Fabaceae)
Isolasi.
Simplisia akar “Dekar”, Caesalpinia major
yang telah dikeringkan pada sinar matahari, dipotong
kecil-kecil sebanyak 2,5 kg dan diekstraksi dengan
metanol panas sebanyak tiga kali hingga Uji KLT
tidak memberikan spot atau noda. Hasil ekstraksi
disaring dan diuapkan dengan penguap berputar
bertekanan rendah hingga diperoleh ekstrak methanol
sebanyak 250 g (10%, persentase dihitung dari 1 kg
berat kering simplisia). Sebanyak 150 gram ekstrak
methanol dipartisikan ke dalam campuran air dan etil
asetat = 1 : 1. Lapisan organik etil asetat diuapkan
dan ditimbang sehingga diperoleh ekstrak etil asetat
sebanyak 15 g (1%). Fraksinasi ekstrak etil asetat
sebanyak 50 gram dengan melakukan kromatografi
kolom dengan menggunakan adsorben silika gel (4
kg), sistem pelarut n-heksan-etil asetat = 100 : 1 → 1
: 1 memberikan senyawa Caesaldekarin a (1) (6,43 g,
0,64%) dari fraksi I, sedangkan hasil pemurnian
fraksi II memberikan senyawa Caesaldekarin b (2)
sebanyak 373 mg (0,04%), Caesaldekarin c (3)
sebanyak 59 mg, 1,006%, Caesaldekarin d (4), 12 mg,
0,001%, Caesaldekarin e (5) 63 mg, 0,006% dan
Caesaldekarin f (6) sebanyak 193 mg (0,02%) (4,5).
Fraksi III sebanyak 156 dilakukan pemurnian dengan
kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT, Zorbax Sil,
sistem pelarut n-heksan -etil asetat = 5 : 1) diperoleh
senyawa 7 sebanyak 90 mg (0,009%). Prosedur
isolasi dan pemurnian senyawa kimia dari tumbuhan
“Dekar”, Caesalpinia major, dapat dilihat pada
Gambar 2.
Asetilasi Senyawa 7
Sebanyak 17,1 mg senyawa 7 ditambahkan
dengan 0.5 ml piridin, 5 tetes asetat anhidrid dan 10
tetes Dimetilaminopiridin (DMAP). Reaksi dilakukan
pada suhu 0 °C selama 30 menit dengan dimonitor
59
Senyawa Fitoaleksin … (Partomuan Simanjuntak)
oleh uji kromatografi lapis tipis (KLT). Pada hasil
reaksi ditambahkan air es dan diekstraksi dengan etil
asetat serta diasamkan dengan asam klorida encer,
kemudian dinetralkan dengan natrium hidroksida.
Lapisan organik yang berisi senyawa campuran,
dipisahkan dan dimurnikan dengan kromatografi
kolom (SiO2, 10 gram, sistem pelarut n-heksan-etil
asetat = 8 : 1) dan diperoleh senyawa turunan ester
asetat (senyawa 8) sebanyak 5,7 mg.
*) Dihitung dari 1 kg berat kering
Hidrogenasi senyawa 7
Sebanyak 10,3 mg senyawa 7 ditambahkan
0,5 ml metanol dan 1 mikro spatula penuh Natrium
boronhidrida (NaBH4). Reaksi dilakukan pada suhu
kamar selama 20 menit. Pada hasil reaksi
ditambahkan air es dan diekstraksi dengan etil asetat.
Lapisan organik (etil asetat) diuapkan pada penguap
berputar, kemudian dimurnikan dengan kromatografi
kolom (SiO2, 10 gram, sistem pelarut n-heksan-etil
asetat = 4 : 1) dan diperoleh senyawa 9 sebanyak 8,9
mg.
Akar Dekar (Caesalpinia major)
(2,5 kg)
Diekstraksi dengan MeOH 3x,
disaring, diuapkan
Ekstrak MeOH (250 g, 10%)*
Diambil 150 g)
Dipartisi dalam Etil asetat-air = 1 : 1
Ekstrak EtOAc (100 g, 6,6%)
Ekstrak Air
Kr. Kolom (SiO2, n-heksan-EtOAc =
100 : 1 ~ 1 : 1)
Caesaldekarin a (1)
(6,43 g, 0,64%)
Fr. II
Caesaldekarin b (2), 373 mg, 0,04%
Caesaldekarin c (3), 59 mg, 0,006%
Caesaldekarin d (4), 12 mg, 0,001%
Caesaldekarin e (5), 63 mg, 0,006%
Caesaldekarin f (6), 193 mg, 0,02%
Fr. III (156 mg)
Fr. VIII
KCKT (Zorbax Sil, nheksan-EtOAc= 5 : 1)
12-oksi-7-oksosandarakopimaradiena (7)
(90 mg, 0,009%)
Gambar 2. Isolasi Senyawa Fitoaleksin (12-oksi-7-okso Sandarakopimaradiena) dari
Dekar, Caesalpinia major
HASIL DAN PEMBAHASAN
Senyawa 7 yang diperoleh pada hasil
pemurnian KCKT direkristalisasi dengan pelarut nheksan dan eter. Kristal yang berbentuk padatan dan
tidak berwarna “colorless needless” ini mempunyai
titik lebur (TL) 119 - 121 °C, [α] D + 19,7 ° (c =
0,34 dalam kloroform). Spektrometri ultra-violet
(UV) untuk senyawa 7 tidak menunjukkan adanya
serapan maksimum di atas 200 nm, Pemeriksaan
spectra dari spektrometri infra-merah (IM)
menunjukkan bilangan gelombang pada 3500 dan
60
1700 cm-1 yang membuktikan adanya gugus karbonil
dan hidroksil pada struktur tersebut. Rumus molekul
yang diperoleh berdasarkan spektrometri massa
resolusi tinggi (HR-MS) ditetapkan sebagai C20H30O2
dengan berat molekul berdasarkan perhitungan
(“calculated”) sebesar 302,2243 dan berdasarkan
penemuan (“found”) sebesar 302,2225 (M+).
Penyidikan spektra resonansi magnet inti
(RMI) proton (500 MHz, CDCl3) untuk senyawa 7
menunjukkan adanya sinyal pada δH 3,95 (1H, d,
J=5,0 Hz, H-12) yang karakteristik untuk proton yang
Jurnal Bahan Alam Indonesia ISSN 1412-2855 Vol. 1, No. 2, Juli 2002
visinal dengan gugus hidroksil. Adanya ikatan
rangkap dua pada posisi atom C-14, C-15 dan C-16
ditunjukkan pada δH 5,31 (1H, s, 14-H); 5,75 (1H,
dd, J= 11,0; 18,0 Hz, H-15) dan 4,91 (2H, dd, J
=11,0; 18,0 Hz, H-16a, H-16b).
Dari spektrum RMI 13Karbon (125 MHz,
CDCl3)
dan
analisa
DEPT
(Distortionless
Enhancement by Polarization Transfer) menunjukkan
bahwa semua atom karbon yang terdapat pada
struktur kimia tersebut terdiri dari dua puluh sinyal.
Lima sinyal berada pada daerah medan rendah (“Low
field”) yang karakteristik untuk karbon-karbon dari
ikatan rangkap dua dan karbonil yaitu pada δC 153,3
(s, C-8) ; 130,2 (d, C-14); 148,3 (d, C-15); 110,6 (t,
C-16) dan 210,7 (s, C-7, gugus karbonil). Karbon
teroksigenasi pada δC 82,6 (d) adalah menunjukkan
adanya gugus hidroksil yang berada pada atom C-12
dengan dibuktikan adanya korelasi proton-proton
antara H-12 dan H-11 pada spektrum dua dimensi
RMI (1H-1H COSY). Keberadaan gugus hidroksil
pada C-12 dibuktikan dengan melakukan reaksi
asetilasi pada senyawa 7 yang menghasilkan senyawa
turunan ester asetat (senyawa 8). Penyidikan spektra
RMI proton senyawa 8 menunjukkan adanya muncul
gugus asetoksi pada δH 2,19 (s) dan 4,99 (s, melebar,
H-12) (Lihat Tabel 1).
Tabel 1. Pergeseran Kimia Senyawa 7 (Karbon dan Proton), Senyawa 8, 9 (Proton),
(J dalam Hertz)
No
1
2
Senyawa 3
Karbon
51,3
18,9
3
4
5
6
7
8
9
10
11
22,2
45,6
53,5
34,2
210,7
153,3
44,9
50,5
35,3
12
13
14
15
16
17
18
19
20
OAc
82,6
37,4
130,2
148,3
110,6
16,6*)
15,4*)
26,2*)
29,3*)
Proton
1,42 (m)
2,34 (m)
2,14(ddd,J=5,0;8,5;13,
5
1,74 (m)
2,0 (t,J=9,0)
1,54 (m)
1,68 (dd,J=3,0;12,0)
2,29 (dd,J=13,0;13,0)
2,52 (dd,J=13,0;13,0)
3,95 (d,J=5,0)
5,31 (s)
5,75 (dd,J=11,0;18,0)
4,91 (dd,J=11,0;18,0)
0,70 (s)*)
080 (s)*)
1.04 (s)*)
1,19 (s)*)
-
Senyawa 4
Proton
1,27 (dd,broad)
2,32 (m)
2,14 (m)
Senyawa 5
proton
1,26 (m)
2,35 (m)
2,15 (m)
1,67 (m)
2,11 (d,broad)
1,57 (m)
4,14 (s, broad)
1,64 (dd,J=3,0;12,0)
2,11 (dd,J=13;13)
2,30 (dd,J=13;13)
3,24 (s, broad)
5,27 (s)
5,77 (dd,J=11;18)
4,91 (dd,J=11;18)
1,03 (s)*)
1,04 (s)*)
1,05 (s)*)
1,06 (s)*)
-
1,57 (m)
2,00 (t,J=8)
1,55 (m)
4,99 (s,broad)
1,75 (d,J=11)
2,39 (d,J=12)
2,47 (d,J=12)
4,91 (s)
5,33 (s)
5,76 (dd,J=11;18)
4,94 (dd,J=11;18)
0,83 (s)*)
0,88 (s)*)
1,05 (s)*)
1,12 (s)*)
2,19 (s)
*) : Mungkin saling bertukar
Pengamatan sinyal pada daerah medan tinggi
(high field) menunjukkan adanya empat sinyal yang
ditetapkan sebagai gugus metil masing-masing pada
δH 0,70 (s, H-17); 0,80 (s, H-18); 1,04 (s, H-19) dan
1,19 (s, H-20), dan RMI 13Karbon ditunjukkan pada
δC 16,6 (C-17); 15,4 (C-18); 26,2 (C-19) dan 29,3
(C-20) yang semuanya berbentuk kuartener. Dari
13
analisis
spektrum
2D-RMI
C-1H
COSY
menunjukkan bahwa semua karbon memperlihatkan
korelasi dengan protonnya.
Kemudian pengamatan spektra 2D-RMI (1H1
H COSY ) memberikan hubungan antara protonproton dari H-1 dengan H-2 dan H-10; proton dari H2 dengan H-3; H-5 dengan H-6; H-11 dengan H-12,
dan H-15 dengan H-16. Adanya gugus karbonil pada
atom C-7 dibuktikan dengan tidak adanya korelasi
antara H-6 dengan H-7. Hal ini juga dibuktikan
dengan melakukan reaksi hidrogenasi senyawa 7
dengan Natrium boronhidrida (NaBH4) menjadi
senyawa dihidroksil (9). Spektra RMI proton pada
senyawa 9 menunjukkan adanya perubahan gugus
karbonil menjadi gugus hidroksil yaitu munculnya
sinyal baru pada δH 3,24 (s, melebar, H-7) selain
pada δH 4,14 (H-12) (Lihat Tabel 1). Sehingga dari
hasil analisis spektrum RMI (proton dan 13Karbon)
dan data kimia fisik lainnya untuk senyawa 7 dapat
ditetapkan struktur kimianya sebagai senyawa
fitoaleksin yaitu 12-oksi-7-okso-sandarakopimaradiena (1,2). Data pergeseran kimia proton dan karbon
untuk senyawa 7, dan pergeseran kimia proton untuk
senyawa 8 dan 9 dapat dilihat pada Tabel 1.
61
Senyawa Fitoaleksin … (Partomuan Simanjuntak)
4,91 ppm
2,19 ppm
OAc
H
O
H
OH
(8)
Asetat anh./py.
DMAP, o oC
H
4,14 ppm
OH
O
H
(7)
NaBH4
Suhu kamar
H
3,24 ppm
H
OH
(9)
Gambar 3. Transformasi Kimia Senyawa 7 Dengan Cara Asetilasi Dan Hidrogenasi
KESIMPULAN
1. Hasil isolasi dan elusidasi struktur kimia pada
tumbuhan obat tradisional “Dekar”, Caesalpinia
major (Fabaceae) memberikan enam senyawa
diterpen tipe kasan yaitu Caesaldekarin a, b, c, d,
e, f dan satu senyawa diterpen tipe damaran yaitu
dengan nama fitoaleksin yaitu 12-oksi- 7-oksosandarakopimaradiena.
2. Senyawa Fitoaleksin yang terbentuk pada
tumbuhan Caesalpinia major ada kemungkinan
pada saat pengumpulan material telah terinfeksi
oleh mikroorganisme, dan pada saat melakukan
isolasi dan ekstraksi bahan material tersebut
belum kering sekali.
Ucapan terima kasih
Penulis mengucapkan banyak terima kasih
kepada Prof. I. Kitagawa dan Prof. M. Kobayashi di
laboratorium Natural Product Chemistry, Fac. of
Pharmaceutical Sciences, Osaka University, Japan
dan juga kepada Prof. H. Shibuya di Fukuyama
University, Japan atas bantuan saran-saran dan
pengambilan data-data spektra RMI (proton dan
13
Karbon).
DAFTAR PUSTAKA
1. Akatsuka, T., O. Kodama, H. Kato and S.
Takeuchi,
1983
3-hydroxy-7-oxosandaracopimaradiene (Oryzalexin A), A New
phytoalexin isolated from rice blast leaves, Agric.
Biol. Chem., 47, 445-447
2. Akatsuka, T., O. Kodoma, H. Sekido, Y. Kono
and S. Takeuchi, 1985 Novel Phytoalexin
62
3.
4.
5.
6.
7.
(Oryzalexins A, B and C) Isolated from rice blast
leaves infected with Pyricularia oryzae, Agric.
Biol. Chem., 49, 1689-1694
Kitagawa, I., 1987 Research Report of Naturally
Occuring Drug Materials in Indonesia I, Osaka
University Press, Osaka, Japan, 127 p.
Kitagawa, I., P. Simanjuntak, T. Watano, H.
Shibuya, S. Fujii, Y. Yamagata dan M.
Kobayashi, 1994a Indonesian Medicinal Plants
XI. Chemical Structures of Caesaldekarin a dan b,
Two New Cassane-type Furanoditerpenoid from
the roots of Caesalpinia major (Fabaceae), Chem.
Pharm. Bull. 42, 1798-1802
Kitagawa, I., P. Simanjuntak, T. Mahmud, M.
Kobayashi, S. Fujii, T. Uji and H. Shibuya, 1994b
Indonesian medicinal Plants XIII : Chemical
Structures of Caesaldekarins c, d, and e, three
Additional Cassane-Type Furanoditerpenes from
The Roots of Caesalpinia major (Fabaceae).
Chem. Pharm. Bull. 44, 1157-1161
Kono, Y., S. Takeuchi, O. Kodama, and T.
Akatsuka 1984 Absolute configuration of
Oryzalexin A and structures of its related
phytoalexins isolated from rice blast leaves
infected with Pyricularia oryzae Agric. Biol.
Chem., 48, 253-255
Simanjuntak, P. 1995 Senyawa Furanoditerpenoid
dari “Dekar”, Caesalpinia major (Fabaceae).
UNESCO National Seminar on Chemistry of
Natural Product of Indonesian Plants. Depok,
Februari 1995, 200-207.