3. metodologi penelitian

17
3. METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2011 sampai Maret 2012.
Penelitian ini dilakukan di beberapa laboratorium yaitu, Laboratorium Kimia
Pangan, SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Analisis
Pangan Departemen ITP, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel makanan berupa
daging ayam bagian dada dengan berat per unit sampel 300 g, ikan bawal dengan
berat per ekor 300 g, bumbu kuning (terdiri atas kunyit, lengkuas, bawang putih,
bawang merah, kemiri, merica, garam, dan jahe) yang digunakan untuk penyiapan
ayam panggang dan ikan bakar, standar komponen PAH, yaitu benzo(a)piren
(BAP) dan dibenzo(a,h)antrasen (DBA), asetonitril HPLC-grade, diklorometan
p.a., toluena, n-heksana p.a., akuades Mili-Q grade, NaOH, kolom solid phase
extraction, yaitu kolom ekstrelut Merck® (diatomaceus earth), kolom PRS
(propylsulphonic acid silica) dari SiliCycle® (SiliCycle Inc. Canada), dan silica
gel for HPLC Merck®.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan gelas, pipet
volumetrik, pipet mikro, alat pemanggang dengan menggunakan arang briket
untuk penyiapan ikan bakar dan ayam panggang, food processor. Sedangkan
peralatan yang digunakan untuk analisis PAH adalah instrumen HPLC Agilent
1200 series dengan detektor MWD merk Agilent yang diset pada panjang
gelombang UV (Agilent Technologies, USA) dan kolom ODS (C18) dengan
panjang 15cm, diameter 4.6 mm dan ukuran partikel 5 µm.
3.3 Tahapan Penelitian
Penelitian dilakukan dalam tiga tahapan seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 3. Tahapan pertama adalah validasi metode analisis PAH (secara
simultan untuk BAP dan DBA) dengan tandem SPE dan HPLC meliputi uji
linearitas, uji kesesuaian sistem, penentuan limit of detection (LOD), penentuan
limit of quantification (LOQ), akurasi uji recovery, dan uji repeatability. Tahapan
18
kedua dan ketiga adalah optimasi proses pembuatan ikan bakar dan ayam
panggang yang rendah kandungan PAH dengan melakukan pengujian pada
kombinasi konsentrasi bumbu yang digunakan, jarak pemanasan, dan lama
pemanasan
3.4 Tahap Pertama: Validasi Metode Ekstraksi PAH
Validasi metode analisis polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) dilakukan
dengan cara melakukan uji linearitas dengan standar adisi dalam sampel,
penentuan limit of detection (LOD), penentuan limit of quantification (LOQ), uji
kesesuaian sistem, akurasi uji recovery, dan uji presisi atau repeatabilty dengan
mengikuti metode EURACHEM (1998). Validasi dilakukan pada metode analisis
yang dimulai dari tahap ekstraksi dengan SPE hingga analisis PAH dengan
menggunakan HPLC-UV.
3.4.1 Uji linearitas
Uji linearitas dilakukan dengan analisis hasil ekstraksi larutan standar PAH
pada matriks pangan yang di-spiking dengan 7 konsentrasi PAH berbeda. Larutan
standar
PAH
yang
digunakan
adalah
benzo(a)piren
(BAP)
dan
dibenzo(a,h)antrasen (DBA). Linearitas diukur dengan menggunakan nilai R 2
yang didapat dari plot antara luas area peak dari HPLC-UV dengan konsentrasi
(dalam ppm atau µg/mL) untuk masing-masing BAP dan DBA. Nilai linearitas
yang diharapkan adalah lebih dari 0.990.
3.4.2 Limit of detection dan limit of quantification instrumen
Nilai limit of detection (LOD) dan limit of quantification (LOQ) instrumen
ditentukan dengan menggunakan standar BAP dan DBA. Dilakukan enam
penentuan dengan injeksi menggunakan konsentrasi 2 ug/mL kemudian
diinjeksikan ke HPLC-UV. Hasil pengukuran kemudian diplotkan ke dalam kurva
standar (masing-masing untuk BAP dan DBA) yang didapatkan dengan cara
injeksi langsung standar PAH. Standar deviasi (SD) dari keenam penentuan
tersebut dihitung. Nilai LOD alat dinyatakan sebagai 3 kali standar deviasi,
sedangkan LOQ adalah 10 kali standar deviasi.
19
3.4.3 Uji kesesuaian sistem
Uji kesesuaian sistem ditentukan dengan cara melakukan enam kali injeksi
standar dengan konsentrasi tertentu dari larutan standar BAP dan DBA ke dalam
sistem HPLC-UV. Larutan standar BAP dan DBA yang digunakan adalah 2 ppm.
Kemudian dihitung standar deviasi dan standar deviasi relatif (RSD) dari waktu
retensi dan luas area hasil pengukuran dengan menggunakan HPLC-UV. Nilai
standar deviasi relatif yang diperbolehkan menurut JECFA adalah 2%.
3.4.4 Uji recovery dan repeatabilty
Uji recovery dilakukan dengan menggunakan sampel ayam panggang dan
ikan bakar yang di-spike (ditambahkan) dengan larutan standar Benzo(a)piren
(BAP) dan Dibenzo(a,h)antrasen (DBA) pada konsentrasi yang telah diketahui.
Konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini adalah 5 µg/g atau 5 ppm.
Percobaan spiking dilakukan sebanyak 7 ulangan. Sampel yang di-spiking ini
kemudian mengalami proses ekstraksi dan clean up sama seperti sampel tanpa
spiking dan dianalisis kandungan PAH dengan HPLC-UV. Recovery dari metode
dapat dihitung dengan rumus:
Recovery (%) = konsentrasi yang ditemukan – konsentrasi tanpa spiking x 100%
konsentrasi spiking
Dari 7 ulangan yang didapat, dihitung rata-rata recovery dan standar deviasi relatif
(RSD). Nilai RSD ini digunakan sebagai repeatability dari metode ekstraksi.
3.5 Tahap Kedua:
Optimasi kombinasi variasi pembumbuan, lama
pemanasan, dan jarak pemanasan terhadap kandungan
PAH ikan bakar
Formulasi bumbu ikan bakar dilakukan dengan menggunakan bumbu
kuning yang sudah umum digunakan oleh pedagang ikan dan ayam panggang.
Pembuatan ikan bakar dilakukan dengan menggunakan alat pemanggang dengan
sumber panas dari briket batu bara. Penentuan kombinasi konsentrasi bumbu,
jarak pemanasan dan lama pemanasan dilakukan dengan menggunakan desain
response surface methodology (RSM) dengan variabel independen seperti terlihat
pada Tabel 2. Presentase bumbu merupakan perbandingan konsentrasi bumbu
dengan berat basah daging ikan maupun ayam.
20
Proses pembakaran dilakukan pada suhu 250-300 °C. Pengukuran suhu
pembakaran dilakukan pada 6 titik sebanyak 4 kali selama proses pembakaran
(Gambar 4). Ikan yang digunakan adalah ikan bawal berukuran 250-300 g.
Bumbu kuning yang digunakan terdiri dari kunyit (2.5% dari total berat bumbu),
lengkuas (15.0%), bawang putih (12.5%), bawang merah (50.0%), kemiri (2.5%),
merica (2.5%), garam (2.5%), dan jahe (2.5%). Bumbu yang digunakan dalam
pembuatan ikan bakar juga digunakan dalam pembuatan ayam panggang. Respon
yang digunakan untuk optimasi proses pembakaran adalah konsentrasi BAP, DBA
dan total PAH, kadar air, dan intensitas warna (nilai L dan °Hue). Tahap akhir
adalah verifikasi respon dari kombinasi perlakuan yang dihasilkan dari software.
Tabel 2 Variabel independen yang digunakan dalam desain RSM
Simbol
Variabel Independen
A
Nilai
minimum
maksimum
Jarak Pemanasan
2.0 cm
8.0 cm
B
Lama Pemanasan
28 menit
40 menit
C
Konsentrasi bumbu
0%
15.0%
* Konsentrasi bumbu yang digunakan dihitung dari bobot ikan atau ayam mentah
3.6 Tahap Ketiga:
Optimasi kombinasi variasi pembumbuan, lama
pemanasan, dan jarak pemanasan terhadap kandungan
PAH ayam panggang
Formulasi bumbu ayam panggang dilakukan dengan menggunakan bumbu
yang sudah umum digunakan oleh pedagang di pinggir jalan. Bumbu yang akan
digunakan untuk ayam panggang adalah bumbu kuning yang sama dengan bumbu
yang digunakan pada tahap 2. Pembuatan ayam panggang dilakukan dengan
menggunakan alat pemanggang (Gambar 4) dengan sumber panas dari briket batu
bara. Penentuan kombinasi konsentrasi bumbu, jarak pemanasan, dan lama
pemanasan dilakukan dengan menggunakan desain percobaan response surface
methodology (RSM) dengan variabel independen kombinasi bumbu, lama
pemanasan, dan jarak pemanasan seperti terlihat pada Tabel 2. Jumlah ulangan
dan pengacakan didapat melalui program Design Expert® 8. Sebelum dilakukan
proses pembakaran, ayam terlebih dahulu dikukus selama 30 menit mengikuti
proses yang biasa dilakukan di masyarakat dan penjual ayam panggang.
21
21
Tahapan Penelitian
Kegiatan
Luaran
Tahap I:
Validasi metode ekstraksi polycyclic aromatic
hydrocarbon (PAH) dengan menggunakan
ekstraksi solid phase extraction (SPE) dan
analisis dengan HPLC-UV
Validasi metode ekstraksi meliputi uji
linearitas, penentuan limit of detection
(LOD), Penentuan limit of quantification
(LOQ), uji recovery dan uji repeatability.
Diperoleh nilai koefisien linearitas
metode, LOD alat, LOQ metode,
recovery metode dan repeatabilitas
metode
Tahap II:
Studi efek kombinasi dari variasi pembumbuan,
lama pemanasan, dan jarak pemanasan terhadap
kandungan PAH ikan bakar
Pengujian pengaruh kombinasi dari variasi
penambahan bumbu, lama pemanasan, dan
jarak pemanasan terhadap PAH dari ikan
bakar. PAH diekstraksi dengan metode SPE
dan dianalisis dengan HPLC-UV.
Kadar dibenzo(a,h)antrasen (DBA) dan
benzo(a)piren (BAP) dari ikan bakar
pada berbagai variasi pembumbuan, lama
pemanasan, dan jarak pemanasan
Tahap III:
Studi efek kombinasi dari variasi pembumbuan,
lama pemanasan, dan jarak pemanasan terhadap
kandungan PAH ayam panggang
Pengujian pengaruh kombinasi dari variasi
penambahan bumbu, lama pemanasan, dan
jarak pemanasan terhadap kadar PAH dari
ayam panggang. PAH diekstraksi dengan
metode SPE dan dianalisis dengan HPLCUV.
Kadar dibenzo(a,h)antrasen (DBA) dan
benzo(a)piren
(BAP)
dari
ayam
panggang
pada
berbagai
variasi
pembumbuan, lama pemanasan, dan
jarak pemanasan
Gambar 3 Diagram alir tahapan penelitian.
21
22
Gambar 4 Alat pembakaran yang digunakan pada penelitian.
3.7 Analisis Optimasi
3.7.1 Perancangan percobaan response surface methodology
Perancangan percobaan dilakukan dengan menggunakan bantuan software
Design Expert® 8. Penentuan proses pembakaran optimum dilakukan dengan
menggunakan rancangan Response Surface. Desain percobaan yang digunakan
pada Design Expert® 8 adalah Box-Behnken. Tahapan awal percobaan adalah
menentukan faktor dalam percobaan dan respons yang akan diamati. Faktor yang
akan dioptimasi adalah jarak dan lama pemanasan, serta konsentrasi bumbu yang
digunakan. Respon yang dianalisis adalah konsentrasi BAP, DBA dan total PAH
(ng/g sampel), analisis warna (L dan °Hue), dan kadar air. Penentuan jarak, lama,
dan konsentrasi bumbu yang akan diujikan dilakukan dengan melakukan beberapa
uji coba pendahuluan dan dilakukan pengamatan perbandingan. Dari hasil uji
pendahuluan didapatkan kisaran minimum dan maksimum untuk masing-masing
faktor percobaan adalah jarak pemanasan 2-8 cm, lama pemanasan 28-40 menit,
dan konsentrasi bumbu 0-15%. Kisaran jarak pemanasan, lama pemanasan dan
konsentrasi bumbu pada optimasi pembakaran ayam dan ikan mengikuti
rancangan pada Tabel 3.
3.7.2 Analisis permodelan dan optimasi
Setelah didapat seluruh respon yang diperlukan, dilakukan analisis
hubungan antara masing-masing respon dengan parameter independen yang
digunakan dan dibuat permodelannya dengan menggunakan software Design
Expert® 8. Program Design Expert® 8 akan memberikan persamaan matematika
yang sesuai pada masing-masing input respon penelitian. Persamaan matematika
yang terdapat pada software ini adalah mean, linear, quadratic, dan cubic.
23
Tabel 3 Rancangan percobaan optimasi proses pembakaran
Jarak Pemanasan (cm)
5.0
2.0
2.0
8.0
5.0
5.0
5.0
8.0
5.0
5.0
5.0
8.0
5.0
2.0
2.0
8.0
5.0
Lama Pemanasan (menit)
34
28
34
40
40
40
34
34
34
34
28
28
28
34
40
34
34
Konsentrasi bumbu (%)
7.5
7.5
0
7.5
0
15.0
7.5
15.0
7.5
7.5
0
7.5
15.0
15.0
7.5
0
7.5
Penentuan persamaan matematik yang akan digunakan didasarkan pada
analisis ANOVA dari model (dalam hal ini hasil signifikan pada uji signifikansi
model dan tidak signifikan pada uji lack of fit). Selain itu dilakukan perbandingan
nilai “adjusted R-squared” dan “predicted R- squared” dari model yang
dihasilkan. Model kemudian ditampilkan dalam countour-plot grafik 2 Dimensi
dan 3 Dimensi. Analisis lanjut dilakukan pada grafik kenormalan residual dan
perbandingan prediksi model dan nilai aktual.
Seluruh model yang dihasilkan digunakan untuk penentuan optimasi proses
untuk reduksi PAH pada software Design Expert® 8. Optimasi dilakukan dengan
menentukan target dari masing-masing respon yang diharapkan. Target yang
ditenukan dapat berupa in range, maksimum, minimum, atau target pada nilai
tertentu. Selain itu ditentukan importance dari respon yang ditentukan dengan
range 1-5 dimana 1 adalah rendah dan 5 paling tinggi. Formula optimasi
ditentukan oleh nilai desirability atau kesesuaian formula yang dihasilkan dengan
target yang ditentukan. Nilai desirability ditunjukkan dengan nilai 0-1 dimana
semakin tinggi nilai desirability, semakin sesuai proses optimum dengan yang
diinginkan.
24
Tahap akhir adalah verifikasi respon yang dihasilkan oleh proses optimum.
Verifikasi dilakukan dengan membandingkan hasil respon aktual dengan
perkiraan dari proses optimum oleh Design Expert® 8. Verifikasi proses optimum
diterima jika nilai aktual masuk ke dalam kisaran 95% prediction interval.
3.8 Analisis Statistik
Analisis korelasi dilakukan pada respon (BAP, DBA, total PAH, L, °Hue,
kadar air) yang dihasilkan pada proses optimasi pembuatan ayam dan ikan bakar.
Analisis korelasi dilakukan dengan analisis pearson correlation dengan
menggunakan software SPSS 17®.
3.9 Analisis Kimia
3.9.1 Pengukuran kadar air (AOAC 2005)
Pengukuran kadar air dilakukan dengan menimbang sampel daging yang
telah dihomogenkan sebanyak 1 g ke dalam cawan yang telah dikeringkan. Cawan
tersebut kemudian dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 110 °C selama 3 jam
kemudian didinginkan dengan cara dimasukkan ke dalam desikator selama 15
menit. Sampel kemudian ditimbang lalu dimasukkan kembali ke dalam oven
selama 30 menit dan didinginkan. Pengeringan dengan oven dihentikan saat
didapat bobot yang stabil. Kadar air sampel dihitung menggunakan rumus berikut:
kadar air 
(berat cawan  sampelawal )  (berat cawan  sampelsetelah oven )
 100%
(berat cawan  sampelawal )  berat cawan kosong
3.9.2 Pengukuran intensitas warna dengan chromameter CR-300
Analisis warna dilakukan dengan menggunakan alat Minolta Chromameter
CR-300. Sebelum dilakukan pengukuran nilai L, a, dan b, dilakukan kalibrasi alat
menggunakan plat standar putih. Kemudian sampel diukur di 4 titik pengukuran.
Nilai °Hue dihitung menggunakan rumus °Hue = tan-1 (rasio (nilai b/nilai a)).
Hubungan °Hue dan warna sampel ditunjukkan pada Tabel 4.
25
Tabel 4 Hubungan °Hue dan warna sampel.
˚Hue
18˚ - 54˚
54˚ - 90˚
90˚ - 126˚
126˚ - 162˚
162˚ - 198˚
198˚ - 234˚
234˚ - 270˚
270˚ - 306˚
306˚ - 342˚
342˚ - 18˚
Warna Sampel
Merah
merah-kuning
kuning
kuning-hijau
hijau
hijau-biru
biru
biru-ungu
ungu
merah-ungu
Sumber: Hutching (1999).
3.9.3 Analisis PAH
Ekstraksi dan clean-up komponen PAH dengan teknik solid phase extraction
(SPE) (Modifikasi Janoszka et al. 2004 dan Riverra et al. 1996)
Masing masing sampel daging, baik ayam panggang maupun ikan bakar,
dihomogenkan dengan menggunakan food processor. Ekstraksi mengikuti
prosedur pada Gambar 5. Sampel kemudian ditimbang sebanyak 1 g lalu
dilarutkan dalam 1 mL larutan NaOH 1M dingin untuk saponifikasi. Sampel
kemudian dimasukkan ke dalam 1.5 g ekstrelut lalu diisikan ke dalam kolom solid
phase extraction-propylsulphonic acid silica (SPE-PRS) dan sampel dielusi
dengan fasa gerak 12 mL diklorometana-5% toluena. Untuk membantu proses
ekstraksi digunakan vacuum chamber dengan laju alir eluen 1-5 tetes/menit.
Ekstrak diklorometan yang didapat kemudian diuapkan dengan gas nitrogen
pada suhu ruang dan residu yang tertinggal dilarutkan dalam 2  1 mL n-heksana.
Setelah itu dipersiapkan kolom berisi silika gel yang telah teraktivasi untuk
ekstraksi berikutnya. Aktivasi silika gel dilakukan dengan memanaskan silika gel
dalam oven pada suhu 200 °C selama 12 jam lalu kolom dikondisikan dengan cara
dielusi dengan 5 mL n-heksana sebelum digunakan untuk ekstraksi. Fraksi PAH
dalam n-heksana kemudian diekstraksi ke dalam kolom tersebut dengan
menggunakan eluen campuran n-heksana dan diklorometana 60:40 (v/v) sebanyak
10 mL. Ekstrak PAH yang didapat kemudian diuapkan dengan gas nitrogen pada
suhu ruang. Ekstrak PAH kemudian dilarutkan dalam 2  0.5 ml asetonitril dan
dipindahkan ke dalam vial untuk kemudian diuapkan pelarutnya dengan gas
26
nitrogen pada suhu ruang. Residu yang tertinggal dalam vial kemudian dilarutkan
dengan 200 μL standar PAH (campuran BAP dan DBA) dengan konsentrasi
2.5 µg/mL, lalu dianalisis kandungan PAH-nya dengan HPLC-MWD.
Penentuan konsentrasi komponen PAH dengan menggunakan HPLC-UV
Penentuan jumlah PAH dilakukan dengan menggunakan HPLC Agilent
1200 series dengan detektor MWD yang diset pada panjang gelombang UV.
Analisis dilakukan secara isokratik mengikuti kondisi pada Tabel 5.
Luas area yang digunakan untuk perhitungan kandungan PAH dalam
sampel adalah selisih dari luas area yang terbaca pada sampel dengan luas area
yang terbaca pada standar PAH (campuran BAP dan DBA) 2.5 µg/mL. Luas area
ini kemudian dimasukkan ke dalam persamaan dari kurva standar hasil injeksi
berbagai konsentrasi standar PAH. Kandungan PAH baik BAP maupun DBA
(µg/g sampel) dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
kandungan PAH dalam sampel ( g/g sampel) 
0.2 mL
 PAH dari kurva standar ( g/mL)
berat sampel (g)
Tabel 5 Kondisi analisis PAH dengan HPLC-UV
Kriteria
Kondisi
Kolom
C18 (ODS), ukuran partikel 5 μm, panjang 15 cm,
diameter dalam 4.6 mm
Suhu running
Suhu ruang
Fase gerak
Asetonitril-aquades MilliQ (80:20, v/v), isokratik
Laju aliran fase gerak
1.0 mL/menit
Deteksi
UV 280 nm
Sampel loop
20 μL
27
Daging dibakar dengan formula
bumbu, lama, dan jarak pemanasan
menurut rancangan RSM
Pisahkan Daging
(Sampel) dari Tulang
Homogenisasi
dengan Food
Processor
Ambil 1 g
daging
Campurkan
dengan 1 mL
NaOH 1 M
Tambahkan dengan
Ekstrelut 1.75 g
Masukkan ke dalam
Kolom PRS dengan
kapasitas 6 mL
Larutkan dengan 1 mL n-heksana
Fraksi PAH
diuapkan dengan N2
Masukkan dalam
kolom berisi Silika
gel teraktivasi
Analisis [PAH] dengan HPLC-UV
Uapkan acetonitril dengan N2
Larutkan dalam 200 µL standar
PAH 2.5 µg/mL
Elusi dengan 12 mL
Diklorometan: Toluen 5%
Elusi dengan 10 mL
n-heksana : diklorometan
60 : 40
PAH diuapkan dengan N2
Larutkan dalam 1 mL acetonitril
Gambar 5 Diagram alir ekstraksi PAH dari sampel daging (modifikasi Janoszka et al. 2004)
27