ANALISIS SEKUEN GEN SITOKROM OKSIDASE I DNA
advertisement
ANALISIS SEKUEN GEN SITOKROM OKSIDASE I DNA MITOKONDRIA LALAT BUAH Bactrocera sp skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Biologi Oleh Siti Nur Jannah 4411410039 JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG 2014 i ii iii ABSTRAK Jannah S N. 2014. Analisis Sekuen Gen Sitokrom Oksidase I DNA Mitokondria Lalat buah Bactrocera sp. Skripsi, Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Semarang. Pembimbing Dr. Ir. Dyah Rini Indriyanti M.P. Pada penelitian ini ditemukan spesies Bactrocera sp yang menyerang buah liar yang masih diragukan identitas spesiesnya. Bactrocera sp memiliki sebagian besar karakter morfologi sama dengan Bactrocera calumniata dan memiliki karakter sayap sama dengan Bactrocera cucurbitae. Bactrocera calumniata dengan Bactrocera cucurbitae masih terletak dalam subgenus yang sama Zeugodacus. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui sekuen gen sitokrom oksidase I DNA mitokondria lalat buah Bactrocera sp dan untuk mengetahui hubungan antara karakter morfologi dengan gen sitokrom oksidase I. Sampel berupa Bactrocera sp yang menyerang buah liar dan sebagai pembanding digunakan B. cucurbitae dan B. papayae. Sampel Bactrocera sp diambil dari hutan pegunungan Muria kudus. Sampel direaring sampai imago dan diidentifikasi morfologinya. Sampel B. papayae dan B. cucurbitae diambil dari biakan massal di Laboratorium Entomologi UGM yang telah teridentifikasi secara morfologi. Ketiga sampel diisolasi genom menggunakan Genomic DNA mini kit dan diamplifikasi PCR menggunakan primer mtD7 & mtD9. Produk amplifikasi PCR disekuensing dengan bantuan jasa lembaga Genetica Science di Singapura. Tiga sampel hasil amplifikasi berhasil disekunsing dan menghasilkan panjang fragmen Cox I 427 dan 430 bp dan menunjukkan sedikit variasi (conserve). Berdasarkan hasil BLAST menunjukan bahwa Bactrocera sp mempunyai homologi 100 % dengan B. cucurbitae GenBank Acc Number DQ006875.1, sedangkan hasil BLAST dengan B.calumniata GenBank Acc Number GQ154088.1 dengan homologi 96%. Hal tersebut tidak sesuai dengan identifikasi morfologi yang menyebutkan bahwa sebagian besar karakter morfologi Bactrocera sp sama dengan B.calumniata. Berdasarkan kontruksi filogeni pada Bactrocera sp menunjukan bahwa Bactrocera sp mempunyai common ancestor yang sama dengan B. cucurbitae yang berasal dari Swiss Eropa. Identifikasi molekuler Bactrocera sp menggunakan gen sitokrom oksidase I DNA Mitokondria tidak sesuai dengan klasifikasi Bactrocera sp berdasarkan karakter morfologi. Gen mtCOI merupakan gen untuk mengatur fungsi respirasi sel dan bukan merupakan gen untuk mengatur karakter morfologi. Karakter morfologi yang berbeda pada Bactrocera sp dapat disebabkan oleh perkawinan silang antara B.calumniata dengan B.cucurbitae dan proses adatasi pada kondisi lingkungan yang berbeda. Kata Kunci : Bactrocera sp, Sitokrom oksidase I, DNA mitokondria. iv KATA PENGANTAR Puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-NYA sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi yang berjudul “Analisis sekuen gen sitokrom oksidase I DNA mitokondria lalat buah Bactrocera sp”. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian payung Dr. Ir. Dyah Rini Indriyanti, M.P. Penulisan skripsi ini tidak terlepas dari kesulitan dan hambatan, namun berkat bimbingan dan motivasi dari berbagai pihak skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik. Atas selesainya penyusunan skripsi ini penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Rektor Universitas Negeri Semarang yang telah memberikan kesempatan pada penulis untuk dapat menimba ilmu di Universitas ini. 2. Dekan FMIPA Universitas Negeri Semarang yang telah memberi izin penulis sehingga dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. 3. Ketua Jurusan Biologi yang memudahkan jalan penulis dalam menyusun skripsi. 4. Ibu Dr. Ir. Dyah Rini Indriyanti, M.P. sebagai dosen pembimbing yang telah meluangkan waktu guna memberikan bimbingan dan motivasi sehingga penulis dapat meyelesaikan skripsi ini. 5. Ibu Dr.drh. R. Susanti, M.P selaku dosen penguji utama yang telah banyak memberikan gagasan menarik dan ilmu pengetahuan yang belum pernah penulis pelajari. 6. Ibu Ir.Tuti Widianti, M.Biomed selaku dosen penguji ke dua yang memberikan banyak motivasi, bimbingan serta banyak ilmu dasar molekuler sehingga penulis dapat menyempurnakan skripsi ini yang tentunya banyak kekurangan. 7. Ibu Ari Yuniastuti SPt, M.kes yang memberikan banyak pengarahan dan ilmu sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. 8. Dr.Ir. Amin Retnoningsih M.Si selaku dosen wali saya yang selalu mengarahkan dan membimbing saya. v 9. Dr.Suputa SP, MP. Selaku dosen Fakultas Pertanian UGM yang telah membantu dan mengarahkan analisis molekuler dalam penelitian saya. 10. Keluarga baru saya, Vivi, Sista, April dan teman-teman laboratorium virologi UGM yang telah membantu dalam analisis moluker. 11. Ayahanda Nur Salim serta Ibunda Siti dan Adikku Miftahul Anam Arois dan Nur Maulana Aeli Yudinkan sebagai penuntun dan penyemangat dalam kehidupanku, memberikan semangat dan dukungan dalam melanjutkan kehidupan dengan penuh tanggung jawab. 12. Mas Muhammad Kuriyanto yang selalu menemani mengambil sampel dengan mendaki gunung Muria Kudus sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini. 13. Ibu Indah dan keluarga selaku orang tua wali saya di Semarang yang selalu memberikan bantuan dan mempermudah dalam perjalanan kehidupan mahasiswa saya. 14. Sahabatku Annisa, Muna, Fahmi, Mei, Durroh, dan teman-teman biomi 2010 yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu yang selalu memberi semangat, nasehat, kegalauan, dan canda tawa kepadaku. Skripsi ini masih banyak kekurangannya, oleh sebab itu kritik dan saran sangat diharapkan. Atas segala bimbingan dan bantuan dari semua pihak, penulis berdoa semoga mendapat pahala dari Allah SWT. Semarang, 27 Agustus 2014 Penyusun vi DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL................................................................................... i PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI ..................................................... ii ABSTRAK ............................................................................................. iii PENGESAHAN .......................................................................................... iv KATA PENGANTAR ................................................................................ v DAFTAR ISI ............................................................................................. vii DAFTAR TABEL ....................................................................................... ix DAFTAR GAMBAR .................................................................................. x DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xi BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang ........................................................................... 1 B. Rumusan Masalah ...................................................................... 3 C. Penegasan Istilah ........................................................................ 3 D. Tujuan Penelitian ........................................................................ 3 E. Manfaat Penelitian ...................................................................... 4 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA A. Lalat buah (Bactrocera sp) ......................................................... 5 B. Identifikasi spesies secara molekuler ......................................... 7 C. Filogenetika ............................................................... 15 BAB III. METODE PENELITIAN A. Lokasi dan Waktu Penelitian ...................................................... 20 B. Subjek penelitian ........................................................................ 20 C. Rancangan Penelitian ................................................................. 21 D. Alat dan Bahan Penelitian .......................................................... 21 E. Langkah Kerja ............................................................................ 22 F. Analisa Data ............................................................................... 28 vii BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN A. Hasil Penelitian ........................................................................... 30 B. Pembahasan ................................................................................ 47 BAB V. Simpulan dan Saran A. Simpulan ..................................................................................... 56 B. Saran ........................................................................................... 56 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 57 LAMPIRAN-LAMPIRAN........................................................................ 62 viii DAFTAR TABEL Halaman 1. Beberapa spesies lalat buah yang diteliti oleh Zhang et al. (2010)......... 18 2. Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian................................... 21 3. Primer Oligonukleotida yang digunakan untuk amplifikasi PCR ........... 26 4. Cocktail yang digunakan untuk amplifikasi PCR. .................................. 27 5. Rangkaian amplifikasi daerah sitokrom oksidase I DNA mitokondria ................................................................................... 27 6. Daftar spesies yang dianalisis ................................................................. 29 7. Kandungan basa nukleotida Bactrocera sp dari progam Mega software 6.0. .................................................................................. 32 8. Hasil analisis BLAST sekuen DNA gen Cox I. ...................................... 33 9. Hasil pairwise distance calculation dari Bactrocera .............................. 47 ix DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Siklus Hidup Bactrocera sp ................................................................... 6 2. Daerah gen mitokondria ....................................................................... 10 3. Kladogram yang menggambarkan hubungan kekerabatan dari 27 spesies Bactrocera ................................................................................ 17 4. Buah liar yang diserang Bactrocera sp ................................................. 22 5. Rearing Bactrocera sp........................................................................... 23 6. Hasil elektroforesis genom Bactrocera sp ............................................ 30 7. Hasil amplifikasi PCR Bactrocera sp ................................................... 31 8. Hasil analisis BLAST gen Cox I Bactrocera sp dengan GenBank B.calumniata Acc Number GQ154088.1 .............................................. 34 9. Hasil analisis BLAST gen Cox I Bactrocera sp dengan GenBank B. cucurbitae Acc Number DQ006875.1 .............................................. 35 10. Hasil analisis BLAST gen Cox I B. cucurbitae dengan GenBank B. cucurbitae Acc Number DQ116244.1 .............................................. 36 11. Hasil analisis BLAST gen Cox I Bactrocera papaya dengan GenBank B. papayae Acc Number FJ903487.1 ................................................... 37 12. Lokasi penempelan primer .................................................................... 37 13. Hasil aligment nukleotida dengan sampel koleksi GenBank ................ 44 14. Hasil aligment asam amino dengan sampel koleksi genBank .............. 46 15. Kladogram fragmen Cox I Bactrocera sp ............................................. 46 x DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Hasil identifikasi morfologi Bactrocera sp yang menyerang buah liar, Bactrocera cucurbitae dari buah pare, Bactrocera papayae dari buah salak dan sebagai pembanding Bactrocera calumniata ........................ 63 2. Alat-Bahan yang digunakan dalam penelitian ...................................... 64 3. Hasil kromatogram sekuen gen Cox I Bactrocera papayae yang menyerang buah salak pada sekuen forward.. ...................................... 65 4. Hasil kromatogram sekuen gen Cox I Bactrocera papayae yang menyerang buah salak pada sekuen Reverse......................................... 66 5. Hasil kromatogram sekuen gen Cox I Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah pare pada sekuen forward.. ........................................ 67 6. Hasil kromatogram sekuen gen Cox I Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah salak pada sekuen Reverse.. ....................................... 68 7. Hasil kromatogram sekuen gen Cox I Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah liar pada sekuen forward.. ......................................... 69 8. Hasil kromatogram sekuen gen Cox I Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah liar pada sekuen Reverse............................................ 70 9. Hasil consensus sekuen gen sitokrom oksidase I Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah liar (CL), Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah pare (CU) dan Bactrocera papayae yang menyerang buah salak (LB ................................................................... 71 xi BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Indonesia merupakan salah satu negara yang disebut mega biodiversity flora fauna setelah Brazil dan Madagaskar. Aneka flora dan fauna yang ada di dunia 25 % berada di Indonesia, dan dari setiap spesies tersebut terdiri dari ribuan plasma nutfah. Total keanekaragaman hayati di Indonesia adalah sebesar 325.350 jenis flora dan fauna (Ariyanto 2010). Serangga sebagai salah satu komponen keanekaragaman hayati memiliki peranan penting dalam jaring makanan yaitu sebagai herbivor, karnivor, dan detrivor. Serangga herbivora merupakan faktor penyebab utama dalam kerugian hasil panen, baik secara langsung memakan jaringan tanaman atau sebagai vektor dari patogen tanaman (Ariyanto 2010). Lalat buah (Bactrocera sp) merupakan salah satu jenis serangga yang melimpah spesiesnya (Zhang et al. 2010). Ada sekitar 4000 spesies lalat buah di dunia dan 35% di antaranya menyerang buah-buahan yang berkulit lunak dan tipis, termasuk di dalamnya buah-buahan komersial yang mempunyai nilai ekonomi tinggi. Muryati (2007) melaporkan bahwa selain menyerang buahbuahan yang lunak, sekitar 40% lalat buah juga hidup dan berkembang pada bunga tanaman famili Asteraceae (Compositae). Selebihnya hidup pada tanaman famili lainnya, misalnya Cucurbitaeceae, Solanaceae, atau menjadi pengorok pada daun, batang, dan jaringan akar. Bactrocera sp menggunakan isyarat visual dan isyarat kimia untuk menemukan inangnya. Kesesuaian isyarat visual maupun kimia menentukan ketertarikan lalat buah terhadap inangnya (Hasyim et al. 2010). Masing-masing spesies Bactrocera sp memiliki ketertarikan hanya pada satu jenis inang (monofag) tetapi menurut Pranowo et al. (2008) Bactrocera sp mempunyai ketertarikan pada banyak jenis inang yang berbeda (polifag). 1 2 Bactrocera sp banyak menyerang buah yang dikonsumsi, seperti apel, jambu air, papaya, mangga, belimbing, sirsak, alpukat dan cimpedak (CABI 2007). Hal ini terkait dengan kebutuhan nutrisi untuk berkembangnya telur, warna buah yang menarik dan gas metal-euginol yang dikeluarkan buah menjadi daya tarik tersendiri bagi masing-masing spesies Bactrocera sp. Hal yang menarik adalah Bactrocera sp juga menyerang buah yang tidak dikonsumsi manusia (buah liar). Buah liar tidak mempunyai organoleptik yang bagus sehingga manusia tidak mengkonsumsinya. Lalat buah yang sering menjadi perhatian khusus bagi manusia adalah spesies yang menyerang tanaman holtikultura. Penelitian untuk mengidentifikasi Bactrocera sp yang menyerang buah liar menggunakan analisis molekuler belum banyak dilakukan. Analisis molekuler pada Bactrocera sp berdasarkan kandungan DNA di dalamnya. Bila diperhatikan, tidak ada satu individu yang penampilannya sama dengan individu yang lain. Perbedaan ini disebabkan oleh perbedaan DNA. Karakter morfologi banyak disebabkan oleh interaksi genetik dan kondisi lingkungan, sehingga penanda morfolgi kurang akurat untuk mengidentifikasi organisme. Pada penelitian ini ditemukan spesies Bactrocera sp yang menyerang buah liar yang masih diragukan identitas spesiesnya. Bactrocera sp memiliki sebagian besar karakter morfologi sama dengan Bactrocera calumniata dan memiliki karakter sayap sama dengan Bactrocera cucurbitae. Bactrocera calumniata dengan Bactrocera cucurbitae yang masih terletak dalam subgenus yang sama Zeugodacus. Oleh karena itu diperlukan analisis molekuler menggunakan gen sitokrom oksidase I DNA mitokondria untuk mengidentifikasi spesies Bactrocera sp. Alasan pemilihan gen sitokrom oxidase I adalah fragmen Cox I sering digunakan sebagai DNA barkoding untuk membedakan antara spesies. Fragmen Cox I jarang mengalami substitusi asam amino akan tetapi mutasi silent (mutasi yang tidak merubah fungsi asam amino) sering terjadi. Hal tersebut yang 3 menyebabkan fragmen Cox I berguna untuk merekronstruksi keragaman filogenetik pada cabang evolusi di bawah tingkat spesies. Mitokondria mengalami evolusi cepat, tetapi ada bagiannya yaitu fragmen Cox I yang mengalami evolusi rendah, sehingga dipilih sebagai karakter genetika. Alasan lain dipilih sitokrom oksidase I adalah sedikit perbedaan basa nukleotida yang dijumpai diharapkan mampu mengidentifikasi spesies secara akuarat (Zein & Prawiradilaga 2013). B. Rumusan Masalah 1. Bagaimana sekuen gen sitokrom oksidase I DNA mitokondria pada lalat buah Bactrocera sp ? 2. Bagaimana hubungan karakter morfologi Bactrocera sp yang menyerang buah liar dengan gen sitokrom oksidase I? C. Penegasan Istilah Analisis sekuen gen yang dilihat adalah gen sitokrom oksidase I DNA mitokondria pada spesies Bactrocera sp. Pada penelitian ini digunakan sampel Bactrocera sp. Bactrocera sp menyerang buah liar dari Famili Cucurbitaeceae diperoleh dari pegunungan Muria Kudus. Sampel pembanding digunakan B. cucurbitae dan B. papayae menyerang tanaman holtikultura diperoleh dari biakan massal di Laboratorium Entomologi Dasar di Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Madja. D. Tujuan Penelitian 1. Mengetahui sekuen gen sitokrom oksidase I DNA mitokondria pada lalat buah Bactrocera sp. 2. Mengetahui hubungan karakter morfologi Bactrocera sp yang menyerang buah liar dengan gen sitokrom oksidase I. 4 E. Manfaat Penelitian Penelitian ini memberikan informasi mengenai sekuen gen sitokrom oksidase I DNA mitokondria lalat buah Bactrocera sp untuk mengetahui sejarah evolusi filogeninya dan memberikan informasi tentang hubungan gen sitokrom oksidase I DNA Mitokondria dengan karakter morfologi Bactrocera sp. BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Lalat buah (Bactrocera sp) Lalat buah (Bactrocera) dapat diklasifikasikan sebagai berikut (Siwi et al. 2006): Kingdom :Animalia Phylum :Arthropoda Kelas : Hexapoda Ordo : Diptera Famili : Tephritidae Genus : Bactrocera Spesies : Bactrocera sp Lalat buah mengalami perubahan bentuk tubuh atau metamorfosis sempurna (holometabola) yaitu telur, larva, pupa, dan lalat dewasa dalam satu siklus kehidupannya. Telur lalat buah umumya berbentuk bulat panjang dengan warna putih atau putih kekuningan. Panjang telur antara 0,3 mm-0,8 mm dan lebar 0,2 mm. Telur tersebut akan menetas menjadi larva kira-kira 2 hari setelah diletakkan oleh induknya (Siwi et al. 2006). Larva umumnya berbentuk bulat panjang, berwarna putih keruh kekuningan, dan salah satu ujungnya runcing, mempunyai alat pengait dan bintik yang jelas. Larva lalat buah melewati tiga instar dalam waktu 7-10 hari hingga membentuk pupa. Lalat buah dewasa keluar dari permukaan tanah, mereka mengeraskan sayapnya terlebih dahulu sebelum terbang (Hou et al. 2006). Imago lalat buah betina memiliki perbedaan dengan lalat buah jantan. Perbedaan antara imago jantan dan imago betina dapat diketahui pada bagian abdomennya. Imago betina memiliki ovipositor sebagai alat untuk meletakan telur pada bagian ujung abdomennya, sedangkan imago jantan tidak memiliki ovipositor. Ukuran tubuh antara imago jantan dan betina berbeda, imago betina memiliki ukuran tubuh relatif lebih besar dari pada jantan. Hal ini terkait dengan 5 6 fungsi dan peranan betina dalam menghasilkan keturunan. Ukuran tubuh yang lebih besar memungkinkan betina untuk menyimpan telur dalam tubuhnya sebelum telur diletakan pada tubuh inangnya (Pujiastuti 2009). Gambar 1. Siklus hidup Bactrocera sp (Pena et al. 2002) Menurut Drew (1989) ada beberapa spesies Bactrocera sp yang menyerang tanaman holtikultura. Diantaranya sub genus Zeugodacus dan Bactrocera. Berikut contoh beberapa spesies Bactrocera sp. 1. Bactrocera (Zeugodacus) cucurbitae. B. cucurbitae merupakan anggota genus Bactrocera dan subgenera Zeugodacus. Menurut Dhillon et al. 2005 & Pinero et al. 2006 B. cucurbitae menyerang 125 tanaman famili Cucurbitaeceae dan tanaman famili Solanaceae. Murtiana (2010) melaporkan bahwa B. cucurbitae tertarik pada atraktan Cue lure. B. cucurbitae merupakan salah satu spesies yang banyak menimbulkan kerugian pada tanaman holtikultura. 7 2. Bactrocera (Zeugodacus) calumniata. B. calumniata merupakan anggota genus Bactrocera dan subgenera Zeugodacus. B. calumniata juga menyerang tanaman Cucurbitaeceae. B. calumniata tertarik pada atraktan Cue lure. B. calumniata merupakan spesies yang kecil jumlahnya (Drew 1994). 3. Bactrocera (Bactrocera) papayae B. papayae merupakan anggota sub genera Bactrocera yang paling melimpah jumlahnya. B. papayae bersifat polifag dan tertarik pada atraktan Metil eugenol. Menurut Muryati et al. (2007) B. papayae adalah salah satu lalat buah yang paling banyak merugikan karena banyak menyerang tanaman holtikultura. B. Identifikasi Spesies Secara Molekuler Identifikasi Bactrocera sp secara molekuler diperlukan beberapa komponen penting yang terkait prosedur yang digunakan, diantaranya adalah gen target dari sampel yang akan diamplifikasi. Metode yang digunakan untuk mengamplifikasi gen target menggunakan metode PCR dan metode sekuensing yang digunakan untuk melihat sekuen nukleotida dari gen target sampel. Gen target yang akan diamplifikasi adalah gen sitokrom oksidase I dari DNA mitokondria Bactrocera sp. Ratnayani et al. (2007) mengungkapkan DNA mitokondria mempunyai karakteristik yang dapat dijadikan alat yang signifikan untuk keperluan analisis. DNA mitokondria mempunyai jumlah copy yang tinggi. Jumlah copy tiap sel yaitu sekitar 1000-10.000 sehingga mtDNA dapat digunakan untuk analisis sampel dengan jumlah DNA yang sangat terbatas. DNA mitokondria diturunkan hanya melalui induk betina (maternal) sehingga setiap individu pada garis keturunan ibu yang sama akan mempunyai tipe mtDNA yang identik. DNA mitokondria mempunyai laju polimorfisme yang tinggi dengan laju evolusinya sekitar 5-10 kali lebih cepat dari DNA inti. Wandia (2001) menambahkan evolusi cepat mtDNA menimbulkan keragaman yang tinggi pada sekuen mtDNA intraspesies. Mutasi titik juga sering ditemukan di antara gen yang homolog pada mtDNA. Sebagian besar mutasi ini merupakan 8 mutasi sinonim atau mutasi bisu yaitu mutasi pada kodon tanpa mengubah struktur protein yang diekspresinya. Berikut ini informasi mengenai DNA mitokondria dan gen sitokrom oksidase I. 1. DNA Mitokondria untuk Identifikasi Spesies Mitokondria berbentuk sterik atau memanjang, strukturnya seperti batang dikelilingi oleh membran dalam dan membran luar. Membran luar mitokondria halus, sedangkan membran dalam melekuk menjadi lembaran atau tubuli yang disebut dengan cristae yang memanjang menuju ruangan dalam (matrix). Mitokondria ditemukan di seluruh sitoplasma dalam jumlah besar sekitar 1000 buah disetiap sel. Mitokondria banyak ditemukan pada sel-sel yang menggunakan sejumlah besar energi, sedangkan sel-sel yang kurang aktif mengandung lebih sedikit mitokondria (Wandia 2001). DNA mitokondria tidak dapat mengalami rekombinasi sehingga terjadinya diversifikasi genetika hanya melalui mutasi. Hal tersebut menunjukkan bahwa perubahan gen yang terjadi di mitokondria terjadi pada waktu-waktu tertentu sehingga dapat digunakan untuk studi sejarah kehidupan organisme di masa lalu (Sabeti 2005). DNA mitokondria terdiri dari 15.000–17.000 pasang basa. Setiap genom DNA mitokondria terdiri atas daerah coding dan noncoding. Daerah coding mengambil proporsi 90% dari total genom sedangkan sisanya merupakan daerah noncoding. Daerah coding mengandung 37 gen penyandi yang terdiri atas 22 gen penyandi transfer RNA (tRNA), dua gen penyandi ribosomal RNA (rRNA), dan 13 gen penyandi protein. Protein terdiri atas tiga subunit sitrokrom oksidase (CO I-III), tujuh subunit NADH-dehidrogenase, dua subunit ATPase dan sitokrom-b (cyt-b) yang nantinya akan mengkode pembentukan protein, terutama protein yang terlibat dalam transport elektron dan reaksi fosforilasi oksidatif dari mitokondria (Wibowo 2009). Sharma et al. (2005) mengungkapkan bahwa mtDNA memiliki dua rantai DNA komplemen yang asimetris pada posisi basa penyusunya, dimana 9 satu diantaranya banyak mengandung basa guanin disebut rantai berat (heavy, H) dan rantai lainya mengandung basa guanin lebih sedikit sehingga disebut rantai ringan (Light, L). Hou et al. (2006) menambahkan bahwa penamaan tersebut berdasarkan pada perbedaan densitas tiap rantai, dimana rantai H memiliki berat molekul lebih besar dari pada rantai L karena rantai H memiliki banyak basa purin yang memiliki dua buah cincin pada strukturnya. Fungsi utama dari mitokondria adalah penghasil energi melalui proses fosforilasi oksidatif. Pada proses fosforilasi oksidatif menghasilkan produk samping radikal oksigen yaitu Reactive oxygen spesies (ROS) (Wandia 2001). Hal ini dikarenakan mtDNA yang tidak memiliki system reparasi yang efisien, tidak memiliki protein histon dan terletak berdekatan dengan membran dalam mitokondria tempat berlangsungnya reaksi fosforilasi oksidatif. ROS merupakan agen oksidasi yang sangat tidak stabil sehingga dapat dengan mudah bereaksi dengan DNA. Selain itu, DNA polymerase γ yang dimiliki mitokondria tidak memiliki suatu proses perbaikan dan pengakuratan dalam replikasi DNA. Replikasi DNA yang tidak akurat menyebabkan mutasi mudah terjadi (Han et al. 2006). 2. Gen Sitokrom oksidase subunit I Sitokrom oksidase I enzim yang larut dalam air yang berperan sebagai pembawa elektron dalam reaksi fosforilasi oksidatif pada mitokondria. Enzim ini memiliki struktur kompleks yang mengandung 13 subunit, antara lain lima fosfatidil etanolamina, tiga fosfatidil gliserol, dua asam kolat, dua gugus heme A, dan beberapa kofaktor ion logam, meliputi tiga atom tembaga, satu atom magnesium, dan satu atom seng. Enzim ini juga berperan pada reaksi terakhir pada rantai transpor elektron dan mentransfer elektron ke oksigen, ketika memompa proton melewati membran (Richter & Ludwig 2003). Gen sitokrom oksidase pada mitokondria terbagi menjadi tiga subunit yaitu sitokrom oksidase subunit I, II dan III (Gambar 2). DNA mitokondria mengalami evolusi cepat tetapi ada bagiannya yaitu gen sitokrom oksidase yang mengalami 10 evolusi rendah (Zein & Prawiradilaga 2013). Daerah gen sitokrom oksidase ditunjukan pada Gambar 2. Gambar 2. Daerah gen mitokondria. Gen penyandi sitokrom oksidase memiliki tiga subunit yaitu Cox I, Cox II, Cox III yang ditunjukan oleh anak panah. Menurut Zhang et al. (2010) gen sitokrom oksidase subunit I pada Bactrocera sp memiliki panjang nukleotida 689 bp. Gen sitokrom oksidase I pada Bactrocera sp memiliki kandungan basa (A+T) lebih banyak dibandingkan Thepritidae lainnya. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Jamnongluk et al. (2003) kandungan basa (A+T) pada beberapa spesies Bactrocera sp sekitar 63 – 68 % dari 639 bp gen Cox I. Pada sekuen gen penyandi sitokrom oksidase subunit I Bactrocera sp terdapat 18 tempat variasi dari 213 asam amino. 3. Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR merupakan teknik amplifikasi potongan DNA yang diinginkan secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida dengan bantuan enzim polymerase. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diamplifikasi adalah DNA untai-tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Primer yang berada sebelum daerah target disebut 11 primer forward dan yang berada setelah daerah target disebut primer reverse. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Amplifikasi sekuen DNA target dapat memperoleh 106-109 kali jumlah DNA target awal. Amplifikasi ini dapat menghasilkan lebih dari satu juta kali DNA asli (Muladno 2010 & Sudjadi 2008). Konsep teknologi PCR mensyaratkan bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dilakukan. Reaksi pelipat gandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denaturasi DNA dilakukan dilakukan dengan menggunakan suhu (95°C) selama1–2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 55°C sehingga primer akan menempel (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Suhu optimal untuk penempelan primer ± 55 °C. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah 37°C, tetapi biasanya akan terjadi mispriming yaitu penempelan primer pada tempat yang salah. Pada suhu yang lebih tinggi (55°C), spesifitas reaksi amplifikasi akan meningkat, tetapi secara keseluruhan efisiensinya akan menurun (Yuwono 2006). Menurut Handoyo & Rudiretna (2001) komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR secara umum adalah DNA template, sepasang primer, dNTPs (deoxynucleotide triphosphates), buffer PCR, magnesium klorida (MgCl) dan enzim polimerase DNA. a. Template DNA Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA. DNA template diperoleh 12 dengan melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid. (Handoyo & Rudiretna 2001). Konsentrasi template DNA harus dioptimasi. Jika konsentrasinya terlalu rendah, maka primer tidak dapat menemukan target. Sebaliknya bila konsentrasi template DNA terlalu tinggi akan meningkatkan kemungkinan salah target (mispriming). Selain itu kemurnian template DNA juga penting, karena dapat mempengaruhi hasil reaksi (Zein & Prawiradilaga 2013). b. Primer (Oligonukleotida) Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5’-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen pada ujung 3’-OH rantai DNA cetakan yang lain (Yuwono 2006). Menurut Suryanto (2003), primer biasanya terdiri dari 10-20 nukleotida. Semakin panjang primer, maka harus spesifik daerah yang diamplifikasi. Jika suatu kelompok organisme memang berkerabat dekat, maka primer dapat digunakan untuk mengamplifikasi daerah tertentu yang sama dalam genom kelompok tersebut. c. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Pada proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. Pada proses ekstensi dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template. Konsentrasi optimal dNTP untuk proses PCR harus ditentukan (Handoyo & Rudiretna 2001). 13 d. Buffer PCR dan MgCl Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjaga pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg 2+ berfungsi yang berasal dari MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang menstimulasi aktivitas DNA polimerase. MgCl2 berperan meningkatkan interaksi primer dengan template DNA yang membentuk komplek terlarut dengan dNTP untuk membuat substrat yang akan dikenali oleh enzim taq DNA Polymerase. Konsentrasi Ion Mg 2+ yang terlalu tinggi akan menyebabkan denaturasi rantai DNA menjadi sulit. Konsentrasi di atas 10 mM akan mengakibatkan sifat enzimatik Taq DNA menjadi tidak efektif (Zein & Prawiradilaga 2013). e. DNA Polymerase (Taq Polymerase) Enzim Taq DNA polymerase adalah suatu enzim yang bersifat thermostabil yang diisolasi dari Thermus aquaticus. DNA polymerase adalah enzim yang mengkatalisis polimerasi DNA. Jumlah polimerase DNA yang digunakan tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Untuk panjang fragmen DNA kurang dari dua kilobasa diperlukan 1,25 – 2 unit per 50 uL campuran reaksi, sedangkan untuk panjang fragmen DNA lebih besar dari dua kilobasa diperlukan 3 – unit per 50 uL campuran reaksi (Zein & Prawiradilaga 2013). 4. Metode Sekuensing Sekuensing DNA merupakan proses atau teknik penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens sampel dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui. Metode Sekuensing dapat digunakan untuk mengidentifikasi sebuah mutasi gen dan dapat membandingkan gen homolog diantara spesies. 14 Pada tahun 1977 metode sekuensing telah berkembang di Amerika yang dipelopori oleh Maxam and Gilbert dan pada tahu 1974 di Inggris oleh Sanger. Ada dua metode Sekuensing yaitu metode Maxam and Gilbert dan Sanger (Lilian et al. 2002). a. Metode Maxam and Gilbert Metode ini didasarkan pada degradasi basa secara kimiawi. Pada metode ini DNA yang akan disekuensing ditandai dengan zat radioaktif. Fragment DNA yang sudah dilabeli merupakan subjek untuk pemecahan secara acak pada posisi basa adenine, sitosin, guanine dan timin menggunakan agen kimia spesifik. Degradasi senyawa kimia ini didasarkan pada tiga tahap: Perubahan basa nukleotida, penggantian dari basa yang telah mengalami perubahan pada molekul gulanya dan rantai DNA yang dipecah pada molekul gulanya. Hal ini akan menghasilkan sekumpulan fragmen bertanda radioaktif yang panjangnya tergantung pada jarak antara letak basa yang dihilangkan dengan ujung molekul bertanda radioaktif. Sekuens DNA dapat dibaca dari hasil pemisahan fragmen – fragmen yang terbentuk pada gel poliakrilamida (Lilian et al. 2002). b. Metode Sanger Pada metode Sanger, ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebut primer. Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA polimerase, enzim yang mereplikasi DNA. Bersama dengan primer dan DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis basa deoksinukleotida (dNTP) dan nukleotida pemutus atau dalam konsentrasi rendah (ddNTP). Metode ini didasarkan pada penghambatan sintesis nukleotida akibat adanya persaingan antara dNTP dengan ddNTP. Penempelan ddNTP pada cetakan mengakibatkan berhentinya sintesis utas yang komplementer dengan DNA cetakan oleh dNTP. Pada rekasi ini dihasilkan berbagai fragmen yang berbeda-beda panjanya dengan label 15 raadioaktif. Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu dipisahkan menurut ukurannya dengan elektroforesis gel poliakrilamida (Lilian et al. 2002). c. Filogenetika Filogenetika menggambarkan klasifikasi secara taksonomi dari suatu organisme berdasarkan pada sejarah evolusi. Proses evolusi melibatkan proses rekombinan gen dan mutasi genetik pada spesies yang membentuk spesies yang baru. Sejarah evolusi suatu organisme dapat dilihat berdasarkan perubahan karakter organisme. Karakter merupakan dasar yang digunakan untuk menganalisis hubungan antara spesies (Schmidt 2003). Tujuan dari penyusunan filogenetika salah satunya adalah untuk merekontruksi dengan tepat hubungan antara organisme dan menganalisis perbedaan yang Filogenetika dapat terjadi dari satu nenek moyang kepada keturunannya. menganalisis perubahan yang terjadi dalam evolusi organisme yang berbeda. Pohon filogenetik adalah pendekatan logis untuk menunjukkan hubungan evolusi organisme satu dengan yang lainya dapat digambarkan melalui sebuah poon filogenetik (Schmidt 2003). Sebelum menganalisis filogentika suatu organisme, terlebih dahulu mengetahui sejarah filogeni suatu organisme. Bactrocera sp merupakan genus terbanyak dari jenis lalat buah (Diptera: Tephritidae) yang ditemukan di Benua Asia dan Australia dan merupakan salah satu generasi terbesar yaitu 500 spesies (Drew 1989; Drew & Hancock 2000). Sebelumnya Bactrocera sp merupakan anggota dari genus Dacus, hal itu disebabkan terjadi kekeliruan identifikasi. Genus Dacus merupakan spesies lalat buah asli dari Afrika, dan biasanya berasosiasi dengan bunga dari tanaman Cucurbitaecea dan kulit buah tanaman kacang-kacangan (Muryati 2007). Smith et al. (2002) mengatakan Dacus dan Bactrocera merupakan saudara. Hal ini didasarkan pada persamaan radial veins pada sayap yang memenuhi bagian depan dan sel medial yang sangat lebar. Tergit abdominal enam pada lalat buah betina terpisah dari tergit pertama dan tergit kelima dari lalat buah 16 betina maupun jantan dilengkapi dengan glandular ceromae. Analisis sekuen DNA mitokondria kedua genus tersebut berkerabat dekat. Menurut Zhang et al. (2010), yang membedakan 27 spesies (Tabel 1) dari delapan subgenera lalat buah berdasarkan gen Cox I dan 16S rRNA yaitu Afrodacus, Austrodacus, Bactrocera, Daculus, Gymnodacus, Paratridacus, Tetradacus, dan Zeugodacus. Bactrocera dan Zeugodacus merupakan parafiletik, sedangkan Austrodacus Cucurbitaeceae tidak dan Zeugodacus berkerabat dengan yang menyerang Afrodacus, tanaman Bactrocera, dan Gymnodacus yang menyerang tanaman sefamili. Paratridacus yang merupakan saudara dari Tetradacus dan tujuh spesies dari Bactrocera termasuk clade monofiletik, tetapi Daculus mempunyai garis keturunan sendiri yang berbeda dari Bactrocera dan Zeugodacus. Pernyataan tersebut diperjelas pada Gambar 3. 17 Gambar 3. Kladogram yang menggambarkan hubungan kekerabatan dari 27 spesies Bactrocera sp (Zhang et al. 2010). Zhang et al. (2010) menambahkan bahwa Bactrocera dorsalis complex yang menduduki subgenus Bactrocera merupakan monofiletik. Bactrocera dorsalis complex mempunyai bentuk dan sifat yang berbeda akan tetapi mereka mempunyai Common ancestor (nenek moyang) yang sama. Pernyataan tersebut didukung oleh pernyataan Drew & Hancock (1994), Smith et al. (2003), dan Muraji & Nakahara (2001) yang menyebutkan bahwa subgenus Bactrocera merupakan monofiletik. 18 Tabel 1. Beberapa spesies lalat buah yang diteliti oleh Zhang et al.( 2010) NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Spesies Bactrocera carambolae Bactrocera correcta Bactrocera dorsalis Bactrocera latifrons, Bactrocera musae, Bactrocera papayae, Bactrocera philippinensis Bactrocera zonata , Bactrocera jarvisi Bactrocera cucumis Bactrocera curvipennis Bactrocera frauenfeldi Bactrocera kandiensis, Bactrocera occipitalis Bactrocera psidii Bactrocera tryoni Bactrocera umbrosa Bactrocera oleae Bactrocera calophylli Bactrocera expandens Bactrocera minax Bactrocera tsuneonis Bactrocera caudate Bactrocera diaphora , Bactrocera scutellata Bactrocera tau Bactrocera cucurbitae Anastrepha ludens Ceratitis capitata Sub genera Bactrocera Bactrocera Bactrocera Bactrocera Bactrocera Bactrocera Bactrocera Bactrocera Afrodacus Austrodacus Bactrocera Bactrocera Bactrocera Bactrocera Bactrocera Bactrocera Bactrocera Daculus Gymnodacus Paratridacus Tetradacus Tetradacus Zeugodacus Zeugodacus Zeugodacus Zeugodacus Zeugodacus Out group Out group 19 Menurut Dharmayanti et al. (2010) sekuen organisme yang mempunyai hubungan dekat atau saudara menempati cabang yang bertetangga pada pohon filogenetik. Analisis filogenetika juga digunakan untuk mengikuti perubahan yang terjadi secara cepat yang mampu mengubah suatu spesies. Analisis filogenetika dari keluarga sekuen nukleotida atau asam amino adalah analisis untuk menentukan bagaimana keluarga tersebut diturunkan selama proses evolusi. BAB III METODE PENELITIAN A. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di lima lokasi yang berbeda. 1. Pengambilan buah liar dari Famili Cucurbitaceae yang terserang Bactrocera sp dilakukan di pegunungan Muria Kabupaten Kudus. Pengambilan buah liar dilakukan pada bulan April 2013. 2. Rearing Bactrocera sp dari buah liar dan identifikasi morfologi imago Bactrocera sp dilakukan di Laboratorium Biologi Universitas Negeri Semarang dan diperkuat di Laboratorium Entomologi UGM pada bulan Mei 2013. 3. Pengambilan sampel B. cucurbitae dan B. papayae dari biakan massal Laboratorium Entomologi Dasar Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada dilakukan pada bulan April 2014. 4. Analisis molekuler sampel di Laboratorium Virology Fakultas Pertanian Universitas Gajah Mada pada April-Mei 2014. 5. Sekuensing nukleotida ketiga sampel dengan bantuan jasa Lembaga Genetica science dilakukan di Singapura. B. Subjek Penelitian Sampel dalam penelitian ini terdiri dari tiga jenis Bactrocera sp. Pertama spesimen Bactrocera sp yang terdiri dari imago dan larva yang berasal dari buah liar dari Famili Cucurbitaeceae. Sampel pembanding adalah Bactrocera papayae yang menyerang buah salak dan Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah pare yang diambil dari pembiakan massal lalat buah di Laboratorium Entomologi Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada. 20 21 C. Rancangan penelitian Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif observasional. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah Bactrocera sp yang menyerang buah liar, B. cucurbitae yang menyerang buah pare dan B. papayae yang menyerang buah salak. Ketiga sampel diidentifikasi morfologi dan dianalisis molekulernya. D. Alat dan Bahan penelitian Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini disajikan dalam Tabel 2. Tabel 2. Alat dan Bahan yang digunakan dalam penelitian NO 1 Proses Pengambilan sampel Alat Jaring buah, plastik, gunting, kawat Bahan Buah liar yang ada di Gunung Muria Kudus 2 Rearing Sampel Toples, penyaring , kain tile, mangkuk, penyaring pupa, Spons, kandang Buah liar, pasir kayu, protein, air, gula, oli, 3 Pengawetan specimen Falkon, frezer -20 0C Alkohol 95 %, Ethanol murni 4 Identifikasi morfologi Mikroskop stereo, label, alat tulis, pinset, Mikroskop stereo Sampel Bactrocera sp 5 Isolasi DNA Timbangan analitik, mikropestle, tabung ependorf, vortex, mikropipet, tip, timbangan mikrosentrifuse, label, rak tabung, inkubator, ddH20, etanol absolut, seperangkat Genomic DNA mini kit 6 Elektroforesis gel agarose Electroforesis tool (tanki, bak elektroforesis, sisir, power supply), penangas, Erlenmeyer, alumunium foil, Parafilem, tip, mikropipet Buffer TBE 1x, DNA sampel, Agarose, Etbr (Ethidium bromide), Aquades 7 Amplifikasi PCR Tabung ependorf, Thermal cycle, mikropipet, tip, rak tabung, sarung tangan Primer forward mtD7, primer reverse mtD9, ddH20, PCR Buffer, MgCL2, dNTP, Taq DNA polimerase 22 E. Langkah Kerja 1. Pengambilan Sampel Sampel yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari tiga spesies yaitu Bactrocera sp, B. cucurbitae dan B. papayae. B. cucurbitae dan B. papayae diperoleh dari pembiakan massal Bactrocera sp di Laboratorium Entomologi Dasar Unniversitas Gadjah Mada, sedangkan Bactrocera diperoleh dari pengambilan buah liar (inang Bactrocera sp) famili Cucurbitaeceae. Pengambilan Bactrocera sp yang menyerang buah liar dari hutan pegunungan Muria Kudus. Inang Bactrocera sp adalah buah liar yang tidak dikonsumsi manusia. Buah ini termasuk famili Cucurbitaeceae yang belum diketahui nama spesiesnya. Rasa buahnya sedikit pahit ketika muda dan sedikit hambar ketika sudah matang. Tanaman buah merambat dipohon yang tinggi untuk memperoleh banyak sinar matahari. Ukuran buah berdiameter 15 cm X 15 cm. Buah yang diambil sudah dalam keadaan busuk dan secara makro terlihat ada larva di dalam buah. Berikut adalah foto buah liar yang diserang Bactrocera sp yang diambil dari pegunungan Muria Kudus yang diperjelas pada Gambar 4. Larva yang ada dalam buah dibiakan (Rearing) di Laboratorium untuk diidentifikasi imagonya. Gambar 4. Buah liar yang diserang Bactrocera sp (Dokumen pribadi). 23 2. Rearing Bactrocera sp. Buah yang terinfeksi larva lalat buah diambil dan direaring sampai larva menjadi imago Bactrocera sp (Gambar 5a). Buah yang mengandung lalat buah dapat diketahui dari bekas tusukan ovopositor lalat buah betina. Buah semakin lama semakin membusuk, kemudian diletakan dalam saringan kecil yang dibawahnya ada wadah penampung tetesan air yang berasal dari buah (Gambar 5b). Seperangkat wadah buah tersebut dimasukkan dalam wadah yang berisi limbah kayu dan kemudian ditutup dengan kain tile. Setelah larva berkembang menjadi pupa, kemudian disaring (5c) dan dipindahkan ke sangkar sampai menjadi imago yang digunakan untuk identifikasi selanjutnya (Gambar 5d). c A B d Gambar 5. a) Buah yang sudah busuk karena diserang Bactrocera sp, b) Pembiakan larva, c) Pupa , d) Pembentukan imago (Dokumen pribadi) . 3. Identifikasi spesies Bactrocera secara morfologi Imago yang keluar dari pupa, kemudian diidentifikasi secara morfologi dengan menggunakan mikroskop stereo di Laboratrium Biologi Unniversitas Negeri Semarang dengan bantuan buku pedoman identifikasi lalat buah (Suputa et al. 2006). Hasil identifikasi menunujukan bahwa Bactrocera sp termasuk Bactrocera sp Subgenus Zeugodacus. Langkah selanjutnya untuk keperluan 24 analisis molekuler dilakukan pengawetan specimen dengan menyimpan imago Bactrocera sp dalam etanol murni. Larva instar tiga disimpan dalam alcohol 95 %. Masing-masing awetan disimpan dalam frezer -20 0 C sampai spesimen dibutuhkan untuk isolasi. 4. Identifikasi Bactrocera sp secara molekuler Identifikasi molekuler ketiga spesies Bactrocera dilakukan di Laboratorium Virologi Unniversitas Gadjah Mada. Analisis ini dilakukan melalui beberapa langkah yaitu Isolasi DNA, elektoforesis DNA, reaksi berantai PCR, kemudian dielektoforesis kembali, dan yang terakhir metode sekuensing. Berikut ini dijelaskan langkah-langkah analisis molekuler Bactrocera sp, B. cucurbitae dan B. papayae sebagai berikut. a. Isolasi DNA Isolasi DNA lalat buah menggunakan sampel yang berupa imago dan larva. Masing-masing jaringan sampel dilakukan isolasi DNA genom Bactrocera sp berdasarkan protokol genomic DNA mini kit (tissue) yang tetera pada langkah sebagai berikut: 1) Sampel imago Bactrocera sp diambil jaringan toraknya menggunakan pinset. Jika menggunakan sampel larva, maka diambil larvanya. 2) Sampel ditimbang 30 mg dan dimasukan dalam tube 3) Sampel dihaluskan menggunakan micropestle 4) Pada proses penghalusan 200 µl GT Buffer ditambahkan pada sampel kemudian dihaluskan kembali. 5) Sampel yang telah diahaluskan ditambahkan 20 µl Proteinase K dan dihomogenkan menggunakan vortex. 6) Sampel diinkubasikan pada suhu 60°C selama 30 menit, selama inkubasi tube di bolak-balik setiap 5 menit 7) Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan 200 µl GBT Buffer dan dihomogenkan menggunakan vortex selama 5 detik. 25 8) Sampel diinkubasikan kembali pada suhu 60°C selama 20 menit, selama diinkubasi tube di bolak-balik setiap 5 menit, pada proses ini Elution Buffer dipanaskan (100 µl per sampel) pada 60°C. 9) Sampel disentrifugasi pada 14.000-16.000 selama 2 menit 10) Sampel yang telah disentrifugasi diambil supernatannya sebanyak 1,5 ml dan dipindahkan pada tube baru. 11) Supernatan ditambahkan ethanol absolute sebanyak 200 µl dan di shaker selama 10 detik 12) GD kolom ditempatkan pada tube 2 ml 13) Cairan yang ada pada tube 1,5 ml dipindakan ke GD kolom, setelah itu disentrifugasi pada 14.000-16.000 selama 2 menit 14) GD kolom yang telah disentrifugasi dipindahakn pada tube 2 ml yang baru 15) W1 Buffer sebanyak 400 ul ditambahkan pada GD kolom 16) GD kolom disentrifugasi 14.000-16.000 selama 30 detik, kemudian dipindahkan tube 2 ml yang baru 17) 600 µl Wash Buffer ditambahkan pada GD kolom dan disentrifuse kembali pada 14.000-16.000 selama 30 detik 18) GD kolom dipindahkan pada tube 2 ml yang baru dan disentrifuse 14.00016.000 selama 3 menit 19) GD kolom dipindahkan pada tube 1,5 ml 20) 100 µl Elution Buffer ditambahkan pada bagian tengah tube 21) GD kolom diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit dan disentrifugasi 14.000-16.000 selama 30 detik 22) GD kolom yang telah disentrifugasi dibuang, sedangkan tube pada suhu 20°C/-40°C. Keberhasilan isolasi DNA ketiga sampel Bactrocera.sp, B. cucurbitae dan B. papayae dapat dilihat berdasarkan fragmen DNA yang bermigrasi pada gel agarose. 26 b. Elektroforesis Gel agarose Visualisasi DNA dilakukan dengan elektroforesis pada bak elektroforesis horisontal dengan menggunakan 1,5% gel agarosa. Gel agarosa dibuat dengan melarutkan agarosa dalam bufer 1X TBE dan dipanaskan sampai tercampur homogen dan larutan menjadi jernih. Larutan agarosa kemudian dituang ke dalam bak elektroforesis yang sebelumnya telah dipasang sisir cetakan dan ditunggu sampai menjadi keras (15-20 menit). Elektroforesis dilakukan selama 45 menit pada tegangan 50 volt (lama waktu running tergantung pada konsentrasi gel dan voltase). Setelah elektroforesis, gel agarosa direndam dalam larutan Etbr selama 5 detik kemudian direndam dalam aquades selama 15 menit untuk mencuci atau meminimalkan kontaminan Etbr. Setelah itu DNA divisualisasi menggunakan UV transiluminator. Hasil visualisasi DNA genom dilihat berdasarkan keberadaan pita DNA genom sampel. Hasil isolasi yang baik dapat dilanjutkan pada metode selanjutnya yaitu amplifikasi PCR. c. Amplifikasi PCR Fragmen Cox I yang panjangnya 500 bp diamplifikasi dengan primer forward mtD7 dan primer reverse mtD9. Sekuen primer oligonukleotida dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Primer Oligonukleotida yang digunakan untuk amplifikasi PCR Nama Primer Sekuen (CO1-F) MtD7 5’ATT AGG AGC HCC HGA YAT AGC ATT 3’ (CO1-R) MtD9 5’GAG GCA AGA TTA AAA TAT AAA CTT CTG 3’ 27 Amplifikasi PCR menggunakan master mix kappa dengan total cocktail 12,5 ul dalam setengah kali reaksi yang dijelaskan pada Tabel 4. Tabel 4. Cocktail yang digunakan untuk amplifikasi PCR No 1 2 3 4 5 6 7 Bahan 5x Kappa ekstrak buffer Mgcl2 ddH20 dNtp DNA Polimerase Primer Forward Primer Revers Total vol x reaksi 2,5 ul 0,875 ul 6,375 ul 0,375 ul 0,125 ul 0,625 ul 0,625 ul 12,5 ul Tabung PCR yang sudah berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam mesin Termal cycle yang sudah diprogram untuk 35 siklus pada kondisi yang disajikan pada Tabel 5. Tabel 5. Rangkaian amplifikasi daerah sitokrom oksidase I DNA mitokondria Tahapan Proses Suhu Waktu I Denaturasi 94 3 menit Denaturasi 94 15 detik II Annealing 53 15 detik III Extension 70 1 menit Extention 72 1 menit Tiga mikroliter sampel dari produk PCR dan dua mikroliter loading dye dirunning pada gel agarosa 1,5% untuk menentukan keberadaan dan ukuran DNA yang diamplifikasi. 28 d. Elektroforesis Gel Agarose Metode elektroforesis gel agarose digunakan untuk melihat keberhasilan amplifikasi PCR gen sitokrom oksidase I menggunakan primer forward dan reverse berdasarkan laju migrasi fragmen DNA dalam gel agarose. DNA divisualisasi menggunakan elektroforesis horisontal dengan menggunakan 1,5% gel agarosa. Setelah elektroforesis, DNA divisualisasi di dalam UV transiluminator. Hasil yang baik pada amplifikasi PCR dapat dilanjutkan pada langkah selanjutnya yaitu sekuensing untuk melihat runutan nukleotida gen sitokrom oksidase I pada Bactrocera sp, B. cucurbitae dan B. papayae. e. Sekuensing Produk PCR yang baik dilanjutkan dengan tahap sekuensing. Sekuensing DNA dilakukan untuk mengetahui urutan nukleotida pada daerah cox1. Sekuensing dilakukan pada Lembaga Genetica science di Singapura. f. Analisis Data Data hasil sekuensing berupa ABI file dari Bactrocera sp, Bactrocera papayae dan Bactrocera cucurbitae dilakukan pengeditan secara manual menggunakan program BioEdit Versi 7.0.9. Hasil pengeditan sekuen dimasukkan dalam BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) NCBI untuk melihat homologi dengan spesies terdekat. Pohon filogeni diperoleh dengan menggunakan metode neighbor-joining, dimana kalkulasi matrik jarak genetik dengan model Kimura-2 parameter yang diimplementasikan pada pairwise distance calculation dengan Bootstrap 1000 ulangan dalam program MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) software Versi 6.0 (Tamura et al. 2013). Sekuen sampel yang dibandingkan dengan beberapa koleksi GenBank Bactrocera sp yang dianalisis oleh Zhang et al. 2010. Bactrocera sp yang digunakan dalam analisis ini berasal dari daerah yang berbeda-beda yang disajikan pada Tabel 6 di bawah ini. 29 Tabel 6. Daftar spesies yang dianalisis. Nama spesies Cox I 1 Anastrapha ludens AB192462 2 B.caudata GQ458048 3 B.diaphora GQ458043 4 B. papaya DQ917578 5 B.philippinensis DQ995281 6 B.scutellata GQ458046 7 Bactrocera sp* Sampel 8 B. cucurbitae* Sampel 9 B. papayae* Sampel 10 B. cucurbitae_Prancis JX162208 11 Bactrocera calumniate GQ154808 12 B. cucurbitae DQ116244 13 B.cucurbitae DQ006875.1 Daerah asal Amerika Asia Asia Asia Asia Asia Prancis Asia Asia Swiss Ket:* merupakan sampel dalam penelitian ini. Tanpa keterangan merupakan sampel koleksi dari GenBank. 64 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Penelitian 1. Identifikasi Morfolgi pada Bactrocera yang menyerang buah liar. Hasil identifikasi morfologi Bactrocera sp yang menyerang buah liar Famili (Cucurbitaeceae). Bactrocera sp yang ditemukan ini memiliki karakter morfologi hampir sama dengan B. calumniata tetapi mempunyai pola sayap sama dengan B. cucurbitae. Karakter morfologi tersebut berdasarkan kunci identifikasi mengacu pada pedoman Suputa et al. (2006). Hasil identifikasi Bactrocera sp disajikan pada Lampiran 1. 2. Identifikasi Molekuler Bactrocera sp Ekstraksi DNA sampel menggunakan metode Genomic DNA mini kit. Keberhasilannya dilihat menggunakan elektroforesis gel agarose. a. Elektroforesis Gel Agarosa Elektroforesis DNA hasil ekstraksi disajikan pada Gambar 6. 3 4 Gambar 6. Hasil elektroforesis genom Bactrocera. M=Marker, B. papayae (No 1), B. cucurbitae (No 2), Larva Bactrocera sp (No 3), Imago Bactrocera sp (No 4). 30 31 Ekstraksi dengan Genomic DNA mini kit berhasil mengisolasi genom Bactrocera sp, Bactrocera cucurbitae dan Bactrocera papayae. Hal tersebut dapat dilihat pada pita genom yang jelas, meskipun masih terdapat smear. Pada isolasi DNA genom Bactrocera sp digunakan larva Bactrocera sp karena sampel awetan imago Bactrocera sp terbatas jumlahnya dan untuk meminimalkan kekurangan sampel imago Bactrocera sp. Hasil ekstraksi ini menunjukan bahwa isolasi DNA genom berhasil dengan baik sehingga dapat digunakan untuk analisis selanjutnya yaitu Amplifikasi PCR. b. Amplifikasi DNA Gen Sitokrom oxidase I mtDNA. DNA sampel diamplifikasi menggunakan mesin PCR TaKaRa Thermal Cycler. Amplifikasi DNA sampel menggunakan primer forward mtD7 dan revers mtD9 pada daerah gen cox1 Genom mitokondria Bactrocera sp, Bactrocera cucurbitae dan Bactrocera papayae menghasilkan segmen berukuran ± 500 bp (Gambar 8). Gambar 7. Hasil amplikasi DNA mitokondria Bactrocera daerah cox1; M=Marker 1000 bp, B. papayae (No 1), B. cucurbitae (No 2), Bactrocera sp (No 3), Larva Bactrocera sp (No 4). 32 Hasil Visualisasi fragmen Cox I memperlihatkan fragmen Cox I dapat teramplifikasi menggunakan primer forward mtD7 dan primer reverse mtD9. Pita yang jelas dan tebal menunjukkan kondisi PCR yang optimal tercapai sehingga proses PCR dapat berlangsung dengan baik sehingga dapat diproses pada tahap selanjutnya yaitu Sekuensing. Pada tahap sekuensing dibutuhkan volume cocktail minimal 30 ul. c. Hasil sekuen DNA Hasil Sekuen gen sitokrom oksidase I Bactrocera sp diperoleh panjang ukuran gen 403 bp, B. cucurbitae 427 bp dan Bactrocera papayae 427 bp yang disajikan pada Lampiran 6. Sedangkan hasil analisis sekuen menggunakan progam Mega software 6.0 menunjukan persentase kandungan basa pada daerah cox1 Bactrocera sp, yang tercantum pada Tabel 7. Tabel 7. Kandungan basa nukleotida Bactrocera sp dari progam Mega software 6.0. No Nama spesies T A G 1 B. cucurbitaee_Swiss* 36,6 28,8 16,0 2 Bactrocera sp** 37,2 25,7 16,6 3 B. cucurbitaee** 37,9 26,9 15,2 4 B. papayae** 35,8 29,0 15,7 5 B. caudate* 31,0 35,5 19,7 6 B. diaphora* 29,8 35,1 20,5 7 B. papaya* 34,3 39,2 10,2 8 B.philippinensis* 34.4 39,2 10,2 9 B.scutellata* 29,7 34,7 20,7 10 B.calmuniata* 36,3 28,6 16,9 11 B. cucurbitae_Ind* 36,7 27,8 16,6 12 B.cucurbitaee_Perancis* 34,4 28,3 17,9 13 Anastrepha ludens* 36,3 34,2 12,9 Ket: * * merupakan sampel dalam penelitian ini. * merupakan koleksi sampel dari GenBank. C G+C A+T 18,6 34,6 65,4 20,5 37,0 63,0 19,9 35,1 64,9 19,4 35,1 64,9 13,9 33,6 66,4 14,6 35,1 64,9 16,2 26,5 73,5 16,1 26,4 73,6 14,9 35,6 64,4 18,2 35,1 64,9 18,9 35,5 64,5 19,4 37,3 62,7 16,6 29,5 70,5 33 d. BLAST Penentuan spesies dilakukan dengan analisis BLAST, yaitu membandingkan sekuen Bactrocera sp, B. cucurbitae dan B. papayae dengan database yang ada pada GeneBank. Hasil analisis BLAST dapat dilihat pada Tabel 8. Tabel 8. Hasil analisis BLAST sekuen DNA gen sitokrom oksidase I Karakter Homologi Gaps Acc.Number Gen sitokrom oksidase I Bactrocera sp Bactrocera sp B. cucurbitae B. papayae CL CL CU LB 100 96% 100 100 0% 0% 0% 0% DQ006875.1 GQ154088.1 DQ116244.1 FJ903487.1 Homologi dari nukleotida ke 284-718 bp 240-658 bp 189-613 bp E-value 0.0 0.0 0.0 Ket: CL : Bactrocera sp yang menyerang buah liar. CU : B. cucurbitae yang menyerang buah salak. LB : B. papayae yang menyerang buah pare. 260-686 bp 0.0 Berdasarkan hasil analisis BLAST ditemukan banyak variasi nukleotida pada gen cox1 Bactrocera sp yang diteliti dengan GenBank Acc Number GQ154088.1 (Bactrocera calumniata) dengan tingkat kesamaan (homologi) yaitu 96% (Gambar 8). Bactrocera sp yang menyerang buah liar dilakukan BLAST ulang gen Cox I dengan GenBank Acc Number DQ006875.1 (B. cucurbitae) dengan tingkat kesamaan (homologi) yang tinggi yaitu 100% (Gambar 9). Pada Bactrocera cucurbitae ditemukan variasi nukleotida yang cukup sedikit pada gen cox 1 dengan GenBank Acc Number DQ116244.1 karena tingkat kesamaan (homologi) 100%. Variasi nukleotida terdapat pada urutan basa ke- 388 dan 608 (Gambar 10). Variasi nukleotida Bactrocera papayae dengan GenBank Acc Number FJ903487.1 diperoleh tingkat kesamaan (homologi) 100% dengan variasi basa ke-.256 bp (Gambar 11). 34 Query 1 60 Sbjct GAATGAATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCCTCTCTTACATTACTTTTAGTGAGCA |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 240 GAATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCCTCTCTTACATTACTTTTAGTGAGCA Query 61 120 Sbjct GTATAGTAGAAAACGGAGCTGGTACAGGTTGAACTGTTTATCCTCCCCTTTCATCAATTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| 300 GTATAGTAGAAAACGGAGCTGGTACAGGTTGAACTGTTTACCCTCCCCTTTCATCAATTA Query 121 180 Sbjct TCGCTCATGGTGGAGCCTCAGTTGATTTAGCTATTTTTTCTCTACATTTAGCTGGTATTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 360 TCGCTCATGGTGGAGCCTCAGTTGATTTAGCTATTTTTTCTCTACATTTAGCTGGTATTT Query 181 299 359 419 240 Sbjct CATCAATTTTAGGGGCCGTAAATTTCATTACTACAGTAATTAATATGCGATCAACAGGAA |||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| 420 CATCAATTTTAGGGGCTGTAAATTTCATTACTACAGTAATTAATATACGATCAACAGGGA Query 241 300 Sbjct TCACATTTGACCGGATACCTTTATTCGTTTGAGCTGTAGTATTGACAGCTCTTCTTTTAC | ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| 480 TTACATTTGACCGAATACCTTTATTCGTTTGAGCTGTAGTATTAACAGCTCTTCTTTTAC Query 301 360 Sbjct TTCTATCTCTACCTGTGTTAGCCGGAGCTATTACTATACTTTTAACAGACCGAAATTTAA |||||||||| || || ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||| |||| 540 TTCTATCTCTCCCAGTATTAGCTGGAGCTATTACTATACTTTTAACAGACCGAAACTTAA Query 361 Sbjct ACACCTCTTTCTTCGACCCGGCTGGTGGTGGAGACCCTATTTTATACCAACATTTATTT | ||| |||||||||||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||| 600 ATACATCTTTCTTCGACCCAGCTGGTGGTGGAGATCCTATTTTATACCAACACTTATTT 479 539 599 419 658 Gambar 8. Hasil analisis BLAST gen cox1 Bactrocera sp dengan GenBank Bactrocera calumniata Acc Number GQ154088.1 Keterangan : Angka sebelah kanan gambar menunjukkan urutan nukleotida, tanda : homologi (kesamaan), : merupakan variasi nukleotida. 35 Query 1 Sbjct 284 Query 61 Sbjct 344 Query 121 Sbjct 404 Query 181 Sbjct 464 Query 241 Sbjct 524 Query 301 Sbjct 584 Query 361 Sbjct 644 Query 421 Sbjct 704 GAATGAATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCCTCTCTTACATTACTTTTAGTGAGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAATGAATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCCTCTCTTACATTACTTTTAGTGAGCA 60 GTATAGTAGAAAACGGAGCTGGTACAGGTTGAACTGTTTATCCTCCCCTTTCATCAATTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTATAGTAGAAAACGGAGCTGGTACAGGTTGAACTGTTTATCCTCCCCTTTCATCAATTA 120 TCGCTCATGGTGGAGCCTCAGTTGATTTAGCTATTTTTTCTCTACATTTAGCTGGTATTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCGCTCATGGTGGAGCCTCAGTTGATTTAGCTATTTTTTCTCTACATTTAGCTGGTATTT CATCAATTTTAGGGGCCGTAAATTTCATTACTACAGTAATTAATATGCGATCAACAGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CATCAATTTTAGGGGCCGTAAATTTCATTACTACAGTAATTAATATGCGATCAACAGGAA 343 403 180 463 240 523 TCACATTTGACCGGATACCTTTATTCGTTTGAGCTGTAGTATTGACAGCTCTTCTTTTAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCACATTTGACCGGATACCTTTATTCGTTTGAGCTGTAGTATTGACAGCTCTTCTTTTAC 300 TTCTATCTCTACCTGTGTTAGCCGGAGCTATTACTATACTTTTAACAGACCGAAATTTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTCTATCTCTACCTGTGTTAGCCGGAGCTATTACTATACTTTTAACAGACCGAAATTTAA 360 ACACCTCTTTCTTCGACCCGGCTGGTGGTGGAGACCCTATTTTATACCAACATTTATTTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACACCTCTTTCTTCGACCCGGCTGGTGGTGGAGACCCTATTTTATACCAACATTTATTTT 420 GATTCTTTGGACACC ||||||||||||||| GATTCTTTGGACACC 583 643 703 435 718 Gambar 9. Hasil analisis BLAST gen cox1 Bactrocera sp dengan GenBank Bactrocera cucurbitae Acc Number DQ006875.1 Keterangan : Angka sebelah kanan gambar menunjukkan urutan nukleotida, tanda : homologi (kesamaan), : merupakan variasi nukleotida. 36 Query 1 Sbjct 189 Query 61 Sbjct 249 Query 121 Sbjct 309 Query 181 Sbjct 369 Query 241 Sbjct 429 Query 301 Sbjct 489 Query 361 Sbjct 549 Query 421 Sbjct 609 AATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCCTCTCTTACATTACTTTTAGTGAGCAGTATA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCCTCTCTTACATTACTTTTAGTGAGCAGTATA GTAGAAAACGGAGCTGGTACAGGTTGAACTGTTTACCCTCCCCTTTCATCAATTATCGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAGAAAACGGAGCTGGTACAGGTTGAACTGTTTACCCTCCCCTTTCATCAATTATCGCT 60 248 120 308 CATGGTGGAGCCTCAGTTGATTTAGCTATTTTTTCTCTACATTTAGCTGGTATTTCATCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CATGGTGGAGCCTCAGTTGATTTAGCTATTTTTTCTCTACATTTAGCTGGTATTTCATCA 180 ATTTTAGGGGCTGTAAATTTCATTACTACAGTAATTAATATACGATCAACAGGAATTACA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTTTAGGGGCTGTAAATTTCATTACTACAGTAATTAATATACGATCAACAGGAATTACA 240 TTTGACCGAATACCTTTATTCGTTTGAGCTGTAGTATTAACAGCTCTTCTTTTACTTCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTGACCGAATACCTTTATTCGTTTGAGCTGTAGTATTAACAGCTCTTCTTTTACTTCTA 300 TCTCTCCCAGTATTAGCTGGAGCTATTACTATACTTTTAACAGACCGAAACTTAAATACA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTCTCCCAGTATTAGCTGGAGCTATTACTATACTTTTAACAGACCGAAACTTAAATACA 360 TCTTTCTTCGACCCAGCTGGTGGTGGAGATCCTATTTTATACCAACACTTATTTTGATTC |||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||| TCTTTCTTCGACCCAGCTGGTGGTGGGGATCCTATTTTATACCAACACTTATTTTGATTT 420 TTTGG ||||| TTTGG 368 428 488 548 608 425 613 Gambar 10. Hasil analisis BLAST gen cox1 Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah pare dengan Bactrocera cucurbitae GenBank Acc Number DQ116244.1 Keterangan : Angka sebelah kanan gambar menunjukkan urutan nukleotida, tanda : homologi (kesamaan), : merupakan variasi nukleotida. 37 Query 1 Sbjct 260 Query 61 Sbjct 320 Query 121 Sbjct 380 Query 181 Sbjct 440 Query 241 Sbjct 500 Query 301 Sbjct 560 Query 361 Sbjct 620 Query 421 Sbjct 680 AATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCTTCCCTTACATTACTATTAGTAAGAAGTATA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCTTCCCTTACATTACTATTAGTAAGAAGTATA 60 GTAGAAAACGGAGCTGGTACAGGTTGAACAGTTTACCCACCCCTATCATCTGTTATTGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAGAAAACGGAGCTGGTACAGGTTGAACAGTTTACCCACCCCTATCATCTGTTATTGCA 120 CACGGAGGAGCTTCAGTTGACCTAGCTATTTTTTCACTTCACTTAGCGGGTATTTCCTCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACGGAGGAGCTTCAGTTGACCTAGCTATTTTTTCACTTCACTTAGCGGGTATTTCCTCA 180 ATTTTAGGAGCAGTAAATTTCATTACAACAGTAATTAATATACGATCGACAGGAATCACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTTTAGGAGCAGTAAATTTCATTACAACAGTAATTAATATACGATCGACAGGAATCACC 240 TTTGATCGAATACCTTTATTCGTTTGAGCAGTTGTATTAACAGCTTTATTACTTTTATTA ||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTGATCGAATACCTCTATTCGTTTGAGCAGTTGTATTAACAGCTTTATTACTTTTATTA 319 379 439 499 300 559 TCATTACCAGTTTTAGCAGGGGCTATTACTATATTACTAACAGACCGAAACTTAAATACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCATTACCAGTTTTAGCAGGGGCTATTACTATATTACTAACAGACCGAAACTTAAATACT 360 TCCTTTTTTGACCCTGCCGGAGGAGGAGATCCTATTCTTTACCAACATTTATTTTGATTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCCTTTTTTGACCCTGCCGGAGGAGGAGATCCTATTCTTTACCAACATTTATTTTGATTC 420 TTTGGAC ||||||| TTTGGAC 619 679 427 686 Gambar 11. Hasil analisis BLAST gen cox1 Bactrocera papayae yang menyerang buah salak dengan Bactrocera papayae GenBank Acc Number FJ903487.1 angka sebelah kanan gambar menunjukkan urutan nukleotida, tanda : homologi (kesamaan), : merupakan variasi nukleotida. e. Lokasi penempelan primer Lokasi penempelan primer MtD7 dan MtD9 pada gen sitokrom oksidase I menghasilkan ukuran fragmen ± 430 bp yang disajikan pada Gambar 12. Around 250 bp Cox I ± 430 bp ± 1500 bp Gambar 12. Lokasi penempelan primer Around 820 bp 38 f. Analisis Asam Amino Alignment terhadap susunan asam amino sangat penting dilakukan mengingat adanya mutasi dari nukleotida pada daerah coding sequence, dikhawatirkan akan berpengaruh terhadap fungsi dari protein yang dibentuknya (Dale dan Park 2004). Hasil alignment susunan nukleotida terhadap sampel lainnya di GenBank dengan program Mega Software 6.0 disajikan pada Gambar 13 dan Hasil aligment asam amino pada Gambar 14. #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* TCG ----... ----... --- CGA ----... ----... --- CAA ----... ----... --- TGG ----... ----... --- CTA ----... ----T.. --- TTT ----... ----..C --- TCA ----... ----... --- ACG ----... ----..A --- AAC ----... ----..T --- CAT ----... ----... --- AAA ----... ----... --- GAT ----... ----... --- ATC ----... ----..T --- GGA ACA TTA TAT TTT ATT TTC GGA GCT TGA GCA GGT --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ----. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ----- --- --- --- --- --- --- --- --- -AG ... ... ... ..T ... ... ... ..C ... ... ..C ... ... ..A --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --ATA --... ... --... ... --GGT --..G ... --... ... --- GTG --..A ... --..A ..A --- CAC --... ... --... ... --- TAT --... ... --... ... --- GGA --... ... --... ... --- CCA --... ... --... ... --- AAT --... ... --... ... --- ACA --... ... --... ... --- GGA --... ... --... ... --- GTC --..A ... --... ..A --- TCT --... ... --... ... --- GCT --... ... --... ... --- ATC --... ... --... ..T --- CTT --... ... --... ... --- TTA --... ... --... ... --- GTA --... ... --... ... --- AGA --... ... --... ... --- ATC --..T ... --... ... --- ACA --... ... --... ... --- ATC --..T ... --... ..T --- GGA --... ... --... ..T --- GCT --... ... --... ... --- TTA --... ... --... ... --- GAT --... ... --... ..C --- CAT --... ... --... ... --- ATC --G.T G.. --G.. G.. --- GAT --..C ... --... ... --- GCA --... ... --... ..T --- CGG --..A ... --... ..A --- CAA --... ... --... ... --- TTT --... ... --... ..C --- GCA --... ... --... ..T --- GAA --... ... --... ... --- CTG --..A ... --... ..C --- ATT --... ... --... ... --- TTT --... ... --... ..C --- ATC --... ... --... ..T --- GTT --... ... --... ..A --- ATG --..A ... --... ..A --- 39 #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* TTC --... ... --... ..T --- ATA --..G ... --... ... --- GTG --..A ... --..A ..T --- ATA --..G ... --... ... --- CCT --... ... --... ..A --- ATT --... ... --... ... --- ATA --... ... --... ... --- ATT --... ... --... ... --- GGA --... ... --... ..T --- GGA --... ... --... ... --- TTT --... ... --... ... --- GGA --... ... --... ... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* AAT --... ... --... ... --- TGA --... ... --... ... --- CTA --T.. ... --... ..T --- GTA --... ... --... ..T --- CCC --..T ... --... ..T --- CTA --... ... --... T.. --- ATA --... ... --... ... --- CTA --T.. ... --... T.. --- GGA --... ... --... ... --- GCG --..A ... --... ..T --- CCA --... ... --... ..C --- GAT --... ... --... ... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* TTC --... ... --... ..T --- CCT --... ... --... ..A --- CGA --... ... -.. ... ... --- ATG --..A ... ... ... ... --- AAT ... ... ... ... ... ... ... AAT ... ... ... ... ... ... ... ATA ... ... ... ... ... ... ... AGA ... ... ... ... ... ... ... TTT ... ... ... ... ... ... ... TGA ... ... ... ... ... ... ... TTA ... ... ... ... ... ... ... TTA ... ... ... ... ... ... ... #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* CCC ..T ..T ..T ..T ..T ..T ..T CCC ... ... ... ... ... ..T ..T TCT ... ... ... ... ... ..C ..C CTT ... ... ... ... ... ... ... ACA ... ... ... ... ... ... ... TTA ... ... ... ... ... ... ... CTT ... ... ... ... ... ..A ..A TTA ... ... ... ... ... ... ... GTG ... ... ... ... ... ..A ..A AGC ... ... ... ... ... ..A ..A AGT ... ... ... ... ... ... ... ATA ... ... ... ... ... ... ... #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* ATA --... ... --... ... --- GCA --..G ... --... ... --- GTA ... ... ... ... ... ... ... GAA ... ... ... ... ... ... ... AAC GGA GCT GGT ACA GGT TGA ACT GTT TAT CCT CCC ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..C ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..C ..A ... #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* CTT ... ... ... ... ... ..A ..A TCA ... ... ... ... ... ... ... TCA ... ... ... ... ... ..T ..T ATT ... ... ... ... ... G.. G.. ATC ... ... ... ... ... ..T ..T GCT ... ... ... ... ... ..A ..A CAT ... ... ... ... ... ..C ..C GGT ... ... ... ... ... ..A ..A GGA ... ... ... ... ..G ... ... GCC ... ... ... ... ... ..T ..T TCA ... ... ... ... ... ... ... GTT ... ... ... ... ... ... ... #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* GCT ... ... ... ... ... ... ... ATT ... ... ... ... ... ... ... TTT ... ... ... ... ... ... ... TCT ... ... ... ... ... ..A ..A CTA ... ... ... ... ..G ..T ..T CAT ... ... ... ... ... ..C ..C TTA ... ... ... ... ... ... ... GCT ... ... ... ... ... ..G ..G GGT ... ... ... ... ... ... ... ATT ... ... ... ... ... ... ... TCA ... ... ... ... ... ..C ..C TCA ... ... ... ... ... ... ... GAT ... ... ... ... ... ..C ..C TTA ... ... ... ... ... C.. C.. 40 #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* ATT ... ... ... ... ... ... ... TTA ... ... ... ... ... ... ... GGG ... ... ... ... ..A ..A ..A GCC ..T ..T ... ... ... ..A ..A GTA ... ... ... ... ... ... ... AAT ... ... ... ... ... ... ... TTC ... ... ... ... ... ... ... ATT ... ... ... ... ... ... ... ACT ... ... ... ... ... ..A ..A ACA ... ... ... ... ... ... ... GTA ... ... ... ... ... ... ... ATT ... ... ... ... ... ... ... #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* CGA ... ... ... ... ... ... ... TCA ... ... ... ... ... ..G ..G ACA ... ... ... ... ... ... ... GGA ... ..G ... ... ... ... ... ATC ..T ..T ... ... ... ... ... ACA ... ... ... ... ... ..C ..C TTT ... ... ... ... ... ... ... GAC ... ... ... ... ... ..T ..T CGG ..A ..A ... ... ... ..A ..A ATA ... ... ... ... ... ... ... CCT ... ... ... ... ... ... ... TTA ... ... ... ... ... C.. ... #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* TTC ... ... ... ... ... ... ... GTT ... ... ... ... ... ... ... TGA ... ... ... ... ... ... ... GCT ... ... ... ... ... ..A ..A GTA ... ... ... ... ... ..T ..T GTA ... ... ... ... ... ... ... TTG ..A ..A ... ... ... ..A ..A ACA ... ... ... ... ... ... ... GCT ... ... ... ... ... ... ... CTT ... ... ... ... ... T.A T.A CTT ... ... ... ... ... T.A T.A TTA ... ... ... ... ... C.T C.T #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* TCT ... ... ... ... ... ..A ..A CTA ..C ..C ... ... ... T.. T.. CCT ..A ..A ... ... ... ..A ..A GTA ... ... ..G ..G ... ..T ..T TTA ... ... ... ... ... ... ... GCC ..T ..T ... ... ... ..A ..A GGA ... ... ... ... ... ..G ..G GCT ... ... ... ... ... ... ... ATT ... ... ... ... ... ... ... ACT ... ... ... ... ... ... ... ATA ... ... ... ... ... ... ... CTT ... ... ... ... ... T.A T.A #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* TTA ... ... ... ... ... C.. C.. ACA ... ... ... ... ... ... ... GAC ... ... ... ... ... ... ... CGA ... ... ... ... ... ... ... AAT ..C ..C ... ... ..C ..C ..C TTA ... ... ... ... ... ... ... AAC ..T ..T ... ... ... ..T ..T ACC ..A ..A ... ... .-..T ..T TCT ... ... ... ... --..C ..C TTC ... ... ... ... --..T ..T TTC ... ... ... ... --..T ..T GAC ... ... ... ... --... ... #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* GGT ... ... ... ... --..A ..A GGT ... ... ... ... --..A ..A GGA ... ... ... ... --... ... GAC ..T ..T ... ... --..T ..T CCT ... ... ... ... --... ... ATT ... ... ... ... --... ... TTA ... ... ... ... --C.T C.T TAC ... ... ... ... --... ... CAA ... ... ... ... --... ... CAT ..C ..C ... ... --... ... TTA ... ... ... ... --... ... TTT ... ... ... ... --... ... #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* TGA ... --... ... --... ... TTC ... --... ... --... ... TTT ... --... ... --... ... GGA ... --... ... --... ... CAC .---... ... --... .-- CCT ----... .---..A --- GAA ----??? ----... --- GTT ----??? ----... --- TAT ----.TA ----... --- ATT ----TA. ----... --- TTA ----... ----... --- ATT ----... ----... --- AAT ... ... ... ... ... ... ... ATG ..A ..A ... ... ... ..A ..A CTT ... ... ... ... ... T.A T.A CTA ... ... ... ... ... T.. T.. CCG ..A ..A ... ... --..T ..T GCT ... ... ... ... --..C ..C TTA ----... ----C.T --- CCA ----... ----... --- 41 #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* GGA ----... ----... --- TTC ----... ----... --- GGT ----... ----... --- ATA ----... ----... --- ATT ----... ----... --- TCT ----... ----... --- CAT ----... ----... --- ATT ----... ----... --- ATT ----... ----... --- AGA ----... ----... --- CAA ----... ----... --- GAA ----... ----... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* TCG ----... ----..A --- GGT ----... ----..A --- AAA ----... ----..G --- AAG ----... ----... --- GAA ----... ----... --- ACA ----... ----... --- TTT ----... ----... --- GGT ----... ----..A --- TCC ----... ----..T --- TTA ----... ----C.. --- GGT ----... ----..A --- ATA ----... ----... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* GCT ----... ----... ATA ATA GCA ATT GGA TTA CTT GGA TTT ATT GTA --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ----- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ----- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --... ... ... ... ..T C.. T.A ... ... ... ... --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* TGA ----... ----... --- GCC ----... ----..T --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calu;mniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* CGA GCT TAC TTC ACT TCA GCT ACA ATA ATT ATT GCT --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ----- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ----- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --..T ..C ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ..G --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* GTT CCT ACT GGA ATT AAA ATT TTC AGA TGA CTA GCC ACT CTT --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ----- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ----- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --..A ..C ..A ..T ... ... ... ..T ..T ... ..G ..T ..A T.A --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* CAT ----... ----..C --- GGA ----... ----..T --- CAC ----... ----..T --- ACA ----... ----... --- CAT ----... ----..C --- CAA ----... ----... --- ATA ----... ----... --- TTA ----... ----... --- TTT ----... ----..C --- AAT ----... ----..C --- ACA ----... ----... --- TAT ----... ----... --- GTA ----... ----... --- TCC ----... ----..A --- GGT ----... ----..A --- CCA ----... ----... --- ATA ----... ----... --- GCT ----... ----..C --- GAT ----... ----... --- ATG ----... ----..A --- GTT ----... ----..A --- CTA ----... ----T.G --- ATT ----... ----... --- GAT ----... ----... --- TGA ----... ----... --- TAC ----... ----..T --- ACT ----... ----... --- 42 #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* CCT ----... ----..C --- ACT ----... ----..A --- GGA ----... ----..T --- ATT ----... ----... --- AAA ----... ----... --- ATT ----... ----... --- TTC ----... ----..T --- AGA ----... ----..T --- TGA ----... ----... --- CTA ----... ----..G --- GCC ----... ----..T --- ACT ----... ----..A --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* GGA ----... ----..T --- ACA ----... ----... --- CAA ----... ----... --- TTA ----... ----... --- AAT ----... ----..C --- TAT ----... ----... --- TCC ----... ----..A --- CCA ----... ----... --- GCT ----... ----..C --- ATG ----... ----..A --- CTA ----... ----T.G --- TGA ----... ----... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* GCT ----... ----..C --- TTA ----... ----C.. --- GGT ----... ----..G --- TTT ----... ----... --- GTA ----... ----... --- TTT ----... ----..C --- TTA ----... ----C.. --- TTC ----... ----..T --- ACA ----... ----... --- GTT ----... ----..A --- GGG ----... ----..A --- GGA ----... ----... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* GGA ----... ----... --- GTA ----... ----... --- GTA ----... ----..T --- TTA ----... ----C.T --- GCC ----... ----..T --- AAC ----... ----..T --- TCT ----... ----..A --- TCT ----... ----... --- GTT ----... ----..A --- GAT ----... ----... --- ATT ----... ----... --- ATT ----... ----... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* CTT ----... ----... --- CAT ----... ----... --- GAC ----... ----... --- ACT ----... ----..A --- TAC ----... ----..T --- TAC ----... ----... --- GTA ----... ----... --- GTA ----... ----... --- GCT ----... ----... --- CAT ----... ----... --- TTC ----... ----... --- CAT ----... ----..C --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* TTA ----... ----... --TTT ----... ----..C --- TCA ----... ----... --- GTA ----... ----..T --- ATA ----... ----... --- CAC ----... ----... --- GGA ----... ----... --- TGA ----... ----... --- GCA ----... ----... --- TAC ----... ----... --- GTA ----... ----..C --- CCA ----... ----..C --- TTT ----... ----... --- TTA ----... ----C.. --- GCT ----... ----... --- TTT ----... ----... --- ATT ----... ----... --- ACT ----... ----..A --- ATA ----... ----... --- GGA ----... ----..G --- GCT ----... ----..A --- TTA ----... ----C.. --- CTT ----... ----T.A --- CAT ----... ----..C --- CTA ----... ----T.. --- ACT ----... ----..A --- TAT ----... ----... --- GTT ----... ----..A --- GGA ----... ----... --- GTT ----... ----..A --- TTA ----... ----... --- AAT ----... ----... --- 43 #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* CCT ----... ----... --- AAG ----... ----..A --- TGA ----... ----... --- TTA ----... ----... --- AAA ----... ----... --- AGT ----... ----... --- CAA ----... ----... --- TTT ----... ----... --- ATT ----... ----... --- ATT ----... ----..C --- ATA ----... ----... --- TTT ----... ----... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* ATT ----... ----..C --- GGT ----... ----..A --- GTA ----... ----... --- AAC ----... ----..T --- TTA ----... ----... --- ACT ----... ----..C --- TTC ----... ----... --- TTC ----... ----... --- CCT ----... ----..A --- CAA ----... ----... --- CAC ----... ----... --- TTC ----... ----..T --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* TTA ----... ----... --- GCA ----... ----... --- GGA ----... ----..G --- ATA ----... ----... --- CCT ----... ----... --- CGA ----... ----... --- CGT ----... ----... --- TAC ----... ----... --- TCC ----... ----... --- GAC ----... ----... --- TAC ----... ----... --- CCA ----... ----... --- TTA ----... ----... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* GAT ----... ----... --- GCT ----... ----... --- TAC ----... ----... --- ACA ----... ----... --- ACG ----... ----..A --- TGA ----... ----... --- AAC ----... ----..T --- GTA ----... ----... --- GTT ----... ----... --- TCT ----... ----... --- ACA ----... ----..T --- ATT ----... ----... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* TCA ----... ----..T --- ATT ----... ----... --- TCT ----... ----... --- TTA ----... ----... --- CTA ----... ----... --- GGA ----... ----... --- ATT ----... ----... --- CTT ----... ----T.A --- TTC ----... ----... --- TTT ----... ----..C --- TTA ----... ----C.. --- TTT ----... ----..C --- GGA ----... ----... --- GGT ----.C. ----... --- TCA ----... ----... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* ATT ----... ----..C --- ATT ----... ----... --- TGA ----... ----... --- GAA ----... ----... --- AGA ----... ----..T --- TTA ----... ----... --- GTT ----... ----..A --- ACT ----... ----..A --- CAA ----... ----... --- CGT ----... ----..A --- CAA ----... ----... --- GTA ----... ----... --- ATT ----... ----... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* CCA ----... ----..T --- ATA ----... ----... --- CAA ----... ----..G --- CTT ----... ----... --- AGT ----... ----... --- TCT ----... ----... --- TCA ----... ----... --- ATT ----... ----... --- GAA ----... ----... --- TGA ----... ----... --- CTT ----... ----... --- CAA ----... ----... --- AAT ACA --- ----- ------... --- TAC ----... ----... --- ----..C --- 44 #B.cucurbita_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* CCA ----... ----..C --- CCT ----... ----..A --- GCT ----... ----... --- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* AAT ----... ----... --- T-----.TC ----.A--- ------TAA --------- GAA ----... ----... --- CAT ----... ----..C --- AGT ----... ----... --- TAT ----... ----... --- TCA ----... ----... --- GAA ----... ----... --- TTA ----... ----C.. --- CCT ----... ----... --- CTT ----... ----... --- TTA ----... ----... --- ACT ----... ----... --- Gambar 13. Hasil aligment nukleotida dengan koleksi sampel GenBank. Ket : * merupakan sampel dalam penelitian ini. #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* SRQWLFSTNH ------------------.......... ------------------.......... ---------- KDIGTLYFIF -------------...... .......... ------------------.......... ---------- GAWAGMVGTS ---------.......... .......... ------------....... .......... ---------- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* IYNVIVTAHA ---------.......... .......... ---------.......... .......... ---------- FVMIFFMVMP ---------.......... .......... ---------.......... .......... ---------- IMIGGFGNWL ---------.......... .......... ---------.......... .......... ---------- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* VPLMLGAPDM ---------.......... .......... ---------.......... .......... ---------- AFPRMNNMSF -----..... .......... .......... ----...... .......... .......... -----..... WLLPPSLTLL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* SSIIAHGGAS .......... .......... .......... .......... .......... ..V....... ..V....... VDLAIFSLHL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... AGISSILGAV .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* NFITTVINMR .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... STGITFDRMP .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... LFVWAVVLTA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... LSILIRAELG ---------....V..... ....V..... ---------....V..... ....V..... ---------- HPGALIGDDQ ---------.......... .......... ---------.......... .......... ---------- LVSSMVENGA .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... GTGWTVYPPL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... LLLLLSLPVL .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... AGAITMLLTD .......... .......... .......... .......... .......... .......... .......... 45 #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* RNLNTSFFDP AGGGDPILYQ HLFWFFGHPE .......... .......... .......--.......... .......... ...------.......... .......... .........? .......... .......... ........-...----------------------------.......... .......... .......... .......... .......... .......--- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* VYILILPGFG ------------------?LY....... ------------------.......... ---------- MISHIISQES ------------------.......... ------------------.......... ---------- GKKETFGSLG ------------------.......... ------------------.......... ---------- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* FTVGMDVDTR ------------------.......... ------------------.......... ---------- AYFTSATMII ------------------.......... ------------------.......... ---------- AVPTGIKIFS ------------------.......... ------------------.......... ---------- MIYAMMAIGL ------------------.......... ------------------.......... ---------- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* WLATLHGTQL ------------------.......... ------------------.......... ---------- NYSPAMLWAL ------------------.......... ------------------.......... ---------- GFVFLFTVGG ------------------.......... ------------------.......... ---------- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* VVAHFHYVLS ------------------.......... ------------------.......... ---------- MGAVFAIMAG ------------------.......... ------------------.......... ---------- FVHWYPLFTG ------------------.......... ------------------.......... ---------- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* LVLNPKWLKS ------------------.......... ------------------.......... ---------- QFIIMFIGVN ------------------.......... ------------------.......... ---------- LTFFPQHFLG ------------------.......... ------------------.......... ---------- #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* VSTIGSSISL ------------------....A..... ------------------.......... ---------- LGILFFLFII ------------------.......... ------------------.......... ---------- WESLVTQRQV ------------------.......... ------------------.......... ---------- LGFIVWAHHM ------------------.......... ------------------.......... ---------- LTGVVLANSS ------------------.......... ------------------.......... ---------- VDIILHDTYY ------------------.......... ------------------.......... ---------- LAGMPRRYSD ------------------.......... ------------------.......... ---------- YPDAYTTWNV ------------------.......... ------------------.......... ---------- 46 #B.cucurbitae_JN635562 #B.cucurbitae* #B.calumniata_IND #B.cucurbitae_Swiss #bactrocera_sp* #B.cucurbitae_Perancis #B.papayae_DQ917578 #B.papayae* IYPMQLSSSI ------------------.......... ------------------.......... ---------- EWLQNTPPAE ------------------.......... ------------------.......... ---------- HSYSELPLLT ------------------.......... ------------------.......... ---------- N-----.F* ----.---- Gambar 14. Hasil aligment asam amino dengan koleksi sampel GenBank. Ket : * merupakan sampel dalam penelitian ini. g. Aligmant DNA Berdasarkan neighbor - joining (NJ) (Saitou & Nei 1987 ) dengan Bootstrap 1000x ulangan (Felsenstein 1985) diperoleh kontruksi filogeni (Nei & Kumar 2000) dari sampel Bactrocera sp yang menyerang buah liar, Bactrocera cucurbitae dan Bactrocera papayae dengan koleksi GenBank (Zhang et al. 2010) yang dimodifikasi pada Tabel 6. 99 B.cucurbitae_Swiss Bactrocera sp* 95 B.cucurbitae_Perancis 100 B.cucurbitae_Ind 100 B.cucurbitae* 100 28 B.calumniata_Ind B.philipinensis_Asia B.papayae_Asia 100 80 B.papayae* B.caudata_Asia B.diaphora_Asia 100 100 B.scutellata_Asia Anastrepha ludens Gambar 15. Kladogram fragmen Cox I Bactrocera sp Keterangan : * merupakan sampel dalam penelitian. Bactrocera sp* merupakan sampel yang menyerang buah liar. Angka pada kladogram menunjukkan nilai Bootstrap. Anastrepha ludens merupakan Outgroup. 47 h. Pairwise Distance calculation Hasil kedekatan menggunakan hubungan Pairwise Distance genetik antara Bactrocera sp dianalisis Calculation (Tamura et al. 2013) yang digambarkan pada Tabel 9. Tabel 9. Hasil pairwise distance calculation dari Bactrocera sp No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 0.01 0.019 0.026 0.025 0.019 0.019 0.025 0.010 0.010 0.007 0.026 0.01 0.019 0.026 0.025 0.019 0.019 0.025 0.010 0.010 0.007 0.026 0.018 0.025 0.025 0.019 0.018 0.025 0.003 0 0.011 0.026 0.025 0.025 0.003 0.005 0.025 0.019 0.018 0.019 0.026 0.016 0.025 0.025 0.017 0.025 0.025 0.026 0.026 0.025 0.025 0.004 0.025 0.025 0.025 0.026 0.004 0.025 0.019 0.019 0.019 0.026 0.025 0.018 0.018 0.019 0.026 0.025 0.025 0.003 0.025 0.011 0.011 0.026 0.026 0.026 0.026 Ket: B. cucurbitae_Swiss (1), Bactrocera sp* (No2), B. cucurbitae* (No 3), B. papayae* (No 4), B.caudata (No 5), B. diaphora (No 6), B. papayae (No7), B.philipinensis (No 8), B. scutellata *(No 9), Bactrocera sp (No 11), B. cucurbitae_Reonion (No 12), Anastrapha ludens (No 13). B. Pembahasan Pada penelitian ini, dieksplorasi sekuen gen sitokrom oksidase I pada Bactrocera sp, Bactrocera cucurbitae dan Bactrocera papayae. Alasan pemilihan gen sitokrom oxidase I adalah fragmen Cox I mengalami evolusi paling rendah dibandingkan gen di mtDNA lainnya yang mengalami evolusi cepat. Sedikit perbedaan pada Cox I diharapkan dapat mengidentifikasi spesies secara akurat (Zein & Prawiradilaga 2013). Ukuran gen sitokrom oksidase I DNA mitokondria Bactrocera sp 1533 bp. Gen Cox I mengkode 511 asam amino (NCBI 2011). Variasi asam amino pada 13 48 Bactrocera sp subgenus Zeugodacus lebih sedikit dibandingkin subgenus Bactrocera (Jamnongkluk et al. 2013). Pada penelitian ini diperoleh ukuran gen sitokrom oksidase I Bactrocera sp 430 bp, B.cucurbitae dan B.papayae 427 bp yang menyandi 140 asam amino dengan satu variasi asam amino pada subgenus Bactrocera. Hasil isolasi genom DNA Bactrocera sp, Bactrocera cucurbitae dan Bactrocera papayae memperlihatkan pita DNA yang tipis dan masih terdapat smear. Hasil pita yang masih terdapat smear membuktikan bahwa proses ekstraksi belum berjalan dengan baik dan masih terdapat kotoran DNA (debris) yang masih tertinggal. Pada penelitian ini terdapat hambatan pada tahap penghalusan sampel dengan micropesstle. Sampel Bactrocera sp yang sudah tersimpan lama dalam awetan membuat sampel ini sulit untuk dihaluskan sehingga pada saat isolasi DNA genom ini masih terdapat debris yang terbawa. Oleh karena itu untuk meminimalkan terjadinya kekurangan sampel awetan imago Bactrocera sp, larva Bactrocera sp juga diisolasi. DNA genom yang berhasil diisolasi dari Bactrocera sp, Bactrocera cucurbitae dan Bactrocera papayae dilanjutkan pada tahap selanjutnya yaitu amplifikasi PCR. Berdasarkan hasil amplifikasi PCR, fragmen Cox I Bactrocera sp, Bactrocera cucurbitae dan Bactrocera papayae dapat teramplifikasi dengan baik menggunakan primer forward mtD7 dan primer reverse mtD9. Menurut Yuwono (2006) faktor yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi PCR adalah kemurnian DNA hasil ekstraksi, komposisi bahan pereaksi, serta kondisi PCR yang tepat, terutama pada proses annealing (penempelan primer). Proses anneling membutuhkan suhu yang optimal untuk memungkinkan primer akan menempel secara spesifik pada kedua ujung DNA template (Melting Temperature). Suhu yang tinggi mengakibatkan primer tidak dapat menempel dengan DNA template, sebaliknya jika melting temperature terlalu rendah dari suhu penempelan optimum menyebabkan mispriming (penempelan primer pada tempat yang salah pada DNA template. 49 Pada penelitian ini hambatan yang sering terjadi yaitu kesulitan dalam penentuan suhu optimum annealing agar primer dapat menempel dengan sempurna sehingga DNA dapat teramplifikasi. Oleh karena itu, dilakukan optimasi suhu dengan mencoba beberapa range suhu dari 51ºC hingga 55ºC, hingga didapatkan suhu optimum annealing yaitu 53 ºC. Selain itu, hambatan pada penelitian ini adalah komposisi pereaksi PCR yang terbaik agar pita hasil amplifikasi DNA tebal. Pada amplifikasi PCR ini ditemukan pita DNA yang terbaik dengan setengah reaksi cokctail. Berdasarkan lokasi penempelan primer pada Gambar 12 menjelaskan bahwa primer forward MtD7 & Reverse MtD9 dapat mengamplifikasi gen sitokrom oksidase I sebesar ± 430 bp. Proses amplifikasi PCR menghasilkan ukuran gen cox 1 Bactrocera sp 435 bp, Bactrocera cucurbitae 427 bp dan Bactrocera papayae 427 bp. Hasil amplifikasi PCR yang baik dilanjutkan pada tahap selanjutnya yaitu sekuensing DNA melalui bantuan jasa lembaga Genetica science di Singapura. Hasil sekuensing berupa urutan nukleotida dalam bentuk ABI file dilakukan pengeditan dalam progam Bio edit versi 7.0.9. Pengeditan dilakukan untuk menghilangkan basa yang tidak perlu dengan membandingkan sekuen dengan kromatogram. Hasil yang baik dilakukan perbandingan alligment dalam Clustal W. Sekuen yang telah dilakukan pengeditan dimasukkan dalam BLAST NCBI untuk mengetahui homologi sekuen sampel dengan spesies terdekat dari koleksi GenBank. Berdasarkan hasil BLAST dari sekuen yang diperoleh menunjukan nilai homologi yaitu 96% pada gen cox 1 Bactrocera sp dengan GenBank Acc Number GQ154088.1 (Bactrocera calumniata). Nilai homologi kurang dari 99% menunjukkan bahwa spesies tersebut adalah spesies lain dari Bactrocera calumniata. Bactrocera sp ini dilakukan BLAST ulang dengan Bactrocera cucurbitae pada koleksi GenBank DQ006875.1 diperoleh nilai homologi 100%. Hal tersebut menunjukkan bahwa Bactrocera sp yang menyerang buah liar mempunyai hubungan kekerabatan lebih dekat dengan Bactrocera cucurbitae. 50 Hasil BLAST pada gen cox 1 B. cucurbitae yang menyerang buah pare dan Bactrocera papayae yang menyerang buah salak dengan GenBank Acc Number DQ116244.1 dan JN833638.1 memperoleh nilai homologi yang tinggi yaitu 100%. Hasil tersebut menunjukkan bahwa sampel B. cucurbitae yang menyerang buah pare adalah Bactrocera cucurbitae dan B. papayae yang menyerang buah salak merupakan Bactrocera papayae. Perbedaan nukleotida diatara Bactrocera sp digambarkan melalui sekuen nukleotida hasil aligment BLAST (Gambar 811). Data hasil alignment menemukan variasi nukleotida yang cukup banyak pada gen Cox I Bactrocera sp dengan GenBank Acc Number GQ154088.1 (Bactrocera calumniata). Hal ini dikarenakan Bactrocera sp bukan bagian dari Bactrocera calumniata sehingga ditemukan banyak perbedaan nukleotida (Gambar 8). Hasil sebaliknya diperoleh pada gen Cox I Bactrocera sp yang menyerang buah liar dengan GenBank Acc Number DQ006875.1 (B.cucurbitae) yang menunjukan tidak ditemukan variasi nukleotida. Hal tersebut dikarenakan Bactrocera sp yang menyerang buah liar diidentifikasi sebagai Bactrocera cucurbitae (Gambar 9). Pada Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah pare ditemukan dua variasi nukleotida pada basa ke-388 dan 420 dengan GenBank Acc Number DQ116244.1. Mutasi transisi (mutasi yang terjadi dalam satu kelompok basa purin atau pirimidin) pada basa ke- 388 (AG) dan (CT) (Gambar 10). Pada Bactrocera papayae yang menyerang buah salak terdapat variasi basa ke-256 pada gen Cox I dengan GenBank Acc Number FJ903487.1, disebabkan mutasi transisi (TC) (Gambar 11). Variasi nukleotida Cox I pada Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah liar (Gambar 9), Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah pare (Gambar 10) dan Bactrocera papayae yang menyerang buah salak (Gambar 11) yang cukup kecil menunjukkan bahwa fragmen Cox I merupakan daerah yang dipertahankan dalam mtDNA sehingga sedikit perbedaan nukleotida ini dapat menentukan identitas spesies. Hal ini sesuai dengan pernyataan Zein & Prawiradilaga (2013) 51 yang mengungkapkan bahwa fragment Cox I merupakan gen yang mengalami evolusi rendah dibandingkan gen lainnya dalam mtDNA yang secara umum mengalami evolusi cepat. Kajian untuk mengetahui pengaruh mutasi terhadap perubahan asam amino dilakukan aligment berdasarkan susunan asam amino. Hasil alignment asam amino pada Gambar 14 memperlihatkan adanya kesamaan susunan asam amino penyusun gen sitokrom oksidase I mtDNA antara sampel dengan sampel lainnya yang ada di Genbank. Ada salah satu basa yang berubah susunan aminonya yaitu pada kelompok subgenus Bactrocera yang berbeda dengan susunan asam amino subgenus Zeugodacus. Hasil tersebut memperlihatkan bahwa sekalipun pada tingkat nukleotida terlihat adanya mutasi (transisi maupun tranversi), namun mutasi yang terjadi hanya bersifat mutasi silent yakni mutasi pada nukleotida yang tidak menimbulkan perubahan asam amino, sehingga tidak mengubah fungsi dari gen sitokrom oksidase I (Zein & Prawiradilaga 2013). Kodon dengan pola seperti itu, menurut Dale dan Park (2004) dikenal dengan istilah synonymous codons. Zhang et al. (2010) menambahkan bahwa karakteristik lain mtDNA terdapat pada prosentase kandungan basa. Kandungan basa A-T pada mtDNA Bactrocera sp lebih banyak dibandingkan kandungan G-C (Tabel 7). Hasil tersebut sesuai dengan Zhang et al. (2010), Muraji & Nakahara (2002), Jamnongkluk et al. (2003). Hasil prosentase kandungan basa dialigment menggunakan Clustal W dalam progam Mega software 6.0 yang sebelumnya digunakan untuk merekonstruksi pohon filogeni Bactrocera sp. Berdasarkan analisis pohon filogenetik menggunakan metode Neighbourjoirning dengan Bootstrap 1000x (Gambar 15) ulangan memperlihatkan bahwa analisis menggunakan fragmen mtCOI akan menghasilkan pengelompokan kekerabatan berdasarkan geografi (filogeografi). Antar wilayah filogeografi mempunyai runutan nukleotida khas akibat isolasi geografi yang dikenal sebagai populasi lokal (populasi asli). Sampel Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah liar memiliki commen ancestor yang sama dengan B. cucurbitae dari 52 Perancis dan Swiss. Hal tersebut diduga daerah asal Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah liar berasal dari Eropa. Hasil pohon filogenetik menggambarkan B. papayae memiliki common ancestor yang sama dengan koleksi GenBank B.carambola, B. papayae dan B.philipine. Hal ini disebabkan karena clade subgenus Bactrocera ini berasal dari daerah yang sama yaitu Oriental. Sampel Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah yang dikonsumsi memiliki common ancestor yang sama dengan koleksi GenBank Bactrocera calumniata dan B. cucurbitaee yang berasal dari Indonesia. Berdasarkan hal tersebut dapat dianalisis lebih singkat hubungan kekerabatan antara Bactrocera sp dilihat dari keluarga subgenus. Hasil kedekatan hubungan kekerabatan yang digambarkan pada Bactrocera sp (Gambar 12) menjelaskan bahwa subgenus Zeugodacus merupakan parafiletik karena dalam satu kelompok subgenus memiliki common ancestor yang berbeda. Pendapat ini sesuai dengan pendapat Zhang et al. (2010) dan Smith et al. (2003) yang menyebutkan bahwa Zeugodacus merupakan parafiletik, akan tetapi hal ini tidak sesuai dengan Muraji & Nakahara (2001) dan White’s (2000) yang menyebutkan bahwa subgenus Zeugodacus merupakan monfiletik. Berdasarkan analisis pohon filogenetik Subgenus Bactrocera merupakan monofiletik (jika nenek moyang tunggalnya hanya menghasilkan semua spesies turunan dalam takson tersebut dan bukan spesies pada takson lain). Hal ini sesuai dengan pernyataan Zhang et al. (2010) dan Smith et al. (2003), akan tetapi pendapat ini bertentangan dengan pendapat Muraji & Nakahara (2001) yang menyatakan bahwa subgenus Bactrocera merupakan parafiletik. Pohon filogeni ini dibentuk dengan menggunakan metoda Neighbor-joining yang termasuk dalam metoda jarak dengan prinsip pengelompokkan taksa berdasarkan nilai jarak evolusioner pasangan-pasangan operational taxonomy unit dimana setiap percabangan yang terdapat dalam pohon filogeni berevolusi pada kecepatan yang tidak sama (Hartl 2000). Analisis pohon filogentik ini diperjelas dengan hasil pairwise distance calculation. 53 Kedekatan hubungan genetik antara Bactrocera sp (Tabel 9) dianalisis menggunakan Pairwise Distance Calculation yang menggambarkan jarak genetik antar spesies. Hasil Pairwise Distance Calculation cukup dekat berkisar antara 0,0-0,03. Analisis parwise distance digunakan untuk melihat tingkat subtitusi transisi dan tranversi melalui banyaknya perbedaan nukleotida per pasangan. Spesies yang memiliki nilai jarak genetik semakin rendah, maka memiliki hubungan kekerabatan semakin dekat. Sebaliknya spesies yang memiliki jarak genetik tinggi, maka hubungan kekerabatannya semakin jauh (Dharmayanti 2011). Hasil pairwise distance calculation sesuai dengan analisis pohon filogenetik. Nilai jarak genetik paling rendah ditemukan pada Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah liar dengan B. cucurbitae yang berasal dari Swiss yaitu 0.00 dengan nilai Bootstrap 100. Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah liar ini juga memiliki kekerabatan dengan B. cucurbitae yang berasal dari Prancis Eropa. Kedekatan hubungan tersebut dimungkinkan karena nenek moyang yang sama yang berasal dari Benua Eropa. Berdasarkan pairwise distance calculation menjelaskan nilai jarak genetik paling rendah pada B. cucurbitae yang menyerang pare dengan B,cucurbitae yang berasal dari Indonesia yaitu 0.009 dengan nilai Bootstrap 100. Pada B. papayae yang menyerang buah salak ditemukan nilai jarak genetik terendah dengan B. papayae, B.carambola, dan B.philipinensis yang berasal dari daerah Oriental yaitu 0.009 dengan Bootstrap 100. Nilai boostrap menjadi tolak ukur penentu tingkat kepercayaan pohon filogeni (Dharmayanti 2011). Penggunaan metode bootstrap dalam menentukan tingkat kepercayaan pohon didasari pada kenyataan bahwa distribusi karakter dalam data dipengaruhi oleh efek acak (stochastic). Dengan sejumlah replikasi set data yang dihasilkan oleh metode bootstrap, dimungkinkan dilakukan penaksiran tentang seberapa besar efek acak tersebut berpengaruh terhadap pohon, terutama terhadap topologinya. Berdasarkan hal tersebut, nilai persentase hasil replikasi metode bootstrap disebut juga nilai bootstrap dijadikan tolak ukur penentu tingkat 54 kepercayaan pohon. Semakin besar nilai bootstrap, maka semakin tinggi pula tingkat kepercayaan topologi pohon hasil rekonstruksi tersebut (Hillis et al. 1996; Nei & Kumar 2000; Hall 2001). Berdasarkan pairwise distance calculation, Bactrocera sp yang berasal dari daerah yang sama dan yang terletak dalam satu subgenus memiliki jarak genetik yang relative dekat. Kedekatan hubungan beberapa Bactrocera sp tersebut diduga karena adanya perkawinan acak dan aliran gen yang terjadi akibat letak geografis yang berdekatan, sehingga akan mengurangi perbedaan antar subgenus yang telah terakumulasi akibat seleksi alam maupun genetic drift (Smith 2003). Hubungan antara karakter morfologi dengan marker DNA gen sitokrom oksidase I pada Bactrocera sp tidak menunujukkan hasil yang sama. Karakter morfologi pada Bactrocera sp dari buah liar pada Lampiran 1 menunujukakan bahwa Bactrocera sp memiliki karakter morfologi diantara B. calumniata dan B. cucurbitae, tetapi hasil BLAST sekuen gen sitokrom oksidase I menunjukan bahwa Bactrocera sp adalah Bactrocera cucurbitae. Berdasarkan hal tersebut dapat diketahui bahwa karakter morfologi tidak sesuai dengan klasifikasi Bactrocera sp berdasaarkan gen sitokrom oksidase I. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Muraji & Nakahara 2002, Jamnongkluk et al. 2003, Zhang et al. 2010 yang menyatakan bahwa identifikasi karakter morfologi tidak sesuai dengan filogeni molekuler yang menggunakan gen sitokrom oksidase I dan Dolemon et al. 2013 yang gagal membedakan B. occipitalis dengan B. philipinensis menggunakan gen sitokrom oksidase I. Karakter morfologi pada Bactrocera sp yang tidak sesuai dengan data molekuler diduga dapat disebabkan oleh perkawinan silang antara Bactrocera calumniata dengan Bactrocera cucurbitae yang masih terletak dalam satu subgenus yang sama yaitu Zeugodacus. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Dolemon et al (2013) yang mengidentifikasi spesies hasil perkawinan silang antara B. occipitalis dengan B. philipinensis menggunakan gen sitokrom oksidase I. 55 Perbedaan karakter morfologi dengan data molekuler juga dapat disebabkan oleh proses adaptasi yang berlangsung secara terus menerus yang dapat menghilangkan karakter morfologi yang dipengaruhi oleh lingkungan. Hal tersebut didukung oleh data pohon filogeni yang menggambarkan asal usul nenek moyang Bactrocera sp yang berasal dari Swiss dan Perancis. Analisis molekuler pada Bactrocera sp dapat mengungkapkan spesies yang diragukan untuk mengetahui identitas yang jelas sehingga dapat menggambarkan sejarah evolusi dan hubungan evolusi antara keturunan dengan nenek moyangnya. Studi evolusi tentang Bactrocera sp sangatlah penting untuk informasi pengendaliannya. Informasi yang diberikan dalam penelitian ini meliputi analisis sekuen gen sitokrom oksidase I Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah liar yang mempunyai nenek moyang yang sama dengan Bactrocera cucurbitae yang berasal dari Swiss Eropa, sedangkan B. cucurbitae yang menyerang buah pare dan B. papayae yang menyerang buah salak memiliki nenek moyang yang sama dengan Bactrocera yang berasal dari Indonesia maupun Oriental. Penelitian ini juga menginformasikan bahwa identifikasi molekuler menggunakan gen sitokrom oksidase I tidak sesuai dengan identifikasi morfologi. Hasil terbaik dalam menganalisis hubungan karakter morfologi dengan analisis molekuler Bactrocera sp menggunakan kombinasi gen. Hal tersebut sudah dibuktikan oleh Zhang et al. (2010) yang menggunakan gen Cox I dan 16S rDNA dan Muraji & Nakahara (2008) menggunakan Cox I dan Cox II. 64 BAB V PENUTUP A. Simpulan Hasil sekuen gen Cox I pada Bactrocera sp berasal dari inang buah liar yang teridentifikasi sebagai B. cucurbitae berhasil mendapatkan ukuran nukleotida dengan panjang 435 bp. Bactrocera cucurbitae yang teridentifikasi ini memiliki common ancestor yang sama dengan Bactrocera cucurbitae yang berasal dari Swiss Eropa dan memiliki kedekatan hubungan dengan B. cucurbitae yang berasal dari Perancis. Identifikasi molekuler Bactrocera sp menggunakan gen sitokrom oksidase I tidak sesuai dengan klasifikasi Bactrocera sp berdasarkan karakter morfologi. B. Saran Berdasarkan penelitian ini peneliti menyarankan untuk menggunakan kombinasi gen, misalnya Cox I dengan 16S rDNA atau Cox I dengan Cox II dalam membandingkan analisis molekuler dengan analisis morfologi untuk memperoleh hasil terbaik. 56 57 DAFTAR PUSTAKA Ariyanto J, Widoretno S, Nurmiyati, Agustina P. 2010. Studi Biodiversitas Tanaman Pohon di 3 Resort Polisi Hutan (Rph) di Bawah Kesatuan Pemangku Hutan (Kph) Telawa Menggunakan Metode Point Center Quarter (PCQ). (Jurnal on line) [diakses tanggal 5 Maret 2014]. [CABI] Center in Agricultural and Biological Institute. 2007. Crop Protection Compendium (CD-ROM) Wallingford: CAB International 2 CD-ROM dengan penuntun di dalammya. Dale JW & Park SF. 2004. Molecular Genetics of Bacteria. 4th.Ed. John Wiley and Sons Inc.pp: 346 Dharmayanti I. 2011. Filogenetika Molekuler: Metode Taksonomi organisme Berdasarkan Sejarah Evolusi. Wartazoa. 21(1). 1-10. Dhillon MK, Singh R, Naresh JS, Sharma HC. 2005. The melon fruit fly,Bactrocera cucurbitae: a review of its biology and management. J Insect Sci. 5:1–16. Dolemon MLC, Mendioro MS, Diaz MGQ. 2013. Morphometric Analysis and DNA Barcoding of Fruit Flies Bactrocera occipitalis(Bezzi) and B. philippinensis Drew and Hancock (Diptera: Tephritidae) from Cavite and Davao del Norte. Philippine Journal of Science. 142 (1): 69-76. Drew RAI. 1989. The Tropical Fruit Flies (Diptera:Tephritidae: Dacinae) of the Australian and Ocean-ian Regions. Memoirs Queensland Museum. 26:1521. Drew RAI & Hancock DL. 1994. The Bactrocera dorsalis complex of fruit flies (Diptera:Tephritidae: Dacinae) in Asia. Bull.ent. Res. Supplement. 2:68. Drew RAI & Hancock DL. 2000. Phylogeny of the tribe Dacini (Dacinae) based on morphological, distributional, and biological data, pp. 491-504 In M. Aluja and A. L. Norrbom (eds.), Fruit Flies (Tephriti dae) Phylogeny and Evolution of Behavior, CRC Press, New York. Felsenstein J. 1985. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791. Hall BG. 2001. Phylogenetic trees made easy: A how-to manual for molecular biologists. Sinauer Associates, Inc., Sunderland. 58 Handoyo D & Rudiretna A. 2002. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction(PCR). Pusat Studi Bioteknologi. 9(1):17-29 Han J, Thompson LAJ, Reiss A, Mayorov V, Jia H, Biousse V, Newman NJ & Brown MD. 2006. OPA1 mutations and mitochondrial DNA haplotypes in autosomal dominant optic atrophy. Genet Med. 8(4):217-25. Hartl D. 2000. A primer of population genetics. 3rd ed. Sinauer Associates, Inc., Sunderland. Hasyim A, Boy A & Hilman Y. 2010. Respon Hama Lalat Buah Jantan terhadap Beberapa Jenis Atraktan dan Warna Perangkap Di Kebun Petani. J.Hort. 20 (2):164-170. Balai Penelitian Tanaman Sayuran. Hillis DM, Marble & C. Moritz. 1996. Applications Of Molecular Systematics: The State Of The Field And A Look To The Future. In: Hillis, D.M.C. Moritz And B.K. Mable(Eds.). 1996. Molecular systematics. 2nd Ed. Sinauer Associates, Inc., Sunderland. pp. 515-543. Hou WY, Chen X, Wu J, Hu Z, Peng J, Yang Z, Tang C, ZhouY, Li S, Yan Y, Du L, Kong Z, Ren H, Zhang & Shui S. 2006. A Complete Mitochondrial Genome sequence of Asian Black bear Sichuan Sub species (Ursus thibetanus mupinensis). Int. J. Biol. Sci. 3(2):85-90. Jamnongluk W, Baimai V & Kittayapong P. 2003. Molecular Phylogeny of Tephritid Fruit Flies In The Bactrocera tau Complex Using the Mitochondrial Co1 Sequences. Genome.46:112-118. Kemena C. & C. Notredame. 2009. Upcoming Challenges For Multiple Sequence Alignment Methods In The High through put Era. Bioinformatics. 25: 2455 –2465. Lilian, Franca C, Carrilho E & Kist TBL. 2002. A review of DNA sequencing techniques. Quarterly Reviews of Biophysics.35( 2) 169–200. Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika, Edisi Kedua. Bogor: IPB Press. Muraji M & Nakahara S. 2001. Phylogenetic relationships among fruit flies, Bactrocera (Diptera: Tephritidae), based on the mitochondrial rDNA sequences. Insect Mol. Biol. 10: 549-559. 59 Muraji M & Nakahara S. 2002. Discrimination among pest species of Bactrocera (Diptera: Tephritidae) based on PCR-RFLP of the mitochondrial DNA. Applied Entomology and Zoology. 37:437-446. Muraji M & Nakahara S. 2008. Phylogenetic Analyses of Bactrocera Fruit Flies (Diptera: Tephritidae) Based on Nucleotide Sequences of the Mitochondrial COI and COII Genes. Res. Bull. Pl. Prot. 44: 1-12. Murtiana I. 2011.Identifikasi parasitoid lalat buah pada berbagai tanaman holtikultura di kabupaten sleman daerah Yogyakarta [skripsi]: Fakutas Sains dan tekhnologi Universitas Islam Negeri Sunan Kalijaga. Muryati, Hasyim A, Kogel de WJ. 2007. Distribusi spesies lalat buah di Sumatera Barat dan Riau. J. Hort. 17 (1):61-68. NCBI. 2010. http://blast.ncbi.nlm.nih.-gov. [4 februari 2013]. NCBI. 2010.http: nucleotide.ncbi.nlm.nih-gov. [3 September 2014] Nei M & Kumar S. (2000). Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University Press, New York. Peña JE, Sharp JL & Wysoki M. 2002. Tropical Fruit Pests and Pollinators: Biology, Economic Importance, Natural Enemies and Control. CABI Publishing, New York. 430 pp. Pinero JC, Jacome I, Vargas R, Prokopy RJ. 2006. Response of female melon fly, Bactrocera cucurbitae, to host-associated visual and olfactory stimuli. Entomol Exp Appl 12:261–269. Pranowo D, Martono DE, Suputa, Muchalal, Wahyuningsih TD, Afandi MY. 2009. Synthesis of 4-(4-Methoxy-Phenyl)-3-Butene-2-On and the Activity Test as a Fruit Flies Atractant. Indo.J.Chem 2008;8 (2):231-235. Pujiastuti Y. 2009. Perkembangan pradewasa dan lama hidup imago Psyittalia sp (Hymenoptera : Braconidae), Parasitoid larva lalat buah B.dorsalis Hend (Diptera: Tephritidae). JRL.5(3):199-208 Ratnayani KIN. Wirajana & Laksmiwati. 2007. AnalisisVariasi Nukleotida Daerah D-Loop DNA Mitokondria pada Satu Individu Suku Bali Normal. Jurnal Kimia 1(1):7-14. Richter H & Ludwig B. 2003. Cytochromecoxidase – structure, function, and physiology of a redox-driven molecular machine. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 147:47–74. 60 Sabeti P. 2005. DNA: an alternative record of African history. Encarta Reference Library Premium [DVD]. Redmond USA: Microsoft Corporation. Saitou N & Nei M. 1987. The neighbor-joining method: A new method forreconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425. Schmidt H. 2003. Phylogenetic Trees From Large Datasets. InauguralDissertation,DusseldorfUniversity.Http://Www.Bi.Uniduesseldorf.De/~Hsc hmidt/Publ/Schmidt203.phdthesis.pdf.(23 Januari 2011). Sharma H, Singh A, Sharma C, Jain SK & Singh N. 2011. Mutations in the mitochondrial DNA D-loop region are frequent in cervical cancer. Cancer Cell International. 5(34): 1475-2867. Siwi SS, Hidayat P & Suputa. 2006. Taksonomi dan Bioekologi Lalat Buah Penting di Indonesia. BB-Biogen. . Smith PT, Mcpheron BA, & Kambhampati, S. 2002. Phylogenetic analysis of mitochondrial DNA supports the monophyly of Dacini fruit flies (Diptera: Tephritidae). Ann. Ent. Soc. Am. 95(6): 658-664. Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisus. Suputa, Cahyati, Kustaryati A, Railan M, Issusilaningtyas & Taufiq A. 2006. Pedoman Identifikasi Lalat Buah (Diptera: Tephritidae). Yogyakarta : UGM. Suryanto D. 2003. Melihat keanekaragaman organisme melalui beberapa teknikgenetika molekuler. http://library.usu.ac.id/download/fmipa/biologidwis.pdf [30 Des 2013]. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, and Kumar S. 2013. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729. Wandia NI. 2001. Mitochondrial Genome. Jvet 2(4). White I M (2000). Morphological features of the tribe Dacini (Dacinae): Their significance to behavior and classification.Fruit Flies (Tephritidae): Phylogeny and Evolution of Behavior (M. Aluja and A. L. Norrbom, eds.),Crc Press, Boca Raton: pp. 505-546. Wibowo DA. 2009. Restriction Fragment Length Polymorphism (Rflp) Gen Sitokrom B Dna Mitokondria Dari Delapan Spesies Burung. Bandung: IPB. 61 Yuwono T. 2006. Teori Dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta :C.V Andi Offset. Zhang B, Liu YH, Wu WX, Wang Z. 2010. Molecular Phylogeny Of Bactrocera species (Diptera: Tephritidae:Dacini) Inferred From Mitochondrial Sequences Of 16s Rdna and Coi sequences. Florida Entomologist. 93 (3) : 369-377. Zein MSA & Prawiradilaga DM. 2013. DNA Barcode Fauna Indonesia. Jakarta:Kencana prenadamedia group. 62 LAMPIRAN - LAMPIRAN 63 Lampiran 1 Hasil identifikasi morfologi Bactrocera sp yang menyerang buah liar, Bactrocera cucurbitae dari buah pare, Bactrocera papayae dari buah salak dan sebagai pembanding Bactrocera calumniata. Karakter Bactrocera sp* B. cucurbitae B.papaye B. calumniata Torak Abdomen Kepala Sayap Sayap: terdapat pita hitam-coklat membulat pada ujung apeks, pita coklat melintang pada r ±m (sangattipis), dan pita hitam-coklat melintang pada dm-cu (a), Kepala: spot hitam berbentuk oval berukuran besar (b), Toraks: terdapat pita kuning pada sisi lateral dan di tengah skutum (c), Abdomen: pada umumnya berwarna cokelat kemerahan dengan pola ´yang jelas Sayap: terdapat pita hitamcoklat membulat pada ujung apeks, pita coklat melintang pada r ±m (sangattipis), dan pita hitam-coklat melintang pada dm-cu (a), Kepala: spothitam berbentuk oval berukuran besar (b), Toraks: terdapat pita kuning pada sisi lateral dan di tengah skutum (c), Abdomen: pada umumnya berwarna cokelat kemerahan dengan pola yang jelas Ket *: sampel dalam penelitian ini. Sayap: pita hitam tipis pada costasampai bagian apeks Kepala: spot hitam besar berbentuk oval pada muka (b), Toraks: pita kuning di sisi lateral lebar dan paralel (c), Abdomen: abdomen berwarna coklat oranye dengan pola ³7´yang tipis dan jelas (d) Sayap: pita coklat gelap pada garis costa membentuk spotdi apeks sayap dan melintang pada dm-cu (a), Kepala: spothitam berbentuk oval pada muka (b), Toraks: pita kuning pada sisi lateral dan di tengah skutum (c), Abdomen: abdomen dengan pola garis ³7´yang lebar dan jelas, pola hitam berbentuk segi empat pada tergum IV dan juga pada tergum V 64 Lampiran 2 Alat- Bahan yang digunakan untuk penelitian mikropestle Elektroforesis tool Timbangan analitik Tip kuning Buffer Geneaid Waterbath UV Transiluminator Genomic DNA mini 64 kit GD kolom mikropipet Timbangan mikrosentrifuge mikrosentrivuge 65 Lampiran 3 Hasil kromatogram sekuen gen Cox I Bactrocera papayae yang menyerang buah salak pada sekuen forward.. BIO TRACE Model 3730 File: 1st_BASE_1540512_LB_mt_COI_viz__mtD7_2F.ab1 KB.bcp • 6258000-04 6258002-04 1540512_LB_mt_COI_viz__mtD7_2F 6258003-03 6258005-00 Lane 10 BioEdit v ersion 7.1.9 (12/17/2012) N NN Signal G:2889 A:4690 T:4762 C:3155 KB_3730_POP7_BDTv3.mob ?? no 'MTXF' field Points 1897 to 8616 Page 1 of 1 5/23/2014 Spacing: 15.7407207489014 A A A A A A AAT A G AT T T T G AT TAT TAC C T C C T T C CC T T ACA T T A C TA T T A G TA AG A AG TA T A G T A G A A A AC G G AG C TG G TACA G G T TG A A CA G T T TAC C CA C C C C TA T C A T C 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 TG T TA T TG C A C A C G G A G G AG C T TC AG T TG AC C TA G C TA T T T T T TCA C T TC A C T TA G CG GG TA T T T C C T CA A T T T TA G G AG C AG T A A A T T TC A T T A C A A C AG T A A T T A A TA T A C G A T C 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 G A C AG G AA T C AC C T T TG A T C G A A T AC C T T T A T T CG T T TG AG C AG T TG TA T TA AC AG C T T TA T T AC T T T T A T TA T C A T T A C CA G T T T T A G C AG GG G C T A T TA C TA T A T T A C T A A C A G AC C 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 G A A A C T T A A A T AC T T C C T T T T T TG A C C C TG C C GG AG G AG G AG A T C C TA T T C T T T A C C A A C A T T T A T T T T G AT TC T T TG G A C A C C C A G A AG T T TA TA T T T T A T C C T TGG C C T CAAAA 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 66 Lampiran 3 Hasil Kromatogram sekuen gen Cox I Bactrocera papayae yang menyerang buah salak dari sekuen reverse. BIO TRACE Model 3730 File: 1st_BASE_1540512_LB_mt_COI_viz__mtD7_2F.ab1 KB.bcp • 6258000-04 6258002-04 1540512_LB_mt_COI_viz__mtD7_2F 6258003-03 6258005-00 Lane 10 BioEdit v ersion 7.1.9 (12/17/2012) N NN Signal G:2889 A:4690 T:4762 C:3155 KB_3730_POP7_BDTv3.mob ?? no 'MTXF' field Points 1897 to 8616 Page 1 of 1 5/23/2014 Spacing: 15.7407207489014 A A A A A A AAT A G AT T T T G AT TAT TAC C T C C T T C CC T T ACA T T A C TA T T A G TA AG A AG TA T A G T A G A A A AC G G AG C TG G TACA G G T TG A A CA G T T TAC C CA C C C C TA T C A T C 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 TG T TA T TG C A C A C G G A G G AG C T TC AG T TG AC C TA G C TA T T T T T TCA C T TC A C T TA G CG GG TA T T T C C T CA A T T T TA G G AG C AG T A A A T T TC A T T A C A A C AG T A A T T A A TA T A C G A T C 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 G A C AG G AA T C AC C T T TG A T C G A A T AC C T T T A T T CG T T TG AG C AG T TG TA T TA AC AG C T T TA T T AC T T T T A T TA T C A T T A C CA G T T T T A G C AG GG G C T A T TA C TA T A T T A C T A A C A G AC C 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 G A A A C T T A A A T AC T T C C T T T T T TG A C C C TG C C GG AG G AG G AG A T C C TA T T C T T T A C C A A C A T T T A T T T T G AT TC T T TG G A C A C C C A G A AG T T TA TA T T T T A T C C T TGG C C T CAAAA 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 67 Lampiran 5 Hasil kromatogram sekuen gen sitokrom oksidase I Bactrocera cucurbita* yang menyerang buah yang dikonsumsi pada sekuen forward. Model 3730 File: 1st_BASE_1540514_CU_mt_COI_viz__mtD7_2F.ab1 KB.bcp • 6258000-04 6258002-04 1540514_CU_mt_COI_viz__mtD7_2F 6258003-03 6258005-00 Lane 6 BIO TRACE BioEdit v ersion 7.1.9 (12/17/2012) C NN NN AA Signal G:2087 A:2981 T:3232 C:2167 KB_3730_POP7_BDTv3.mob ?? no 'MTXF' field Points 1911 to 8688 Page 1 of 1 5/23/2014 Spacing: 15.8291778564453 A A AA T A G ATT T T G AT TAT T AC C T C C C T C T C T TACA T T A C T T T T A G T G AG C A G T A T A G T A G A A A AC G G AG C TG G T A C AG G T TG A A C TG T T T AC C C T C C C C T T T CA T C 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 A A T T A T C G C T CA T G G TG G AG C C T C AG T TG A T T T A G C TA T T T T T T C T C T A C A T T TAG C TG G T A T T T C A T C AA T T T T A G G G G C T G T A A A T T T C A T T A C T A C AG T A A T T A A T A T A C G A T 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 C A A C A G G A A T T AC A T T TG A C CG A A T AC C T T T A T T C G T T TG AG C T G T AG T A T T A AC AG C T C T T C T T T T AC T T C T A T C T C T C C CA G TA T T AG C T G G AG C T A T T A C T A T A C T T T T AA C A G A C 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 C G A A A C T T A A A T A C A T C T T T C T T CG A C C C A G C T G G T G G T G G AG A T C C T A T T T T A T A C C A A C A C T T A T T T T G A T T C T T T G G A C A C C C AG A A G T T T A T A T T T T AT C C T T GC C C T C A 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 68 Lampiran 5 Hasil kromatogram sekuen gen sitokrom oksidase I Bactrocera cucurbita* pada sekuen Reverse BIO TRACE Model 3730 File: 1st_BASE_1540515_CU_mt_D9__2R.ab1 KB.bcp À 6258000-04 6258002-04 1540515_CU_mt_D9__2R 6258003-03 6258005-00 Lane 4 BioEdit v ersion 7.1.9 (12/17/2012) N NGN G Signal G:3032 A:3835 T:3340 C:2063 KB_3730_POP7_BDTv3.mob ?? no 'MTXF' field Points 1915 to 8676 Page 1 of 2 5/23/2014 Spacing: 15.7586460113525 CC A A A T C A AA T AA G T G T T G G T AT A AA AT A G G A T C T C CA C CA C CA G C T G G G T C G A AG A A AG A T G T A T T T A A G T T T C G G T C T G T T A A A A G T A T A G T A A T A G C T C C A 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 G C T A A T A C TG G G AG AG A T AG A A G T A A A AG A AG AG C T G T T A A T A C T A C A G C T C A A A C G A A T A A A G G T A T T C G G T CA A A T G T A A T T C C TG T TG A T C G T A T A T T A A T T A C T G T AG T A A T 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 G A A A T T T AC AG C C C C T A A A A T TG A T G A A A T AC C A G C T A A A TG T A G AG A AA A A A T AG C T A A A T CA A C T G AG G C T C C AC C A T G AG C G A T A A T T G A T G A A A G G G G AG G G T A A AC AG T T C A A C 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 69 Lampiran 6 Hasil kromatogram sekuen gen sitokrom oksidase I Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah liar pada sekuen forward. BIO TRACE Model 3730 File: 1st_BASE_1540516_CL_mt_COI_viz__mtD7_2F.ab1 KB.bcp • 6258000-04 6258002-04 1540516_CL_mt_COI_viz__mtD7_2F 6258003-03 6258005-00 Lane 2 BioEdit v ersion 7.1.9 (12/17/2012) CC N NN Signal G:2561 A:2907 T:3296 C:2300 KB_3730_POP7_BDTv3.mob ?? no 'MTXF' field Points 1951 to 8816 Page 1 of 1 5/23/2014 Spacing: 16.1234741210938 A G A A A AA T A G AT T T T G AT TAT TA C C T C C C T C T C T T ACA T T A C T T T T AG T G AG C A G T A T A G T A G A A A A C G G AG C TG G T AC A G G T TG AA C T G T T TA T C C T C C C C T T T CA T 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 CA A T T A T C G C T C A TG G TG G AG C C T C A G T TG A T T TA G C TA T T T T T T C T C TA C A T T T A G C TG G T A T T T C A T C A A T T T T AG G G G C CG T A A A T T T C A T T A C T A C AG T A A T T A A T A T G C G A 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 T C A A C AG G A A T C A C A T T TG A C C G G A T A C C T T T A T T CG T T TG AG C TG T AG T A T T G A CA G C T C T T C T T T T A C T T C T A T C T C T A C C T G T G T T A G C C G G AG C T A T T A C T A T A C T T T T A A C AG A C 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 C G A AA T T T A A A C A C C T C T T T C T T CG A C C C G G C T G G T G G T G G AG A C C C T A T T T T A T A C C A A C A T T T A T T T TG A T T C T T T G G A C A C C C AG A A G T T T A T A T T T AAT CC T T G C C T CA AA 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 70 Lampiran 6 Hasil kromatogram sekuen gen sitokrom oksidase I Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah liar pada sekuen Reverse. BIO TRACE Model 3730 File: 1st_BASE_1540517_CL_mt_D9__2R.ab1 KB.bcp À 6258000-04 6258002-04 1540517_CL_mt_D9__2R 6258003-03 6258005-00 Lane 31 BioEdit v ersion 7.1.9 (12/17/2012) N Signal G:3528 A:3701 T:3191 C:2150 KB_3730_POP7_BDTv3.mob ?? no 'MTXF' field Points 1890 to 8608 Page 1 of 2 5/23/2014 Spacing: 15.7029905319214 G G G T CC AA G A T CA A A T AA A T G T T G G T AT A A A A T A G G G T C T C CAC CA C CA G C C G G G T C G AAG A AA G AG G T G T T TA A A T T T C G G T C T G T T A A A AG T A T A G T A A T A G C T C C G G 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 C T A A C A C A G G T AG AG A T A G A A G T A A A A G A A G AG C T G T C A A T A C T A CA G C T C A A A C G A A T A A AG G T A T C C G G T C A A A TG T G A T T C C T G T TG A T C G C A T A T T A A T T A C T G T AG T A A TG 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 A A A T T T A C G G C C C C T A AA A T T G AT G A A A T A C C A G C T A A A T G T A G AG A A A A A A T A G C T A A A T C A A C T G AG G C T C C A C C A T G AG C G A T A A T TG A T G A A AG G G G AG G A T A A A C AG T T C AA C 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 71 Lampiran 7 Hasil consensus sekuen gen sitokrom oksidase I Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah liar (CL), Bactrocera cucurbitae yang menyerang buah pare (CU) dan Bactrocera papayae yang menyerang buah salak (LB). >Consensus CL GAATGAATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCCTCTCTTACATTACTTTTAGTGA GCAGTATAGTAGAAAACGGAGCTGGTACAGGTTGAACTGTTTATCCTCCCCTTTCAT CAATTATCGCTCATGGTGGAGCCTCAGTTGATTTAGCTATTTTTTCTCTACATTTAG CTGGTATTTCATCAATTTTAGGGGCCGTAAATTTCATTACTACAGTAATTAATATGC GATCAACAGGAATCACATTTGACCGGATACCTTTATTCGTTTGAGCTGTAGTATTGA CAGCTCTTCTTTTACTTCTATCTCTACCTGTGTTAGCCGGAGCTATTACTATACTTT TAACAGACCGAAATTTAAACACCTCTTTCTTCGACCCGGCTGGTGGTGGAGACCCTA TTTTATACCAACATTTATTTTGATTCTTTGGACACC. >Consensus CU AATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCCTCTCTTACATTACTTTTAGTGAGCAGT ATAGTAGAAAACGGAGCTGGTACAGGTTGAACTGTTTACCCTCCCCTTTCATCAATT ATCGCTCATGGTGGAGCCTCAGTTGATTTAGCTATTTTTTCTCTACATTTAGCTGGT ATTTCATCAATTTTAGGGGCTGTAAATTTCATTACTACAGTAATTAATATACGATCA ACAGGAATTACATTTGACCGAATACCTTTATTCGTTTGAGCTGTAGTATTAACAGCT CTTCTTTTACTTCTATCTCTCCCAGTATTAGCTGGAGCTATTACTATACTTTTAACA GACCGAAACTTAAATACATCTTTCTTCGACCCAGCTGGTGGTGGAGATCCTATTTTA TACCAACACTTATTTTGATTCTTTGGAC >Consensus LB AATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCTTCCCTTACATTACTATTAGTAAGAAGT ATAGTAGAAAACGGAGCTGGTACAGGTTGAACAGTTTACCCACCCCTATCATCTGTT ATTGCACACGGAGGAGCTTCAGTTGACCTAGCTATTTTTTCACTTCACTTAGCGGGT ATTTCCTCAATTTTAGGAGCAGTAAATTTCATTACAACAGTAATTAATATACGATCG ACAGGAATCACCTTTGATCGAATACCTTTATTCGTTTGAGCAGTTGTATTAACAGCT TTATTACTTTTATTATCATTACCAGTTTTAGCAGGGGCTATTACTATATTACTAACA GACCGAAACTTAAATACTTCCTTTTTTGACCCTGCCGGAGGAGGAGATCCTATTCTT TACCAACATTTATTTTGATTCTTTGGAC 64 72 50 51 50 64 51 50 50 50 50 50 50 27 24
![penilaian-kelas1 [Compatibility Mode]](http://s1.studylibid.com/store/data/000572399_1-5ed00a3bdfe45dc334cb2994193529a0-300x300.png)
