i VIABILITAS MIKROORGANISME LOKAL DALAM RAGI
advertisement
VIABILITAS MIKROORGANISME LOKAL DALAM RAGI KAKAO Skripsi Diajukan Untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Derajat Sarjana (S-1) Oleh : KHOLIFATH F1D1 12 006 JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HALU OLEO KENDARI 2016 i ii iii iv KATA PENGANTAR Puji dan syukur Kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkat rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian yang berjudul: Viabilitas Mikroorganisme Lokal dalam Ragi Kakao. Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari berbagai pihak baik bimbingan, nasehat, arahan, serta doa maka penulisan skripsi ini tidak dapat terselesaikan dengan baik. Penghargaan yang sangat tinggi dan ucapan terima kasih yang sangat tulus penulis sampaikan kepada Dr. Nur Arfa Yanti, S.Si., M.Si selaku pembimbing I dan Dr. Jamili, M.Si selaku pembimbing II atas bimbingan, arahan dan petunjuk yang sangat berharga dalam penulisan hasil penelitian ini. Ucapan terima kasih yang tiada tara untuk kedua orang tua penulis, Ayahanda tercinta La Horofu dan Ibunda tersayang Lijah yang telah menjadi orang tua terhebat sejagad raya, yang selalu memberikan motivasi, nasehat, cinta, perhatian dan kasih sayang serta doa yang tentu takkan pernah bisa penulis balas. Kepada adik-adikku tersayang Khayrun Uqban, Syabaniah Haq, Albaiddah, Nur Hilma dan Almakhrajan. Terima kasih banyak telah menjadi motivator yang luar biasa sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Pada kesempatan ini, penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan kepada : 1. Rektor Universitas Halu Oleo (UHO) Kendari. 2. Dekan F-MIPA Universitas Halu Oleo (UHO). v 3. Ketua Jurusan Biologi dan Sekretaris Jurusan Biologi F-MIPA Universitas Halu Oleo (UHO). 4. Kepala Laboratorium Biologi F-MIPA Universitas Halu Oleo (UHO). 5. Dr. Amirullah, S.Si, M.Si selaku penasehat akademik yang telah memberikan nasihat, pengarahan dan bimbingan dalam memprogramkan mata kuliah. 6. Dr. Nurhayani H. M., S.Si, M.Si, Dr. Muzuni, M.Si, dan Dra. Sri Ambardini, M.Si selaku dewan penguji. 7. Bapak dan Ibu Dosen Jurusan Biologi serta seluruh staf lingkungan F-MIPA UHO. 8. Laboran Jurusan Biologi F-MIPA UHO. 9. Kawan penelitian tercinta dan tersayang Desty Triyaswati, S.Si, Emi Nurfiani, Kasmawati Dehe, S.Si, Laode Muh. Iman Sulaiman, Muhamad Azwar Syah, S.Si, Efis Amalia, Nur Isnaini Ulfa, Andi Nurhana dan Nuning atas keceriaan, bantuan dan motivasinya. 10. Kakak senior di Laboratorium Mikrobiologi: Taufik Walhidayah, S.Si., Mawardi Janitra. S.Si, Miftahuddin, S.Si, Siti Nurhidayah, Nur Asni, S.Si, Zaenab Mola, Baharudin, Jendri Mamangkey, S.Si, Christyani Dian Winarti Budadana, S.Si, Yurnal, S.Si, Titin Pratiwi Rivai, S.Si, Sugireng, S.Si, Jumiati, S.Si, Irawati, S.Si, Hasanah, S.Si, Artarini Oktavianti, S.Si, Ridwan, S.Si dan Rahmatan Juhaepa, S.Si yang telah banyak membantu penulis selama penelitian. 11. Teman-teman Biologi angkatan 2012 : Ni Komang Lilik, Dafit Pratama, S.Si, Desi Afdaliana, Wa Ode Sadawati, Rosminah, S.Si, M. Rajab Sutra Mijaya, vi Hermawan, Sahar, Rudi Harto, Hironimus Elander N., I Wayan Rustanto, Siti Feni Musdalifah, S.Si Andi Hildayani, S.Si, Siti Surahmi, S.Si, Ulfa Muliani, Irmayanti Arif, S.Si dan semua yang tidak bisa disebutkan satu persatu yang telah banyak membantu dan menghibur penulis selama penelitian. 12. Adik Junior di Lab. Mikrobiologi : Nur Rayani, Endang Sriwahyuni, Wandy Murty P., Mulki Muh. Adam, Ade Putra Riski T., Isma Arya Ningsih, Febrianti Safitri, Kartika Dwi Cahyati, Haidin, M. Fitrah, Wa Ode Leni Marlina, Marwansyah, Arin Suciarti, Sri Handayani P, Irwansyah, Jamaludin, M. Munir, Putri Rabiah, Hestin yang selalu memberikan keceriaan, bantuan dan semangatnya. 13. Kakak-kakak senior angkatan 2011, 2010 dan junior angkatan 2013, 2014 yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah memberikan motivasinya. 14. Kakak-kakak Asisten di Biologi : La Ode Abdul Fajar Hasidu, S.Si., Abdul Hafiz, S.Si., Irjum Budiatman, S.Si., Izal, S.Si, Waode Desi, S.Si., Sulastri, S.Si., Waode Rafiud D., S.Si dan semua yang tidak bisa disebutkan satu persatu yang telah memberikan dorongan moril serta kebersamaan yang tidak terlupakan. Selanjutnya penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis menerima segala saran yang sifatnya membangun demi penyempurnaannya. Penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkan. Akhir kata penulis mengucapkan terima kasih atas segala vii dukungan serta bimbingannya semoga Tuhan Yang Maha Esa selalu menyertai dan membalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu. Aamiin. Kendari, April 2016 Penulis viii DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ ii DAFTAR RIWAYAT HIDUP ...................................................................... iii SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT .............................................. iv KATA PENGANTAR .................................................................................... v DAFTAR ISI ................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ......................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xiii DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN ..................................... xiv ABSTRAK ...................................................................................................... xv ABSTRACT .................................................................................................... xvi I. PENDAHULUAN ................................................................................... 1 A. B. C. D. Latar Belakang ................................................................................... Rumusan Masalah .............................................................................. Tujuan Penelitian ............................................................................... Manfaat Penelitian ............................................................................. 1 4 4 4 II. TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 6 A. Ragi .................................................................................................... 6 B. Viabilitas Mikroorganisme ................................................................ 7 C. Pertumbuhan Mikroorganisme........................................................... 9 D. Bakteri Asam Laktat .......................................................................... 10 E. Bakteri Asam Asetat .......................................................................... 12 F. Khamir ............................................................................................... 13 G. Perhitungan Mikroba ......................................................................... 15 H. Hipotesis Penelitian ........................................................................... 17 III. METODE PENELITIAN ....................................................................... 18 A. B. C. D. E. F. G. H. I. Waktu dan Tempat ............................................................................. 18 Jenis Penelitian................................................................................... 18 Bahan Penelitian ................................................................................ 18 Alat Penelitian .................................................................................... 19 Variabel Penelitian ............................................................................. 21 Defenisi Operasional .......................................................................... 21 Indikator Penelitian............................................................................22 Desain Penelitian................................................ ..........................23 Prosedur Penelitian............................................................................ 23 ix J. Analisis Data ...................................................................................... 33 K. Bagan Alur Penelitian ........................................................................ 33 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 34 A. Kadar Air Ragi Kakao .......................................................................... 34 B. pH Ragi Kakao ..................................................................................... 36 C. Viabilitas Bakteri Asam Laktat pada Penyimpanan Suhu 50C dan Suhu 280C 37 D. Viabilitas Bakteri Asam Asetat pada Penyimpanan Suhu 50C dan Suhu 280C 41 E. Viabilitas Khamir pada Penyimpanan Suhu 50C dan Suhu 280C 45 F. Perbandingan Viabilitas Mikroba dalam Ragi Kakao pada Penyimpanan Suhu 280C dan 50C 50 IV. PENUTUP ................................................................................................ 54 A. Simpulan ............................................................................................ 54 B. Saran .................................................................................................. 54 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 55 LAMPIRAN .................................................................................................... 60 x DAFTAR TABEL Nomor Teks Halaman 1 Bahan penelitian dan fungsinya 18 2 Alat penelitian dan fungsinya 19 3 Desain Penelitian 23 4 Kadar air ragi kakao selama penyimpanan (%) 34 5 pH ragi kakao selama penyimpanan 36 6 Log jumlah sel BAL dalam ragi kakao pada penyimpanan suhu 280C dan suhu 50C dengan waktu penyimpanan 0-60 hari 37 7 Log jumlah sel BAA dalam ragi kakao pada penyimpanan suhu 280C dan suhu 50C dengan waktu penyimpanan 0-60 hari 42 8 Log jumlah sel khamir dalam ragi kakao pada penyimpanan suhu 280C dan suhu 50C dengan waktu penyimpanan 0-60 hari 46 xi DAFTAR GAMBAR Nomor Teks Halaman 1 Skema fermentasi kakao 15 2 Bagan Alur Sistematika Penelitian 33 3 Grafik log jumlah sel bakteri asam laktat dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C dan 50C 38 4 Histogram persentase viabilitas bakteri asam laktat dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C dan 50C 39 5 Grafik log jumlah sel bakteri asam asetat dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C dan 50C 42 6 Histogram persentase viabilitas bakteri asam asetat dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C dan 50C 43 7 Grafik log jumlah sel khamir dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C dan 50C 46 8 Histogram persentase viabilitas khamir dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C dan 50C 47 9 Histogram viabilitas mikroba dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C 51 10 Histogram viabilitas mikroba dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 50C 52 xii DAFTAR LAMPIRAN Nomor Teks Halaman 1 Dokumentasi Penelitian 60 2 Jumlah Mikroba pada starter (CFU/mL) 66 3 Jumlah mikroba sebelum pengeringan (CFU/g) 66 4 pH ragi kakao selama penyimpanan 67 5 Kadar air ragi kakao selama penyimpanan 67 6 Jumlah koloni bakteri asam selama penyimpanan (CFU/g) laktat (BAL) 69 7 Jumlah koloni bakteri asam selama penyimpanan (CFU/g) asetat (BAL) 70 8 Jumlah koloni khamir selama penyimpanan (CFU/g) 71 9 Viabilitas mikroba selama penyimpanan (%) 72 xiii DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN Lambang/singkatan % mL µL Atm CFU aw G H2O H2O2 K2HPO4 KH2PO4 NB PDB MRSA PDA pH TYGKCC BTB CaCO3 rpm 0C TPC Ha SNI BAL BAA log UV R K Arti dan keterangan Persen Mililiter Mikroliter Atmosfer Colony forming unit Activity of water Gram Air Hidrogen peroksida Kalium hidrogen phospat Kalium dihidrogen phospat Nutrient broth Potato Dextrosa Broth De Mann Ragosa Sharpe Agar Potato Dextrosa Agar Potensial hidrogen Triptone, Yeast Extract, Glukosa, K2HPO4, CaCO3 Brom Timol Blue Calsium Carbonat Rotation Per Minute Derajad Celcius Total Plate Count Hektar Standar Nasional Indonesia Bakteri Asam Laktat Bakteri Asam Asetat Logaritma Ultraviolet Suhu Ruang Suhu Kulkas xiv VIABILITAS MIKROORGANISME LOKAL DALAM RAGI KAKAO Oleh: KHOLIFATH F1D1 12 006 ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui viabilitas mikroorganisme lokal dalam ragi kakao pada suhu dan lama penyimpanan serta mengetahui suhu penyimpanan yang paling baik dalam mempertahankan viabilitas mikroorganisme. Penelitian ini adalah penelitian eksperimental. Ragi kakao dibuat dengan bahan pengisi berupa campuran tepung beras dan tepung terigu dengan perbandingan 1:1. Starter mikrobia yang telah diketahui jumlahnya, dikombinasikan dengan perbandingan bakteri asam laktat (BAL) : bakteri asam asetat (BAA) : khamir (1 : 2 : 1). Ragi kakao diinkubasi selama satu malam dan dikeringkan hingga kadar airnya ±10% selanjutnya disimpan pada suhu 280C dan 50C. Sampel diambil pada hari ke 0, 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 untuk uji viabilitas dengan metode Standard Plate Count. Hasil penelitian menunjukkan bahwa viabilitas BAL, BAA dan khamir pada suhu penyimpanan 280C berkisar antara 56,2% hingga 61,57% pada 60 hari penyimpanan. Penyimpanan pada suhu 50C menunjukkan bahwa viabilitas BAL, BAA dan khamir masih bertahan hingga 91,88% sampai 98,24% selama 60 hari penyimpanan. Kata Kunci : Ragi Kakao, Mikroorganisme Lokal, Viabilitas, Suhu dan Lama Penyimpanan xv VIABILITY OF LOCAL MICROORGANISM IN COCOA “RAGI” By: KHOLIFATH F1D1 12 006 ABSTRACT This study was aimed to obtain the effect of temperature and storage time to viability of local microorganism in cocoa “ragi”, and the best storage temperature kept viabilty of microorganism. This study was an experimental research. Cocoa “ragi” was made by compisition consists of rice powder and wheat flour with a ratio of 1:1. Microbial starter already been known its amount, combined with a ratio of between lactic acid bacteria (LAB) : acetid acid bacteria (AAB) : yeast (1:2:1). Cocoa “ragi” was incubated during one night and was dried until water content ±10%. Cocoa “ragi” was preserved at 280C and 50C. Samples were collected at day 0, 10, 20, 30, 40, 50 and 60 for viability assay with Standard Plate Count method. The results showed that viability of LAB, AAB and yeast persentation were 56,2% until 61,57% for 60 days. The storage time 5OC showed that viability of LAB, AAB, AAB and yeast persentation were 91,88% until 98,24% for 60 days. Keywords : “Ragi” cocoa, local microorganism, viability, temperature and storage time xvi I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Kakao merupakan komoditas unggulan perkebunan di Indonesia karena perannya cukup penting bagi perekonomian. Produksi kakao Indonesia pada tahun 2015 mencapai 701.229 ton dengan luas areal 1.704.982 Ha. Produksi kakao Sulawesi Tenggara sebesar sepertiga dari total nilai ekonomi kakao di Indonesia dan merupakan produsen kakao terbesar kedua di Indonesia setelah Sulawesi Tengah dengan total produksi sebesar 117.035 ton (Anonim, 2015). Peningkatan permintaan dunia akan makanan berbahan baku kakao semakin meningkat dari tahun ke tahun. Berdasarkan data statistik, Indonesia memiliki peluang untuk menjadi produsen kakao dunia. Namun, lemahnya pengawasan mutu menyebabkan kualitas kakao yang diekspor oleh Indonesia masih tergolong rendah (Anonim, 2014). Fermentasi kakao merupakan proses pengolahan kakao yang dapat menentukan mutu kakao yang bertujuan untuk membentuk aroma dan cita rasa khas pada kakao serta mengurangi rasa pahit dan sepat pada biji kakao (Widyotomo dan Mulato, 2008). Fermentasi kakao umumnya berlangsung secara alami oleh mikroba indigenous dalam kakao (Hernani dan Haliza, 2013). Fermentasi kakao yang selama ini dilakukan oleh petani kakao Indonesia, khususnya di Sulawesi Tenggara berlangsung sangat sederhana dengan sarana dan metode yang beragam. Sebagian besar petani kakao di Sulawesi Tenggara melakukan proses fermentasi selama 1-3 hari di dalam karung plastik dan pembalikkan dilakukan setiap hari. Hal tersebut bukan 1 2 merupakan fermentasi dalam arti yang sesungguhnya dan tidak memberikan pengaruh dalam perbaikan mutu dan kurang memenuhi Standar Nasional Indonesia (SNI) kakao. Salah satu upaya untuk meningkatkan mutu kakao adalah dengan penambahan inokulum mikroba pada fermentasi (Kustyawati dan Setyani, 2008). Namun, penambahan inokulum mikroba untuk fermentasi kakao dianggap masih kurang praktis karena dibutuhkan lagi penyiapan starter serta kondisi yang aseptis. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu teknologi untuk menyediakan inokulum mikroba yang praktis diaplikasikan di lapangan. Inokulum mikroba dalam bentuk ragi dianggap sebagai metode praktis dalam fermentasi kakao. Yanti, dkk. (2014), dan Jamili, et al. (2014), telah memperoleh mikrobia lokal dari biji kakao yang difermentasi secara alami oleh petani kakao di Sulawesi Tenggara dengan aktivitas yang telah teruji dalam fermentasi kakao. Inokulum mikrobia ini telah dipersiapkan dalam bentuk ragi kakao untuk dimanfaatkan sebagai starter pada fermentasi kakao (Yanti, dkk., 2014). Ragi kakao merupakan salah satu inokulum atau starter yang digunakan dalam fermentasi biji kakao dengan memanfaatkan mikroba lokal yang berupa kultur campuran antara bakteri asam laktat (BAL), bakteri asam asetat (BAA) dan khamir (Yanti, dkk., 2014). Namun, ketahanan dan viabilitas mikroorganisme lokal dalam ragi kakao selama penyimpanan belum diketahui pasti. Viabilitas mikroba dalam ragi kakao menentukan efektivitas kerja mikroba dalam fermentasi kakao. Jumlah dan jenis mikroorganisme yang 3 terdapat dalam ragi akan menentukan hasil akhir fermentasi, seperti rasa, tekstur, flavor dan aroma. Mikroba sebagai inokulum harus dijaga viabilitasnya agar tetap potensial digunakan dalam pengolahan pangan berbasis fermentasi. Partanto dan Dahlan (1991), menyatakan bahwa viabilitas merupakan kemampuan hidup suatu mikroorganisme yang dapat ditunjukkan dengan jumlah koloni mikroba yang tumbuh dalam media pertumbuhan selama periode waktu tertentu. Mikroba ragi umumnya memerlukan sumber karbon, nitrogen, mineral, dan vitamin (Bamforth, 2005). Kombinasi nutrien ini diformulasikan dalam media fermentasi untuk mendukung pertumbuhan dan viabilitas sel mikroba. Kusumaningtyas, dkk. (2005) melaporkan bahwa viabilitas inokulum dalam tepung beras secara umum dipengaruhi oleh suhu dan waktu penyimpanan. Hampir semua inokulum pada suhu 4oC memiliki kecenderungan viabilitas yang lebih tinggi dari pada penyimpanan pada suhu 28oC hingga dua bulan. Oleh karena itu, ketahanan dan viabilitas mikroba pada ragi sebagai inokulum dalam proses fermentasi biji kakao menjadi penting untuk diuji lebih lanjut. Berdasarkan hal tersebut, maka perlu adanya penelitian mengenai Viabilitas Mikroorganisme Lokal pada Ragi Kakao, sehingga dapat diketahui suhu dan waktu penyimpanan ragi yang masih baik untuk diaplikasikan. 4 B. Rumusan Masalah Rumusan masalah dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Bagaimana viabilitas mikroorganisme dalam ragi kakao pada suhu 280C selama penyimpanan ? 2. Bagimana viabilitas mikroorganisme dalam ragi kakao pada suhu 50C selama penyimpanan ? 3. Suhu penyimpanan berapa yang paling baik dalam mempertahankan viabilitas mikroorganisme ? C. Tujuan Penelitian Tujuan yang ingin dicapai dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Untuk mengetahui viabilitas mikroorganisme dalam ragi kakao pada suhu 280C selama penyimpanan. 2. Untuk mengetahui viabilitas mikroorganisme dalam ragi kakao pada suhu 50C selama penyimpanan. 3. Untuk mengetahui suhu penyimpanan yang paling baik dalam mempertahankan viabilitas mikroorganisme. D. Manfaat Penelitian Manfaat yang diperoleh dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Sebagai sumber informasi mengenai waktu simpan ragi kakao pada suhu dan lama penyimpanan terhadap mikroorganisme dalam ragi kakao. ketahanan dan viabilitas 5 2. Sebagai acuan bagi penelitian selanjutnya, khususnya yang meneliti masalah-masalah yang relevan dengan penelitian ini sekaligus pengaplikasiannya dalam olahan kakao fermentasi dengan menggunakan ragi dari penelitian ini. II. TINJAUAN PUSTAKA A. Ragi Ragi merupakan inokulum atau starter yang digunakan dalam pembuatan berbagai produk pangan berbasis fermentasi seperti tape, tempe, roti, arak dan brem. Ragi dibuat dari tepung beras yang dicampur dengan air untuk membentuk suatu adonan. Adonan ini kemudian didiamkan dalam suhu kamar selama 3 hari dalam keadaan terbuka, sehingga ditumbuhi bakteri, khamir dan kapang secara spontan (Winarno, 1984; Hidayat dkk., 2006). Mikroba yang terkandung dalam ragi umumnya berupa kultur campuran (mixed culture) yang terdiri dari kapang, khamir, dan bakteri yang masing-masing bergabung dan bekerja sama sebagai starter dalam proses fermentasi. Setiap ragi memiliki kemampuan yang berbeda dalam memfermentasi bahan. Nama ragi juga disesuaikan dengan kemampuannya dalam memfermentasi bahan, misalnya ragi tempe (memfermentasi kedelai menjadi tempe), ragi tape (memfermentasi singkong atau ketan menjadi tape) dan ragi roti (memfermentasi terigu menjadi roti) (Suprapti, 2005). Beberapa spesies khamir dan kapang telah diidentifikasi dalam ragi. Dwidjoseputro (1978), berhasil mengidentifikasi dua spesies khamir pada ragi tape yaitu Candida lactosa dan Pichia malanga. Selain itu, kapang Chlamydomucor oryzae, lima spesies dari genus Mucor dan satu spesies dari genus Rhizopus, serta khamir Pichia burtonii dan Endomycopsis fibuliger telah berhasil diidentifikasi dari ragi tape. Penelitian-penelitian terbaru mengungkapkan spesies-spesies lain yang terdapat dalam ragi tape meliputi 6 7 khamir Candida utilis dan Saccharomyces cerevisieae, serta bakteri Pediococcus sp. dan Bacillus sp. (Gandjar, dkk., 2006; Kusnadi, dkk., 2009). Ragi roti hanya mengandung satu jenis mikroba saja yaitu dari golongan khamir Saccharomyces cerevisieae (Pelczar dan Chan, 1986). Kasmidjo (2008) melaporkan bahwa mikroorganisme yang terdapat dalam ragi tempe adalah berupa kapang dari genus Rhizopus, diantaranya Rhizopus oryzae, Rhizopus oligosporus, dan Rhizopus stolonifer. B. Viabilitas Mikroorganisme Partanto dan Dahlan (1991) menyatakan bahwa viabilitas merupakan kemampuan hidup suatu makhluk hidup (mikroorganisme) yang dapat ditunjukkan dengan jumlah sel yang tumbuh dalam media. Viabilitas inokulum umumnya dipengaruhi oleh beberapa faktor lingkungan diantaranya nutrisi, aw (activity of water), suhu, kelembaban, pH dan waktu. 1. Nutrisi Mikroorganisme seperti halnya makhluk hidup lain juga membutuhkan suplai makanan (nutrisi) yang menjadi sumber energi dan menyediakan unsur-unsur kimia dasar untuk pertumbuhan sel. Unsurunsur dasar tersebut adalah karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, magnesium, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya (Gan dan Sherrington, 1992). 2. Activity of Water (aw) Semua mikroorganisme membutuhkan air untuk kehidupannya. Air berperan dalam reaksi metabolik dalam sel dan merupakan alat 8 pengangkut zat-zat gizi ke dalam dan keluar sel (Gan dan Sherrington, 1992). Mikroba seperti khamir dan BAL memiliki toleransi aw yang berbeda. Khamir masih dapat tumbuh pada aw minimum 0,80 sedangkan BAL pada aw minimum 0,90 (Winarno, 1984). 3. Suhu Suhu adalah salah satu faktor lingkungan paling penting yang mempengaruhi kehidupan dan pertumbuhan mikroorganisme. Apabila suhu meningkat, kecepatan metabolisme meningkat, pertumbuhan dipercepat dan sebaliknya. Kusumaningtyas (2005) melaporkan bahwa hampir semua inokulum (Saccharomyces cerevisieae dan Rhizopus oligosporus) pada suhu 4oC memiliki kecenderungan viabilitas yang lebih tinggi dari pada penyimpanan pada suhu 28oC sampai umur dua bulan. 4. Waktu Waktu mempengaruhi viabilitas mikroorganisme dalam media pertumbuhan. Semakin lama waktu inkubasi, maka viabilitas mikroba yang ditunjukan dengan jumlah sel hidup dalam media akan semakin menurun. Hal ini disebabkan oleh ketersediaan nutrisi dalam media yang semakin berkurang (Kusumaningtyas, dkk., 2005). Wulandari (2005), melaporkan bahwa bakteri yang diinokulasikan ke dalam media kombinasi senyawa humik, mollase, dan zeolit mempunyai viabilitas sampai 40 hari dengan populasi sebesar 6.1010 CFU/mL. 9 C. Pertumbuhan Mikroorganisme Istilah pertumbuhan umum digunakan untuk bakteri dan mikroorganisme yang biasanya mengacu pada perubahan atau pertambahan total massa sel, bukan perubahan individu organisme. Suatu inokulum hampir selalu mengandung ribuan organisme. Pertumbuhan menyatakan pertambahan jumlah dan atau massa sel yang ada di dalam inokulum asalnya (Pelczar dan Chan, 1986). Fase pertumbuhan sel dapat dibagi menjadi beberapa tahap yaitu fase lag (pertubuhan sama dengan nol), fase log (pertumbuhan cepat mengikuti kurva eksponensial), fase stasioner (kecepatan pertumbuhan tetap) dan fase kematian (pertumbuhan semakin lambat dan sebagian sel mati) (Lee, 1992). Fase lag yaitu setelah mikroorganisme beradaptasi dengan keadaan yang baru kemudian sel-sel mikroorganisme akan tumbuh membelah diri. Fase log, mikroorganisme bertambah dengan cepat sekali (apabila bahan makanan cukup dan lingkungan hidup yang optimum). Fase pertumbuhan melambat, pertumbuhan mikroorganisme mulai menurun karena persediaan makanan mulai menurun atau karena adanya racun dari hasil metabolisme itu sendiri. Fase pertumbuhan tetap, yaitu jumlah mikroorganisme seimbang dengan yang mati. Berikutnya fase menurun atau fase kematian dimana sel berada dalam periode pertumbuhan tetap akhirnya akan mati bila tidak dipindahkan dalam media segar lainnya (Syarief, dkk., 2003). Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme antara lain meliputi faktor intrinsik dan faktor ekstrinsik. Faktor intrinsik 10 meliputi pH, aktivitas air (activity of water, (aw)), kemampuan mengoksidasireduksi, kandungan nutrien, bahan antimikroba, dan struktur bahan makanan. Faktor ekstrinsik yang mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme adalah suhu penyimpanan, kelembaban, tekanan gas (O2), cahaya dan pengaruh sinar ultraviolet (Fardiaz,1989). D. Bakteri Asam Laktat (BAL) Bakteri asam laktat (BAL) dikelompokkan sebagai bakteri Gram positif, bentuk kokus (coccus) atau batang (bacil) yang tidak berspora. BAL terdiri dari empat genus yaitu Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus dan Pediococcus (Malaka dan Laga, 2005). BAL mempunyai peranan esensial hampir dalam semua proses fermentasi makanan dan minuman. Asam laktat yang dihasilkan dapat menyebabkan penurunan pH lingkungan. pH rendah dapat menghambat kontaminasi mikroba pembusuk dan mikroba patogen (Suriawiria, 1983). Bakteri asam laktat (BAL) merupakan salah satu organisme yang memfermentasi bahan pangan melalui fermentasi karbohidrat dan umumnya menghasilkan sejumlah besar asam laktat. Bakteri ini memberikan kontribusi yang cukup besar terhadap perbaikan flavour, tekstur, dan masa simpan produk fermentasi. BAL mempunyai distribusi yang luas dan kemampuan tumbuh pada berbagai substrat organik dan kondisi seperti kondisi asam, basa, suhu rendah, suhu tinggi, kadar garam tinggi, anaerob, sehingga menjadikan bakteri asam laktat sebagai kompetitor yang tangguh di semua sektor pengolahan pangan (Daulay, 1991). 11 Bakteri asam laktat telah digunakan secara luas sebagai kultur starter berbagai ragam fermentasi daging, susu, sayuran dalam skala industri. Namun, bakteri ini kemudian mampu menghasilkan efek pengawetan pada produk yang dihasilkan, sehingga penerapan bakteri ini dalam industri semakin berkembang dengan tujuan untuk pengawetan pangan. Bakteri ini mampu menghasilkan efek pengawetan karena menghasilkan senyawa yang mampu menghambat pertumbuhan berbagai mikroba. Sebagian besar efek antimikroba ini disebabkan oleh pembentukan asam laktat dan asam asetat serta penurunan pH yang dihasilkan (Kusumawati, 2000). BAL juga memiliki peranan dalam fermentasi kakao. Peranan BAL dalam fermentasi kakao terutama membantu proses perombakan gula dalam pulp menjadi asam laktat sehingga terbentuk komponen flavor (citarasa) dan warna pada kakao fermentasi (Rodriguez, et al., 2011). Bakteri asam laktat dalam fermentasi kakao diantaranya adalah Lactobacillus cellobiosus yang tumbuh baik pada suhu 45–470C, Lactobacillus plantarum yang tumbuh baik pada suhu 40–450C dan Lactobacillus hilgardii yang tumbuh baik pada suhu 400C (Ardhana and Fleet, 2003). Lactobacillus fermentum, Leuconostoc pseudomesenteroides, dan Enterococcus casseliflavus merupakan bakteri asam laktat yang diisolasi dari fermentasi kakao Ghanaian (Camu, et al., 2007). Enterococcus sp., Enterococcus faecium, Lactobacillus mali, Weissella cibaria, Weissella ghanaensis, Enterococcus columbae, Weissella sp., Lactococcus lactis, Lactobacillus brevis, Leuconostoc durionis, Leuconostoc mesenteroides, 12 Weissella confuse, Weissella paramesenteroides, Weissella kimchii merupakan bakteri asam laktat yang diisolasi dari kakao Ghanaian dengan jumlah yang sedikit. Ardhana and Fleet (2003), mengungkapkan bahwa jenis bakteri asam laktat Lactobacillus cellobiosus dominan sampai 48 jam dalam fermentasi kakao dalam 24 jam pertama. E. Bakteri Asam Asetat (BAA) Beberapa mikroorganisme berperan aktif selama proses fermentasi, terutama proses pemecahan gula menjadi alkohol dan pengubahan alkohol menjadi asam asetat. Asam asetat merupakan senyawa organik yang mengandung gugus asam karboksilat. Proses pemecahan alkohol menjadi asam asetat dipengaruhi oleh beberapa aktivitas bakteri asam asetat. Bakteri asam asetat berperan mengoksidasi alkohol dan gula serta menurunkan pH pada keping biji kakao selama proses fermentasi kakao (Jojima, et al., 2004). Bakteri asam asetat dalam fermentasi kakao memiliki peranan dalam menghambat pertumbuhan kecambah pada biji kakao. Hal ini disebabkan oleh asam asetat dan panas yang dihasilkan sehingga terjadi perubahan enzimatis pada biji kakao (Iriyani, 2005; Atmawinata, dkk., 1998). Acetobacter pasteurianus merupakan golongan bakteri asam asetat yang paling lama bertahan hidup dibanding Acetobacter aceti yang aktif pada waktu 24 jam pertama fermentasi (Ardhana and Fleet, 2003). Bakteri asam asetat dalam proses fermentasi kakao aktif pada waktu 24 jam sebelum fermentasi selesai. Jumlah yang dapat tumbuh tergantung pada iklim dan pengudaraan selama fermentasi. Keberadaan bakteri asam asetat 13 dalam fermentasi menyebabkan alkohol dapat diubah menjadi asam asetat, air dan panas. Konsentrasi asam asetat optimum dapat dicapai setelah fermentasi berlangsung sekitar 37 jam (Siregar, 1984). Bakteri asam asetat pada fermentasi kakao berperan dalam menghasilkan aroma dan flavour pada coklat. BAA akan mengoksidasi etanol yang diproduksi oleh khamir menjadi asam asetat yang berperan pada keasaman. BAA akan memetabolisme gula dan asam-asam organik untuk menghasilkan berbagai produk aldehid dan produk lainnya yang dapat mempengaruhi kualitas biji kakao (Haryadi dan Supriyanto, 2012). Jumiati (2014), telah berhasil mengisolasi BAA dari biji kakao terfermentasi. Hasil karakterisasi dan identifikasi menunjukkan bahwa BAA yang berperan pada biji kakao fermentasi adalah dari genus Gluconobacter, spesies Acetobacter peroxydans serta Acetobacter acetii. Penambahan isolat BAA lokal selama fermentasi biji kakao dapat meningkatkan kualitas biji kakao dengan parameter fisik dan kimia biji Kakao berdasarkan SNI. F. Khamir Khamir adalah organisme uniseluler yang bereproduksi secara aseksual dengan spora. Khamir mempunyai peran penting dalam industri pangan dengan memproduksi enzim yang membantu terjadinya reaksi kimia seperti pembentukan alkohol sebagai metabolit primer maupun senyawa antibakteri sebagai metabolit sekunder. Khamir akan memecah glukosa menjadi alkohol dan karbondioksida pada proses fermentasi anaerob. Sebagian besar khamir memerlukan oksigen untuk pertumbuhannya. Selain 14 oksigen, substrat yang utama dari khamir adalah gula. Khamir pada umumnya toleran terhadap asam dan dapat tumbuh pada pH 4,0-4,5, dengan suhu pertumbuhan 00C-500C, dengan suhu optimum 200C- 300C (Rahman dkk., 1992). Pertumbuhan khamir selain dipengaruhi oleh suhu, oksigen dan temperatur juga dipengaruhi oleh konsentrasi komponen-komponen penyusun media pertumbuhan. Suplai karbon merupakan sumber yang paling berpengaruh pada pertumbuhan optimum. Penyusun medium harus mencakup semua unsur yang diperlukan untuk suplai energi. Kebanyakan khamir memiliki batas aktivitas air terendah untuk pertumbuhannya yang berkisar antara 0,88-0,94. Banyak khamir bersifat osmofilik, yaitu dapat tumbuh pada medium dengan aktivitas air realatif rendah, yaitu 0,62-0,65 (Fardiaz, 1992). Khamir ditemukan secara luas dalam fermentasi berbagai jenis pangan. Salah satunya adalah berperan dalam fermentasi kakao. Schwan, et al. (1998) menemukan lebih dari 50 spesies mikroba yang tumbuh selama fermentasi kakao. Tetapi tidak semua mikroba tersebut mempunyai peran penting dalam fermentasi kakao. Saccharomyces cerevisieae dan Candida tropicalis merupakan yeast dominan selama fermentasi kakao karena tingkat survival yang tinggi 107 CFU/g selama 36 jam (Ardhana and Fleet, 2003). Jamili, et al., (2014), telah memperoleh khamir lokal dari biji kakao yang difermentasi secara alami oleh petani kakao di Sulawesi. Khamir lokal tersebut serupa dengan Candida tropicalis. C. tropicalis KLK4 terutama berperan dalam fermentasi biji kakao. Penambahan C. tropicalis KLK4 15 selama fermentasi biji kakao dapat meningkatkan persentase mutu biji kakao hingga 83 % dan kadar lemak dari 44,63% menjadi 51,24%. Fermentasi kakao melibatkan beberapa mikroorganisme seperti bakteri asam laktat, bakteri asam asetat dan khamir. Tahapan pertama dalam fermentasi kakao adalah perombakan gula pulp menjadi etanol dan asam laktat, kemudian diikuti pembentukan asam asetat dari etanol. Khamir mendominasi fermentasi pada awal fermentasi, kemudian menurun dan digantikan oleh pertumbuhan bakteri asam laktat. Selanjutnya, pada saat pulp mulai mencair oksigen mengalir dalam kotak fermentasi, akibatnya bakteri asam asetat mendominasi fermentasi. Selama pertumbuhan ini suhu meningkat sekitar 500C, sehingga terjadi difusi asam dan panas ke dalam biji. Siklus fermentasi pada biji kakao seperti disajikan pada Gambar 1. Gambar 1. Skema fermentasi pada biji kakao (Chong et al., 1978) G. Perhitungan Mikroba Pertumbuhan mikroba dapat ditentukan secara kuantitatif dengan metode langsung maupun tidak langsung. Pengukuran pertumbuhan secara langsung dapat dilakukan dengan bermacam-macam cara, misalnya dengan 16 menghitung jumlah sel menggunakan Petroff Hausser Bacteria atau hemasitometer atau dengan mengukur kepekaan turbiditasnya dengan menggunakan spektrofotometer. Pertumbuhan dapat pula ditentukan secara tidak langsung, misalnya dengan penuangan (plating) pada medium padat (Yuwono, 2008). Metode hitungan cawan menggunakan anggapan bahwa setiap sel akan hidup berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul menjadi indeks bagi jumlah oganisme yang terkandung di dalam sampel. Teknik pengitungan ini membutuhkan faktor pengenceran dan suspensi sampel ke dalam media. Cawan-cawan tersebut kemudian diinkubasi dan kemudian dihitung jumlah koloni yang terbentuk. Cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni, sesuai dengan kaidah statistik adalah cawan yang berisi 30-300 koloni. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel dihitung dengan cara mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan (Faisal, 2002). Perhitungan SPC didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut, digunakan istilah Coloni Forming Unit 17 (CFU) per mL. Koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah mikroorganismenya (Waluyo, 2004). Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung yaitu satu koloni dihitung 1 koloni. Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni. Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni. Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni. Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidak dihitung. Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni (Waluyo, 2004). G. Hipotesis Penelitian Hipotesis dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : a. Penyimpanan pada Suhu Ruang 1. Ho : µ = 0 : tidak ada pengaruh lama penyimpanan dan suhu penyimpanan 280C terhadap viabilitas mikroorganisme lokal dalam ragi kakao. 2. Ho : µ ≠ 0 : ada pengaruh lama penyimpanan dan suhu penyimpanan 280C terhadap viabilitas mikroorganisme lokal dalam ragi kakao. b. Penyimpanan pada Suhu Kulkas 1. Ho : µ = 0 : tidak ada pengaruh lama penyimpanan dan suhu penyimpanan 50C terhadap viabilitas mikroorganisme lokal dalam ragi kakao. 2. Ho : µ ≠ 0 : ada pengaruh lama penyimpanan dan suhu penyimpanan 50C terhadap viabilitas mikroorganisme lokal dalam ragi kakao. III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember sampai bulan Maret tahun 2016 di Laboratorium Unit Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Halu Oleo, Kendari, Sulawesi Tenggara. B. Jenis Penelitian Penelitian ini bersifat eksperimental. Penelitian dilakukan dengan perlakuan perbedaan suhu dan variasi lama penyimpanan untuk menguji viabilitas mikroorganisme lokal (BAL, BAA dan khamir) dalam ragi kakao. C. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini tercantum pada Tabel 1. Tabel 1. Bahan penelitian dan fungsinya No Bahan Satuan Fungsi 1 2 3 4 1 Isolat BAL, BAA Sebagai sumber isolat untuk dan khamir pembuatan ragi kakao 2 Aquades mL Sebagai pelarut 3 Media NB (Nutrient mL Sebagai media cair pertumbuhan Broth) bakteri BAL dan BAA 4 Kapas Sebagai penyumbat tabung reaksi dan erlenmeyer 5 Alkohol 70% mL Sebagai desinfektan 6 Media PDA (Potato mL Sebagai media padat untuk Dextrosa Agar) pertumbuhan khamir 7 Media PDB (Potato mL Sebagai media cair untuk Dextrosa Broth) pertumbuhan khamir 8 Media CAAR g Sebagai media padat pertumbuhan BAA 18 19 Tabel 1. (Lanjutan) 1 2 9 Media MRSA (De Mann Ragosa Sharpe Agar) 10. Media TYGKCC 11. Glukosa 3 g 4 Sebagai media padat pertumbuhan BAL g g Sebagai media starter ragi Sebagai bahan untuk membuat media CAAR dan TYGKCC Sebagai bahan untuk membuat media CAAR dan TYGKCC Sebagai bahan untuk membuat media TYGKCC Sebagai bahan untuk membuat media CAAR dan TYGKCC Sebagai bahan untuk membuat media padat Sebagai bahan untuk pembuatan media TYGKCC Sebagai bahan untuk membuat media TYGKCC Sebagai bahan untuk membuat media CAAR Sebagai bahan untuk membuat media CAAR Untuk menutup mulut Erlenmeyer Untuk membungkus kapas Sebagai bahan pengisi ragi kakao Sebagai bahan pengisi ragi kakao 12. CaCO3 g 13. Extract pulp mL 14 Extract yeast g 15. Agar g 16. Tryptone g 17. K2HPO4 g 18. BTB g 19. Etanol 96 % 20 21 22. 23. Aluminium foil Kain kasa Tepung beras Tepung terigu mL g g D. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini tercantum pada Tabel 2. Tabel 2. Alat penelitian dan fungsinya No Alat Satuan 1 2 3 Laminar air flow 1 2 3 4 Hot plate Inkubator Autoklaf - 5 Timbangan analitik g Fungsi 4 Tempat bekerja dalam keadaan steril Untuk memanaskan media Tempat menginkubasi bakteri uji Untuk mensterilkan alat dan media Untuk menimbang media dan sampel 20 Tabel 2. (Lanjutan) 1 2 6 Stirrer magnetic 7 Jarum inokulasi 3 - 8 Cawan petri - 9 Tabung reaksi - 10 Pipet volume mL 11 Kulkas 12 Beaker glass 13 14 15 Lampu Bunsen Botol ampul dan botol gelap Shaker 16 Gelas ukur mL 17 Mikroskop - 18 Oven 0 19 20 21 0 22 23 Inkubator Lumpang dan alu Mikro pipet dan Blue tip Spatula Hemasitometer 24 Colony counter 25 26 Rak tabung reaksi Wadah plastik 27. Sentrifuga rpm 28. Erlenmeyer mL mL - C C mL Sel/ mL - 4 Untuk menghomogenkan larutan Untuk menginokulasi biakan mikroorganisme Sebagai wadah pengujian viabilitas BAL, BAA dan khamir Wadah peremajaan BAL, BAA dan khamir Mengambil cairan dalam volume tertentu Tempat menginkubasi isolat yang akan diuji viabilitasnya pada ragi Sebagai wadah untuk mencampur bahan dan media Untuk fiksasi jarum ose Untuk pengenceran Untuk menginkubasi inokulum BAL, BAA dan khamir serta starter ragi kakao Sebagai wadah untuk mengukur volume larutan Untuk mempermudah perhitungan jumlah sel mikroba Untuk pengukuran kadar air ragi kakao Untuk menginkubasi biakan mikroba Untuk menghaluskan ragi kakao Membantu mengambil cairan dalam jumlah 1 mL Untuk mengambil sampel dan media Untuk menghitung jumlah sel mikroba Untuk menghitung jumlah koloni mikroba Untuk meletakkan tabung reaksi Wadah inkubasi ragi yang telah diinokulasikan dengan inokulum mikroba Untuk memisahkan pelet dan supernatan mikroba Untuk menumbuhkan inokulum serta wadah media dan starter ragi 21 Tabel 2. (Lanjutan) 1 2 29. Falcon 30. 3 mL Kamera - 4 Sebagai wadah inokulum pada sentrifuga Untuk mengambil gambar penelitian E. Variabel penelitian Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah: a. Variabel bebas : Suhu penyimpanan (suhu 280C dan suhu 50C) serta variasi lama penyimpanan ragi kakao dalam 0, 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 hari. b. Variabel terikat : Jumlah sel hidup mikroorganisme lokal (BAL, BAA dan khamir) dalam ragi kakao. F. Definisi Operasional Definisi operasional dimaksudkan untuk menghindari kesalahpahaman dalam penafsiran variabel-variabel dalam penelitian ini yaitu, sebagai berikut: 1. Ragi kakao merupakan inokulum atau starter yang digunakan dalam fermentasi biji kakao dengan memanfaatkan mikroorganisme lokal yang diisolasi dari biji kakao yang difermentasi oleh petani kakao di Sulawesi Tenggara dengan bahan pengisi berupa tepung beras dan tepung terigu. 2. Viabilitas merupakan jumlah sel hidup mikroorganisme lokal (BAL, BAA dan khamir) pada ragi kakao yang disimpan pada suhu berbeda selama penyimpanan. 22 3. Mikroorganisme lokal adalah kelompok mikroorganisme (BAL, BAA dan khamir) yang diisolasi dari kakao terfermentasi di Sulawesi Tenggara yang berperan dalam fermentasi kakao. 4. Isolat BAL KSL 2 (Lactobacillus sp.) merupakan isolat unggul dalam fermentasi kakao yang diperoleh dari hasil penelitian Miftahudin (2015) yang diisolasi dari kakao terfermentasi dan diinokulasikan dalam ragi kakao untuk diuji viabilitasnya. 5. Isolat BAA KSL 1 (Acetobacter sp.) merupakan isolat unggul dalam fermentasi kakao yang diperoleh dari hasil penelitian Jumiati (2014) yang diisolasi dari kakao terfermentasi dan diinokulasikan dalam ragi kakao untuk diuji viabilitasnya. 6. Isolat khamir KLK 4 (Candida tropicalis) merupakan isolat unggul dalam fermentasi kakao yang diperoleh dari hasil penelitian Sugireng (2014); Yanti, dkk. (2014) dan Jamili, et al. (2014) yang diisolasi dari kakao terfermentasi dan diinokulasikan dalam ragi kakao untuk diuji viabilitasnya. 7. Perhitungan jumlah sel hidup merupakan metode perhitungan jumlah sel hidup dari masing-masing isolat BAL, BAA dan khamir dalam ragi kakao sesuai suhu dan lama penyimpanan menggunakan metode plate count. G. Indikator Penelitian Indikator yang digunakan dalam penelitian ini adalah jumlah sel hidup dari bakteri asam laktat (BAL), bakteri asam asetat (BAA) dan khamir yang 23 diinokulasikan dalam ragi kakao dengan variasi suhu dan lama penyimpanan yang dihitung dengan metode plate count. H. Desain Penelitian Desain penelitian yang digunakan dalam penelitian ini tercantum pada Tabel 3. Tabel 3. Desain Penelitian Waktu Ulangan Suhu H0 H1 H2 K1 H0K1 H1K1 H2K1 0 K2 H0K2 H1K2 H2K2 5C K3 H0K3 H1K3 H2K3 R1 H0R1 H1R1 H2R1 0 R2 H0R2 H1R2 H2R2 28 C R3 H0R3 H1R3 H2R3 Keterangan : H0K1 = Hari ke-0 suhu 50C ulangan 1 H0K2 = Hari ke-0 suhu 50C ulangan 2 H0K3 = Hari ke-0 suhu 50C ulangan 3 H0R1 = Hari ke-0 suhu 280C ulangan 1 H0R2 = Hari ke-0 suhu 280C ulangan 2 H0R3 = Hari ke-0 suhu 280C ulangan 3 Hari H3 H3K1 H3K2 H3K3 H3R1 H3R2 H3R3 H4 H4K1 H4K2 H4K3 H4R1 H4R2 H4R3 H5 H5K1 H5K2 H5K3 H5R1 H5R2 H5R3 H6 H6K1 H6K2 H6K3 H6R1 H6R2 H6R3 I. Prosedur Penelitian Prosedur kerja yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut. 1. Penyiapan alat dan pembuatan media Media yang digunakan sebagai berikut: a. Media PDA (Potato Dextrosa Agar) Media yang digunakan untuk peremajaan dan perhitungan jumlah koloni khamir adalah PDA (Potato Dextro Agar). Komposisi media 24 PDA yaitu 500 gram ekstrak kentang, 20 gram glukosa, 15 gram agar dalam 1000 mL aquades (Atlas, 2004). Media PDA yang digunakan dalam penelitian ini adalah media PDA sintetis dengan komposisi 5,3 gram PDB, 4 gram agar yang dilarutkan dalam 200 mL aquades kemudian dipanasakan serta dihomogenkan pada hot plate menggunakan magnetic stirer. b. Media MRSA (De Mann Ragosa Sharpe Agar) Media yang digunakan untuk peremajaan dan perhitungan jumlah koloni BAL adalah MRSA (De Mann Ragosa Sharpe Agar). Komposisi media MRSA yaitu 18,5 gram glukosa, 13,5 gram agar, 10 gram pancreatic digest of gelatin, 8 gram beef extract, 4 gram yeast extract, 3 gram sodium asetat, 2 gram K2HPO4, 2 gram amonium sitrat, 1 gram polysorbate 80, 0,2 gram MgSO4.7H2O, 0,05 gram MnSO4.4H2O dalam 1000 mL aquades (Atlas, 2004). Media MRSA yang digunakan adalah media MRSA sintetis dengan komposisi 10,44 gram MRS dan 3 gram agar yang dilarutkan dalam 200 mL aquades kemudian dipanasakan serta dihomogenkan pada hot plate menggunakan magnetic stirer. c. Media CAAR Media yang digunakan untuk peremajaan dan perhitungan jumlah koloni BAA adalah CAAR. Komposisi media ini adalah 0,36 gram glukosa, 1,2 gram CaCO3, 1,2 gram Yeast Extract, 0,0048 gram BTB, 2,1 mL etanol 96 % dan 2,4 gram agar dalam 120 mL aquades (Atlas, 25 2004) kemudian dipanasakan serta dihomogenkan pada hot plate menggunakan magnetic stirer. d. Media NB (Nutrient Broth) Media yang digunakan untuk pembuatan starter BAL dan BAA adalah NB. Komposisi media NB yaitu 5 gram pepton, 3 gram ekstrak daging dalam 1000 mL aquades (Atlas, 2004). Media NB yang digunakan adalah media NB sintetis dengan komposisi 1,2 gram NB yang dilarutkan dalam 150 mL aquades, kemudian dipanaskan pada hot plate dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirer. e. Media PDB (Potato Dextrosa Broth) Media yang digunakan untuk pembuatan starter khamir adalah media PDB. Komposisi media PDB adalah 20 gram kentang, 2 gram dextrosa, dan 100 mL aquades (Atlas, 2004). Media PDB yang digunakan adalah media PDB sintetis dengan komposisi 1,2 gram PDB yang dilarutkan dalam 50 mL, kemudian dipanaskan pada hot plate dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirer. f. Media TYGKCC (Triptone, Yeast Extract, Glukosa, K2HPO4, CaCO3) Media untuk starter ragi adalah media TYGKCC. Komposisi media TYGKCC: (triptone 0,5%, ekstrak yeast 0,5 %, glukosa 0,1%, K2HPO4 0,1%, CaCO3 0,1%, Pulp kakao 2%) yang dilarutkan dalam 26 500 mL akuades, kemudian dipanaskan pada hot plate dan dihomogenkan menggunakan magnetic stirer. 2. Sterilisasi alat dan media Peralatan dan bahan yang digunakan pada penelitian, terlebih dahulu disterilkan dengan metode sterilisasi basah. Sterilisasi dengan pemijaran digunakan untuk sterilisasi ose. Sterilisasi alat menggunakan autoklaf bertekanan 1 atm 1210C, selama 30 menit. Alat-alat yang disterilkan umumnya terbuat dari gelas. Sterilisasi media menggunakan autoklaf bertekanan 1 atm 1210C, selama 15 menit (Lay, 1994; Waluyo, 2004; Hauser, 2006). 3. Pembuatan Starter Ragi 3.1.Pemurnian isolat BAL, BAA dan khamir Isolat BAL, BAA dan khamir yang diperoleh dari penelitian sebelumnya dimurnikan pada masing-masing media spesifiknya. Kemurnian kultur ditentukan melalui metode pengecatan Gram, pengamatan bentuk sel, dan uji motlitas (Lay, 1994). 3.2.Peremajaan isolat BAL, BAA dan khamir Isolat BAL (KSL 2), BAA (KSL 1) dan khamir (KLK 4) diremajakan dengan menginokulasikan 1 ose kultur murni BAL (KSL 2) ke dalam media MRSA miring, 1 ose kultur murni BAA (KSL 1) ke dalam media CAAR miring dan 1 ose kultur murni khamir (KLK 4) ke dalam media PDA miring. Metode yang digunakan untuk 27 inokulasi adalah metode gores (streak plate). Stok biakan BAL dan khamir diinkubasi pada inkubator dengan suhu 370C yang merupakan suhu optimum pertumbuhan BAL dan khamir sedangkan stok isolat biakan murni BAA diinkubasi pada inkubator dengan suhu 320C yang merupakan suhu optimum pertumbuhan BAA selama 24-48 jam (Holt, et al., 1994). 3.2. Perbanyakan isolat BAL, BAA dan khamir pada Media Cair Isolat biakan murni BAL yang telah diremajakan sebelumnya diinokulasikan ke dalam 50 mL media NB dan isolat BAA diinokulasikan ke dalam 100 mL media NB pada erlenmeyer. Sedangkan isolat biakan murni khamir yang telah diremajakan sebelumnya diinokulasikan ke dalam 50 mL media PDB pada erlenmeyer, lalu masing-masing stok dilakukan propagasi pada shaker selama 24 jam. 3.3. Perhitungan jumlah sel BAL, BAA dan khamir Jumlah sel BAL, BAA dan khamir terlebih dahulu dihitung untuk mengetahui jumlah sel BAL, BAA dan khamir yang akan diinokulasikan ke dalam strater ragi. Sel BAL, BAA dan khamir yang akan diinokulasikan antara 106-108 sel/mL. Perhitungan sel BAL, BAA dan khamir dihitung menggunakan metode hitungan mikroskopik langsung menggunakan haemacytometer. Sebanyak 1 mL suspensi dimasukkan ke dalam haemacytometer, kemudian perhitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran 400 28 kali. Menurut Joetono, dkk (1973) perhitungan jumlah sel dilakukan berdasarkan rumus berikut: Jumlah sel = n x 4x106 x faktor pengencer (sel/mL) Keterangan : n= 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑘𝑜𝑡𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑒𝑟𝑝𝑖𝑙𝑖ℎ 5𝑥16 3.4. Penyiapan Starter Ragi Starter ragi berupa gabungan dari 3 jenis mikroba, yaitu BAL, BAA dan khamir dengan perbandingan 1:2:1 (Yanti, dkk., 2014). Isolat yang telah diremajakan dan dihitung jumlah selnya, selanjutnya diinokulasikan ke dalam media starter ragi. Jumlah sel sebanyak 106 sel/mL BAL, BAA dan khamir. Isolat yang sudah diinkubasi dan dihitung jumlah selnya, kemudian di sentrifugasi 3000 rpm selama 15 menit. Kemudian pelet masing-masing mikroba dimasukkan ke dalam 500 mL media TYGKCC dan diinkubasi pada shaker selama 48 jam. Setelah 48 jam, kemudian dilakukan perhitungan jumlah sel yang tumbuh pada media starter ragi dengan metode plate count (Joetono, dkk., 1973). Starter yang berisi diinokulasikan ke dalam media ragi. inokulum campuran siap 29 4. Pembuatan Ragi Kakao 4.1. Persiapan Media Ragi Ragi dibuat dengan cara mencampur tepung beras dan tepung terigu dengan perbandingan 1:1 dan ditambahkan starter ragi. Kompoisi media yaitu tepung beras 250 gram, tepung terigu 250 gram dan 500 mL starter yang telah dibuat sebelumnya. Tepung terigu dan tepung beras terlebih dahulu dipasteurisasi selama 15 menit untuk menghilangkan mikroba yang tidak diinginkan keberadaannya (Yanti, dkk., 2014). 4.2. Inokulasi Starter pada Media Ragi Starter ragi yang berisi kultur campuran BAL, BAA dan khamir dan telah dihitung jumlah selnya diinokulasikan ke dalam media ragi. Penginokulasian starter dilakukan dengan memberikan sedikit demi sedikit starter ke dalam campuran tepung beras dan tepung terigu (Yanti, dkk., 2014). 4.3. Pembuatan Adonan Ragi Adonan ragi yang terdiri dari tepung beras, tepung terigu dan telah diinokulasikan dengan starter ragi diaduk secara merata dan membuat adonan ragi berbentuk bulat. Adonan yang sudah dibuat diinkubasi selama satu malam pada suhu ruangan. Sebelum pengeringan, dilakukan perhitungan jumlah sel pada ragi kakao dengan metode plate count untuk mengetahui jumlah sel mikroba 30 yang terperangkap dalam adonan ragi kakao. Selain itu, dilakukan pula pengukuran pH dan pengukuran kadar air ragi kakao. Setelah diinkubasi, adonan ragi dikeringkan di bawah sinar matahari hingga kadar airnya ±10 % (Rukmi, dkk., 2007). Prosedur kerja yang dilakukan untuk pengukuran kadar air ragi kakao yaitu menimbang ragi kakao setelah pengeringan untuk mendapatkan berat awal ragi kakao, kemudian memasukkan ke dalam oven dengan suhu 1050C, selama 24 jam (Spreutels, et al., 2013). Setelah 24 jam mengeluarkan ragi kakao dari oven, kemudian menimbang kembali ragi kakao untuk mendapatkan berat akhir dengan menggunakan timbangan analitik. Persentase kadar air ragi kakao dihitung menggunakan metode gravimetri (AOAC, 2005) dengan rumus : 𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 % kadar air = 𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑋 100% Berat bobot = Berat awal-Berat akhir 4.4. Penyimpanan Ragi Kakao Adonan yang telah kering merupakan ragi yang siap untuk digunakan dalam fermentasi kakao. Ragi kemudian disimpan dalam wadah plastik dan diletakkan pada 50C dan suhu 280C selama 60 hari. Sampel diambil pada hari ke 0, 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 untuk uji viabilitas dengan metode Total Plate Count (TPC) (Kusumaningtyas, dkk., 2005). 31 5. Perhitungan Viabilitas BAL, BAA dan Khamir Perhitungan viabilitas mikroba dilakukan setelah sampel disimpan dalam variasi suhu sesuai waktu perlakuan dengan indikator pengamatan kemampuan hidup bakteri (viabilitas) melalui cara perhitungan jumlah koloni BAL, BAA dan khamir yang tumbuh dalam media pertumbuhan masing-masing isolat. Ragi dihaluskan dengan cara digerus dalam lumpang dengan kondisi aseptis kemudian dilakukan perlakuan pengenceran sebanyak 10 gram dalam 90 mL akuades yang merupakan pengenceran 10-1. Pengenceran pertama dibuat dengan menggunakan akuades steril sebanyak 90 mL dan dilakukan suspensi pada sampel dengan vortex kemudian dari pengenceran tersebut dipipet sebanyak 1 mL menggunakan mikropipet dengan blue tip lalu dimasukkan ke dalam botol ampul pertama yang berisi 9 mL akuades untuk mendapatkan pengenceran 10-2, setelah disuspensi selanjutnya dipipet sebanyak 1 mL untuk pengenceran 10-3 pada botol ampul kedua, hal ini terus berulang hingga pengenceran 10-6. Sampel pengenceran diambil dari tiga seri pengenceran terakhir yaitu, 10-4, 10-5, dan 10-6. Selanjutnya sebanyak 1 mL suspensi 10-4, 10-5, dan 10-6 dimasukkan ke dalam cawan petri dan menuangkan media MRSA untuk BAL, media CAAR untuk BAA dan media PDA untuk khamir dengan menggunakan metode tuang (pour plate). Setelah itu, sampel dihomogenkan dengan cara memutar cawan petri di atas meja dengan gerakan seperti angka delapan. 32 Setelah agar memadat, cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 370C untuk BAL dan khamir serta inkubasi pada suhu 320C untuk BAA dengan posisi terbalik selama 24-48 jam (Lay,1994). Setelah diinkubasi, dilakukan perhitungan jumlah koloni masing-masing isolat yang tumbuh pada media dengan menggunakan colony counter. Selanjutnya data hasil perhitungan dihitung dengan rumus Total Plate Count (TPC) (Joetono, dkk., 1975). 1 TPC = Jumlah koloni X 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 Faktor pengenceran = volume x jumlah yang ditumbuhkan Viablitas BAL, BAA dan khamir ditentukan dengan membandingkan jumlah sel setelah penyimpanan dan jumlah sel sebelum penyimpanan (Lian, et al., 2002; Rizqiati, dkk., 2005). 𝐿𝑜𝑔 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑠𝑒𝑠𝑢𝑑𝑎ℎ 𝑝𝑒𝑛𝑦𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑎𝑛 Viablitas (%) = 𝐿𝑜𝑔 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑝𝑒𝑛𝑦𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑎𝑛 X 100% J. Analisis Data Penelitian ini adalah penelitian eksperimental. Data yang diperoleh dari masing-masing perlakuan dianalisis secara deskriptif menggunakan microsoft office excel. Analisis deskriptif untuk menjelaskan karakteristik variabel penelitian secara khusus (Sugyono, 2009). 33 K. Bagan Alur Sistematika Penelitian Secara singkat, skema tahapan kegiatan pada penelitian ini ditunjukkan pada gambar 1. Preparasi Alat, Bahan dan Pembuatan Media Pembuatan Starter Ragi Perbanyakan/Peremajaan Isolat BAL, BAA dan khamir Terpilih Inokulasi Isolat BAL, BAA dan khamir pada media cair Perhitungan Jumlah Sel BAL, BAA dan Khamir Penyiapan Starter Ragi Pembuatan Ragi Kakao Persiapan Media Ragi Inokulasi Starter pada Media Ragi Pembuatan Adonan Ragi Inkubasi Ragi Kakao Perhitungan Viabilitas BAL, BAA dan khamir dengan Metode SPC Analisis Data Gambar 2. Skema Tahapan Penelitian IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Kadar Air Ragi Kakao selama Penyimpanan Air merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme, terutama pertumbuhan bakteri dan khamir. Bakteri asam laktat, bakteri asam asetat dan khamir merupakan mikroba lokal yang diisolasi dari kakao fermentasi dan diinokulasikan ke dalam ragi kakao. Peningkatan dan penurunan viabilitas bakteri asam laktat, bakteri asam asetat dan khamir dalam ragi kakao ditentukan oleh ketersediaan air dalam ragi kakao, dimana ketiga jenis mikroba ini akan menggunakan air sebagai suplemen untuk pertumbuhannya. Sastramihardja (1989), menyatakan bahwa air bertindak sebagai suatu bahan pelarut di dalam aktivitas yang berhubungan dengan metabolisme sel mikroorganisme dan bertindak sebagai katalisator secara langsung dan dilibatkan dalam beberapa reaksi enzimatik. Pengukuran kadar air digunakan untuk mengetahui kandungan air pada ragi kakao selama penyimpanan baik pada suhu 280C maupun penyimpanan pada suhu 50C. Kadar air ragi kakao selama penyimpanan pada suhu 280C dan 50C tercantum pada Tabel 4. Tabel 4. Kadar air ragi kakao selama penyimpanan (%) Waktu Penyimpanan (Hari) Suhu Penyimpanan 0 10 20 30 40 50 0 Suhu 28 C 10,81 10,78 10,49 9,64 6,15 8,15 0 Suhu 5 C 10,81 11,19 10,96 10,90 8,51 8,80 60 3,95 6,28 Berdasarkan data pada Tabel 4 menunjukkan bahwa terjadi penurunan dan peningkatan kadar air selama penyimpanan ragi kakao. Penurunan kadar 34 35 air pada suhu 280C terjadi setelah penyimpanan ragi kakao selama 10 hingga 40 hari yaitu 10,81% menjadi 6,15% kemudian meningkat pada penyimpanan 50 hari menjadi 8,15% dan kembali menurun pada akhir penyimpanan menjadi 3,95%. Kadar air ragi pada suhu penyimpanan 50C menunjukkan bahwa terjadi peningkatan kadar air pada penyimpanan ragi kakao selama 10 hari dari 10,81% menjadi 11,19%, kemudian mengalami penurunan hingga 40 hari penyimpanan menjadi 8,51%. Peningkatan kadar air kembali terjadi setelah penyimpanan ragi kakao selama 50 hari menjadi 8,80% kemudian menurun pada akhir penyimpanan menjadi 6,28%. Peningkatan kadar air ragi kakao dapat disebabkan oleh faktor lingkungan di sekitar penyimpanan ragi, seperti kelembaban. Sopandih dan Wardah (2014) menyatakan bahwa kadar air dalam media tumbuh mikroba dipengaruhi oleh kelembaban udara dan suhu sekitar penyimpanan media tumbuh. Penurunan dan peningkatan kadar air dapat mempengaruhi viabilitas mikroba lokal dalam ragi kakao. Kusumaningtyas, dkk. (2005) menyatakan bahwa kadar air yang rendah akan berakibat sel mikroba menjadi dorman. Penurunan kadar air disebabkan karena air tersebut digunakan oleh mikroba untuk tumbuh dan melakukan proses metabolisme. Sebagaimana yang diungkapkan oleh Sopandih dan Wardah (2014), bahwa mikroba memerlukan air untuk pertumbuhannya yang akan digunakan sebagai transpor nutrisi, pengeluaran material limbah, melaksanakan reaksi enzimatis, sintesis komponen seluler dan melakukan beberapa reaksi biokimia yang lain seperti hidrolisis pati oleh enzim α-amilase. 36 B. pH Ragi Kakao Selama Penyimpanan Nilai pH ditentukan oleh besarnya konsentrasi H+ yang disumbangkan oleh asam-asam lemah di dalam substrat, dalam hal ini adalah asam sitrat, asam laktat dan asam asetat yang merupakan hasil perombakan gula oleh yeast, bakteri asam laktat dan bakteri asam asetat (Kustyawati dan Setyani, 2008). pH ragi kakao selama penyimpanan tercantum pada Tabel 5. Tabel 5. pH ragi kakao selama penyimpanan Waktu Penyimpanan (Hari) Suhu Penyimpanan 0 10 20 30 40 0 Suhu 28 C 6 6 5,5 5 5 0 Suhu 5 C 6 6 5,5 5,5 5,5 50 5 5,5 60 5 5,5 Berdasarkan data pada Tabel 5 menunjukkan bahwa terjadi penurunan pH selama penyimpanan ragi kakao. pH ragi kakao menurun setelah penyimpanan ragi kakao selama 20 hari. pH awal ragi kakao pada suhu 28 0C sampai pada penyimpanan 10 hari adalah 6, kemudian menurun menjadi 5,5 pada penyimpanan selama 20 hari. Penurunan pH menjadi 5 kembali terjadi pada penyimpanan ragi kakao selama 30 hingga 60 hari penyimpanan. Penurunan nilai pH pada suhu penyimpanan 50C memiliki nilai yang sama yaitu 5,5 hingga akhir penyimpanan. Penurunan pH ragi kakao disebabkan oleh adanya aktivitas mikroba dalam hal ini bakteri asam laktat dan bakteri asam asetat dalam ragi kakao yang menghasilkan asam-asam organik seperti asam laktat, asam sitrat dan asam asetat selama penyimpanan, sehingga dapat menurunkan pH pada media tumbuh. Hal ini dipertegas oleh Sopandih dan Wardah (2014); Usmiati dkk. (2011) yang menyatakan bahwa bakteri asam laktat dan bakteri asam asetat 37 akan menghasilkan asam-asam organik seperti asam laktat dan asam asetat dalam medium yang mengandung karbohidrat sehingga menurunkan pH media hingga 3,5-5,0. Asam laktat dan asam asetat yang terbentuk akan semakin banyak seiring dengan lamanya penyimpanan sehingga menyebabkan pH ragi kakao menurun. C. Viabilitas Bakteri Asam Laktat pada Penyimpanan Suhu 50C dan Suhu 280C Viabilitas bakteri asam laktat dalam ragi kakao pada suhu penyimpanan berbeda dihitung dengan menggunakan metode Total Plate Count (TPC). Bakteri asam laktat ditumbuhkan pada media spesifik MRSA (De Mann Ragosa Sharpe Agar) yang mengandung CaCO3 lalu dilakukan perhitungan jumlah koloni yang tumbuh dengan menggunakan colony counter. Jumlah sel bakteri asam laktat dalam ragi kakao pada suhu penyimpanan berbeda selama 60 hari tercantum pada Tabel 6. Tabel 6. Log jumlah sel BAL dalam ragi kakao pada penyimpanan suhu 280C dan suhu 50C dengan waktu penyimpanan 0-60 hari Suhu Log Rata-Rata Jumlah Sel BAL (CFU/g) Waktu Suhu 280C Suhu 50C 0 7,85 7,85 10 7,83 8,08 20 7,2 7,4 30 7,43 7,64 40 6 7,43 50 5 7,49 60 4,78 7,23 Berdasarkan data log jumlah sel bakteri asam laktat (Tabel 6), maka dapat dibuat grafik log jumlah sel bakteri asam laktat pada suhu penyimpanan 38 berbeda selama waktu penyimpanan 60 hari. Grafik log jumlah sel bakteri asam laktat selama penyimpanan tercantum pada Gambar 3. Log Viabilitas BAL (CFU/g) 8.7 7.7 7.85 8.08 7.4 7.85 7.83 6.7 7.2 7.64 7.43 7.49 7.23 7.43 6 5.7 4.7 5 4.78 3.7 Suhu 280C Suhu 50C 2.7 1.7 0 10 20 30 40 50 60 Waktu Penyimpanan (Hari) Gambar 3. Grafik log jumlah sel bakteri asam laktat dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C dan 50C Gambar 3 menunjukkan bahwa log jumlah sel bakteri asam laktat pada suhu penyimpanan berbeda selama waktu penyimpanan semakin menurun. Selama masa penyimpanan pada suhu 280C mulai terjadi penurunan log jumlah sel bakteri asam laktat sebanyak 1 log yaitu 7,43 CFU/g menjadi 6 CFU/g pada 40 hari penyimpanan dan kembali menurun 1 log menjadi 5 CFU/g pada 50 hari penyimpanan. Log jumlah sel kembali menurun 1 log pada 60 hari penyimpanan menjadi 4,78 CFU/g. Log jumlah sel bakteri asam laktat pada suhu penyimpanan 50C mengalami peningkatan sebanyak 1 log yaitu 7,85 CFU/g menjadi 8,08 CFU/g pada 10 hari penyimpanan dan kembali menurun 1 log menjadi 7,4-7,23 CFU/g setelah 20 hingga 60 hari penyimpanan. Viabilitas bakteri asam laktat ditentukan dengan membandingkan log jumlah sel setelah penyimpanan dan log jumlah sel sebelum penyimpanan 39 yang dinyatakan dengan persentase (%). Berdasarkan data log jumlah sel (Tabel 6), maka dibuat histogram persentase viabilitas bakteri asam laktat pada suhu penyimpanan berbeda selama waktu penyimpanan. Histogram persentase viabilitas bakteri asam laktat selama penyimpanan tercantum pada Gambar 4. Persentase Viabilitas BAL (%) 120 100 80 60 Suhu 280C 40 Suhu 50C 20 0 0 10 20 30 40 50 60 Waktu Penyimpanan (Hari) Gambar 4. Histogram persentase viabilitas bakteri asam laktat dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C dan 50C Gambar 4 menunjukkan bahwa suhu dan lama penyimpanan memberikan pengaruh terhadap viabilitas bakteri asam laktat dalam ragi kakao. Penyimpanan pada suhu 280C menunjukkan bahwa viabilitas bakteri asam laktat mengalami penurunan pada penyimpanan selama 40 hingga 60 hari sehingga persentase viabilitas sel turun menjadi 76,48%-60,91%. Penyimpanan pada suhu 50C menunjukkan bahwa viabilitas bakteri asam laktat mengalami fluktuasi selama penyimpanan. Viabilitas bakteri asam laktat pada suhu penyimpanan 280C terus mengalami penurunan hingga 60 hari penyimpanan sebanyak 2 log yaitu 7,43 40 CFU/g menjadi 5,48 CFU/g sehingga persentase viabilitas sel juga mengalami penurunan menjadi 60,91%. Hal ini disebabkan oleh kadar air yang semakin menurun mencapai 3,95% (Tabel 4) pada penyimpanan selama 60 hari. Kadar air 3,95% ini merupakan kadar air yang cukup ekstrim bagi bakteri asam laktat yang dapat menyebabkan bakteri asam laktat tidak mampu bertahan dalam ragi kakao. Penurunan kadar air ragi akan memberikan pengaruh terhadap viabilitas mikroorganisme (Susiwi, 2009). Kadar air yang rendah menyebabkan berkurangnya kelarutan nutrien di dalam substrat, dan derajat pertumbuhan rendah. Kadar air yang optimal untuk inokulum bakteri asam laktat yang digunakan sebagai starter dalam fermentasi adalah ±10% (Rukmi, dkk., 2008). Lay (1994) menyatakan bahwa bila kandungan kadar air pada lingkungan hidup bakteri asam laktat lebih rendah dibandingkan kandungan air di dalam sel maka akan terjadi lisis sehingga memungkinkan terjadinya kerusakan sel bakteri asam laktat dan menyebabkan penurunan viabilitas bakteri asam laktat Viabilitas bakteri asam laktat pada suhu penyimpanan 50C masih dapat bertahan hingga 92,17% selama 60 hari penyimpanan. Penyimpanan ragi kakao setelah 10 hari menunjukkan log jumlah sel bakteri asam laktat mengalami peningkatan lalu kembali mengalami penurunan sebanyak 1 log selama penyimpanan sampai 60 hari. Peningkatan log jumlah sel pada penyimpanan 10 hari berimplikasi pada peningkatan viabilitas sel yang dapat disebabkan oleh peningkatan kadar air ragi kakao dan kembali menurun setelah 30 hari penyimpanan (Tabel 4). Penurunan maupun peningkatan kadar 41 air ragi akan memberikan pengaruh terhadap viabilitas mikroorganisme (Susiwi, 2009) namun pada suhu 50C tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap penurunan jumlah sel bakteri asam laktat. Menurut Campbell, et al (2003) pada kondisi suhu rendah, kerja enzim menjadi terhambat sehingga dapat menekan laju metabolisme bakteri, akibatnya penurunan maupun peningkatan jumlah sel relatif statis. Semakin besar perbedaan suhu penyimpanan, maka viabilitas bakteri asam laktat akan cepat mengalami penurunan, demikian pula sebaliknya semakin kecil perbedaan suhu penyimpanan, maka viabilitas bakteri asam laktat akan dapat bertahan dan lambat mengalami penurunan (Nurwantoro dan Djariah 1997). Ketersediaan nutrisi dan senyawa metabolit yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat juga memicu penurunan viabilitas. Menurut Naughton and Larry (1990) kelangsungan hidup mikroorganisme berkurang karena adanya suplai makanan atau nutrisi yang terbatas. Selain itu, penurunan jumlah sel disebabkan karena sel menjadi mati lebih cepat dari pada terbentuknya sel-sel baru (Pelczar dan Chan, 1986). Adanya akumulasi senyawa metabolit yang mungkin beracun seperti hidrogen peroksida dapat memicu kerusakan sel sehingga sel menjadi lebih cepat mati (Lunggani, 2007). D. Viabilitas Bakteri Asam Asetat pada Penyimpanan Suhu 50C dan Suhu 280C Viabilitas bakteri asam asetat dalam ragi kakao pada suhu penyimpanan berbeda dihitung dengan menggunakan metode Total Plate Count (TPC). Bakteri asam asetat ditumbuhkan pada media spesifik CAAR lalu dilakukan perhitungan jumlah koloni yang tumbuh dengan menggunakan 42 colony counter. Jumlah sel bakteri asam asetat dalam ragi kakao pada penyimpanan suhu 280C dan suhu 50C selama 60 hari tercantum pada Tabel 7. Tabel 7. Log jumlah sel BAA dalam ragi kakao pada penyimpanan suhu 280C dan suhu 50C dengan waktu penyimpanan 0-60 hari Suhu Log Rata-Rata Jumlah Sel (CFU/g) Waktu Suhu 280C Suhu 50C 0 7,87 7,87 10 7,63 8,15 20 7,23 7,57 30 7,23 7,7 40 6,3 7,3 50 5,85 7,26 60 4,85 7,23 Berdasarkan data log jumlah sel bakteri asam asetat (Tabel 7), maka dapat dibuat grafik log jumlah sel bakteri asam asetat pada suhu penyimpanan berbeda selama waktu penyimpanan 60 hari. Grafik log jumlah sel bakteri asam asetat selama penyimpanan tercantum pada Gambar 5. Log Viabilitas BAA (CFU/g) 8.7 7.7 6.7 7.87 8.15 7.57 7.87 7.63 7.23 7.7 7.3 7.26 7.23 7.23 6.3 5.7 5.85 4.7 4.85 3.7 Suhu 280C Suhu 50C 2.7 1.7 0 10 20 30 40 50 60 Waktu Penyimpanan (Hari) Gambar 5. Grafik log jumlah sel bakteri asam asetat dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C dan 50C Gambar 5 menunjukkan bahwa log jumlah sel bakteri asam asetat pada suhu penyimpanan berbeda selama waktu penyimpanan semakin 43 menurun. Selama masa penyimpanan pada suhu 280C mulai terjadi penurunan log jumlah sel bakteri asam asetat sebanyak 1 log yaitu 7,23 CFU/g menjadi 4,85 CFU/g pada 40 hingga 60 hari penyimpanan. Log jumlah sel bakteri asam asetat pada suhu penyimpanan 50C mengalami peningkatan sebanyak 1 log yaitu 7,87 CFU/g menjadi 8,15 CFU/g pada 10 hari penyimpanan dan kembali menurun 1 log menjadi 7,57-7,23 CFU/g pada 20 hingga 60 hari penyimpanan. Viabilitas bakteri asam asetat ditentukan dengan membandingkan log jumlah sel setelah penyimpanan dan log jumlah sel sebelum penyimpanan yang dinyatakan dengan persentase (%). Berdasarkan data log jumlah sel (Tabel 7), maka dibuat histogram persentase viabilitas bakteri asam asetat pada suhu penyimpanan berbeda selama waktu penyimpanan. Histogram persentase viabilitas bakteri asam asetat selama penyimpanan tercantum pada Gambar 6. Persentase Viabilitas BAA (%) 120 100 80 60 Suhu 280C 40 Suhu 50C 20 0 0 10 20 30 40 50 60 Waktu Penyimpanan (Hari) Gambar 6. Histogram persentase viabilitas bakteri asam asetat dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C dan 50C 44 Viabilitas bakteri asam asetat pada suhu penyimpanan 280C seperti yang tercantum pada Gambar 6 terus mengalami penurunan hingga 40 hari penyimpanan sebanyak 1 log menjadi 6,3 CFU/g sehingga persentase viabilitas bakteri asam asetat turun menjadi 80,07%, lalu menurun kembali pada penyimpanan 50 hari menjadi 74,33% dan kembali menurun pada 60 hari menjadi 61,57%. Viabilitas sel pada hari ke-20 memiliki persentase yang sama dengan viabilitas sel pada hari ke-30 kemudian menurun pada hari ke40. Penyimpanan pada hari ke-50 menunjukkan adanya peningkatan viabilitas sel dan kembali menurun pada penyimpanan 60 hari. Viabilitas sel yang sama tersebut disebabkan oleh penurunan kadar air ragi (Tabel 4) sehingga sel tidak dapat tumbuh. Kusumaningtyas, dkk. (2005) menyatakan bahwa kadar air yang sangat rendah akan memicu sel untuk menjadi dorman. Penurunan viabilitas sel disebabkan oleh kadar air yang semakin menurun (Tabel 4) sampai pada penyimpanan 40 hari. Penurunan kadar air kembali terjadi pada penyimpanan 60 hari dan mencapai 3,95%. Kadar air 3,95% ini merupakan kadar air yang cukup ekstrim bagi bakteri asam asetat untuk bertahan hidup. Kadar air yang rendah menyebabkan berkurangnya kelarutan nutrien di dalam substrat, dan derajat pertumbuhan rendah. Kadar air yang tinggi akan mempercepat pertumbuhan sehingga nutrisi dalam ragi akan cepat habis dan inokulum akan lebih cepat mati (Thanh and Noul, 2004; Kusumaningtyas, dkk., 2009). Viabilitas bakteri asam asetat yang ditunjukkan dengan log jumlah sel yang tumbuh pada suhu 50C menunjukkan adanya peningkatan log jumlah sel 45 pada penyimpanan 10 hari dan menurun pada hari ke-20. Viabilitas bakteri asam asetat pada suhu penyimpanan 50C masih dapat bertahan hingga 7,23 CFU/g dan hanya mengalami penurunan sebanyak 1 log selama penyimpanan sampai 60 hari sehingga viabilitas sel masih dapat bertahan hingga 91,88%. Penurunan viabilitas bakteri asam asetat juga dipengaruhi oleh ketersediaan nutrisi dan senyawa metabolit yang dihasilkan oleh bakteri asam asetat itu sendiri. Menurut Nurwantoro dan Djariah (1997), penurunan viabilitas dapat terjadi karena adanya efek antimikroba dari diasetil, asam asetat, dan asam laktat yang muncul di dalam produk dan terkadang disebabkan adanya bakteriosin. Kelangsungan hidup bakteri asam asetat bergantung dari kondisi lingkungan diantaranya komposisi media, pH, keberadaan oksigen, dan sumber karbon. Setiap mikroorganisme mempunyai batasan kemampuan untuk mempertahankan kelangsungan hidupnya seperti bakteri asam asetat mempunyai batasan pH dan suhu tertentu untuk dapat beraktivitas dan melangsungkan hidupnya (Rizal, dkk., 2013). E. Viabilitas Khamir pada Penyimpanan Suhu 50C dan Suhu 280C Viabilitas khamir dalam ragi kakao pada suhu penyimpanan berbeda ditentukan dengan metode Total Plate Count (TPC). Khamir ditumbuhkan pada media PDA lalu dilakukan perhitungan jumlah koloni yang tumbuh dengan menggunakan colony counter. Viabilitas khamir dalam ragi kakao pada suhu penyimpanan berbeda selama 60 hari tercantum pada Tabel 8. 46 Tabel 8. Log jumlah sel khamir dalam ragi kakao pada penyimpanan suhu 280C dan suhu 50C dengan waktu penyimpanan 0-60 hari Suhu Rata-Rata Jumlah Sel (CFU/g) Waktu Suhu 280C Suhu 50C 0 7,65 7,65 10 7,49 8,23 20 7,04 7,54 30 6,78 7,54 40 6,08 7,18 50 4,7 7,2 60 4,30 7,52 Berdasarkan data log jumlah sel khamir (Tabel 8), maka dapat dibuat grafik log jumlah sel khamir pada suhu penyimpanan berbeda selama waktu penyimpanan 60 hari. Grafik log jumlah sel khamir selama penyimpanan tercantum pada Gambar 7. Log Viabilitas Khamir (CFU/g) 8.7 7.7 6.7 8.23 7.65 7.65 7.49 7.54 7.04 7.54 7.2 7.18 7.52 6.78 5.7 6.08 4.7 Suhu 280C 4.7 4.3 3.7 Suhu 50C 2.7 1.7 0 10 20 30 40 50 60 Waktu Penyimpanan (Hari) Gambar 7. Grafik log jumlah sel khamir dalam ragi kakao penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C dan 50C selama Gambar 7 menunjukkan bahwa log jumlah sel khamir pada suhu penyimpanan berbeda selama waktu penyimpanan semakin menurun. Selama masa penyimpanan pada suhu 280C mulai terjadi penurunan log jumlah sel khamir sebanyak 1 log yaitu 7,04 CFU/g menjadi 6,78 CFU/g pada 30 hari 47 penyimpanan, lalu kembali menurun sebanyak 1 log menjadi 4,7-4,3 CFU/g pada 50 hingga 60 hari penyimpanan. Log jumlah sel khamir pada suhu penyimpanan 50C mengalami peningkatan sebanyak 1 log yaitu 7,65 CFU/g menjadi 8,23 CFU/g pada 10 hari penyimpanan dan kembali menurun 1 log menjadi 7,54-7,52 CFU/g pada 20 hingga 60 hari penyimpanan. Viabilitas khamir ditentukan dengan membandingkan log jumlah sel setelah penyimpanan dan log jumlah sel sebelum penyimpanan yang dinyatakan dengan persentase (%). Berdasarkan data log jumlah sel (Tabel 8), maka dibuat histogram persentase viabilitas khamir pada suhu penyimpanan berbeda selama waktu penyimpanan. Histogram persentase viabilitas khamir Persentase Viabilitas Khamir (%) selama penyimpanan tercantum pada Gambar 8. 120 100 80 60 Suhu 280C 40 Suhu 50C 20 0 0 10 20 30 40 50 60 Waktu Penyimpanan (Hari) Gambar 8. Histogram persentase viabilitas khamir dalam ragi 0 0 kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 28 C dan 5 C Gambar 8 menunjukkan bahwa viabilitas khamir pada suhu 280C menurun seiring dengan lamanya waktu penyimpanan, sedangkan pada suhu 50C viabilitas khamir cenderung stabil seiring dengan lamanya penyimpanan. Penyimpanan ragi pada suhu 50C menunjukkan bahwa viabilitas sel pada hari 48 ke-20 memiliki persentase yang sama dengan viabilitas sel pada hari ke-30 yaitu 98,57%. Viabilitas sel yang sama mengindikasikan jumlah sel yang sama. Hal ini disebabkan oleh penurunan kadar air ragi (Tabel 4) sehingga sel tidak dapat tumbuh. Kusumaningtyas, dkk. (2005) menyatakan bahwa kadar air yang sangat rendah akan memicu sel untuk menjadi dorman. Susiwi (2009) menyatakan bahwa perubahan kadar air dapat mempengaruhi viabilitas mikroba dalam suatu bahan. Penurunan kadar air selama penyimpanan dapat mempengaruhi viabilitas khamir dalam ragi kakao. Selama penyimpanan kultur dapat terjadi peningkatan kadar air karena pengaruh RH lingkungan sehingga berdampak pula pada viabilitas khamir (Novelina, dkk., 2005). Namun, penyimpanan pada suhu 280C viabilitas sel khamir terus mengalami penurunan hingga 56,2% pada akhir penyimpanan. Populasi sel khamir pada awal penyimpanan sudah sedemikian padat sehingga dengan kondisi penyimpanan pada suhu optimum menyebabkan proses metabolisme dan pemanfaatan nutrisi berlangsung terus menerus. Hal ini memberikan asumsi bahwa pasokan nutrisi dalam ragi berkurang dan bahkan habis seiring dengan lamanya penyimpanan sehingga tidak bisa mendukung pertumbuhan khamir dan berakibat pada menurunnya viabilitas. Populasi khamir yang sedemikian padat juga menyebabkan banyak metabolit sekunder yang dihasilkan. Metabolit ini yang mungkin dapat mengganggu pertumbuhan sel khamir sehingga banyak yang mati akibatnya jumlah sel yang hidup menurun (Kusumaningtyas, dkk., 2005). Ketersediaan nutrisi dan fluktuasi kadar air menjadi faktor menurunnya viabilitas sel khamir selama 49 penyimpanan. Salah satu nutrisi yang dibutuhkan oleh khamir untuk bertahan hidup adalah glukosa. Glukosa digunakan sebagai sumber karbon bagi khamir untuk bertahan hidup. Semakin banyak glukosa yang terpakai semakin sedikit kandungan glukosa pada ragi kakao yang bahan utamanya adalah tepung beras dan tepung terigu sehingga pertumbuhan juga semakin lambat. Pertumbuhan yang ada tidak mampu mengimbangi jumlah sel yang mati sehingga jumlah sel menjadi menurun (Kusumaningtyas, dkk., 2005). Kadar air ragi yang terus menerus menurun pada penyimpanan suhu 280C (Tabel 4) juga memberikan pengaruh terhadap viabilitas khamir berupa penurunan jumlah sel khamir. Viabilitas khamir pada suhu 50C masih dapat dipertahankan hingga akhir penyimpanan dengan persentase 98,24%. Fluktuasi log jumlah sel khamir pada penyimpanan suhu 50C disebabkan oleh fluktuasi kadar air ragi kakao pada setiap penyimpanan. Peningkatan kadar air ragi kakao berimplikasi pada peningkatan viabilitas khamir. Hal ini dipertegas oleh Sopandih dan Wardah (2014) yang menyatakan bahwa peningkatan kadar air dapat mempercepat pertumbuhan mikroba karena proses metabolisme berlangsung cepat. Penurunan kadar air akan memberikan pengaruh terhadap viabilitas mikroorganisme (Susiwi, 2009), namun pada suhu 50C tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap penurunan jumlah sel khamir. Menurut Campbell, et al. (2003) pada kondisi suhu rendah, kerja enzim menjadi terhambat sehingga dapat menekan laju metabolisme mikroba. 50 Oleh karena itu, penurunan jumlah sel pada suhu rendah relatif stabil dan dapat mempertahankan viabilitas sel khamir. F. Perbandingan Viabilitas Mikroba dalam Ragi Kakao pada Penyimpanan Suhu 280C dan 50C Viabilitas bakteri asam laktat, bakteri asam asetat dan khamir dalam ragi kakao secara umum dipengaruhi oleh suhu penyimpanan dan keadaan lingkungan internal dalam ragi kakao itu sendiri. Lingkungan internal dapat berupa, nutrisi dan beberapa hasil metabolit sekunder dari masing-masing mikroba ragi seperti bakteri asam laktat, bakteri asam asetat dan khamir. Viabilitas campuran bakteri asam laktat, bakteri asam asetat dan khamir dapat juga dipengaruhi oleh interaksi antara masing-masing isolat yang memungkinkan ketiganya bersifat sinergis atau antagonis dalam campuran (Hidayat, dkk., 2006). Viabilitas mikroba dalam ragi kakao pada suhu Persentase Viabilitas Mikroba (%) penyimpanan 280C tercantum pada Gambar 9. 120 100 80 280C BAL 60 280C BAA 40 280C khamir 20 0 0 10 20 30 40 50 60 Waktu Penyimpanan (Hari) Gambar 9. Histogram viabilitas mikroba dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 280C 51 Data pada Gambar 9 menunjukkan perbedaan viabilitas pada ketiga jenis mikroba dalam ragi kakao pada suhu 280C. Data tersebut menunjukkan bahwa viabilitas mikroba selama penyimpanan pada 280C viabilitas mikroba cenderung menurun seiring lamanya penyimpanan. Hal ini disebabkan karena mikroba dalam kultur campuran memiliki kebutuhan nutrisi yang berbedabeda. Bakteri mempunyai kebutuhan nutrisi paling tinggi yang diikuti oleh khamir dan kapang (Ray, 2004; Sopandih dan Wardah, 2014). Beberapa mikroba juga menghasilkan asam organik, seperti asam laktat, asetat, propionat dan asam butirat yang mempunyai efek antagonistik terhadap pertumbuhan dan kelangsungan hidup mikroba itu sendiri (Sopandih dan Wardah, 2014). Salah satu kelemahan menggunakan kultur campuran adalah terjadinya kompetisi antar mikroba untuk memperoleh nutrisi. Adanya senyawa berbeda yang dihasilkan akan menghambat bakteri jenis lainmya yang ditumbuhkan secara bersamaan misalnya bakteri asam laktat menghasilkan bakteriosin dan hidrogen peroksida dapat menurunkan sejumlah bakteri yang peka terhadap senyawa tersebut (Waluyo, 2004; Hidayat, dkk., 2006). Penurunan jumlah mikroba dapat disebabkan oleh banyak faktor diantaranya faktor pembatas seperti berkurangnya nutrisi di dalam substrat atau medium, terbentuknya asam, metabolit atau senyawa yang dihasilkan oleh mikroba, suhu inkubasi, masa penyimpanan, serta keberadaan inhibitor. Viabilitas mikroba dalam ragi kakao pada suhu penyimpanan 50C tercantum pada Gambar 10. Persentase Viabilitas Mikroba (%) 52 110 105 100 280C BAL 95 280C BAA 90 280C khamir 85 80 0 10 20 30 40 50 60 Waktu Penyimpanan (Hari) Gambar 10. Histogram viabilitas mikroba dalam ragi kakao selama penyimpanan 0-60 hari pada suhu 50C Data pada Gambar 10 menunjukkan bahwa viabilitas mikroba pada suhu 50C masih dapat bertahan antara 91,88% hingga 98,24% pada 60 hari penyimpanan. Hal ini disebabkan oleh suhu penyimpanan ragi yang rendah. Menurut Campbell, et al. (2003) pada kondisi suhu rendah, kerja enzim menjadi terhambat sehingga dapat menekan laju metabolisme mikroba. Persentase viabilitas mikroba tertinggi didominasi oleh khamir sampai akhir penyimpanan. Hal ini disebabkan karena khamir mampu bertahan hidup pada kadar air rendah 5% hingga 7,5% (Purwadi, dkk., 2009). Selain itu, khamir memiliki zat kitin dan selulosa sebagai komponen struktural dinding sel yang lebih tahan kerusakan karena panas, asam ataupun perlakuan fisik lainnya (Pelczar and Chan, 1986). Semakin besar perbedaan suhu penyimpanan, maka viabilitas bakteri asam laktat akan cepat mengalami penurunan, demikian pula sebaliknya semakin kecil perbedaan suhu penyimpanan, maka viabilitas mikroba akan dapat bertahan dan lambat mengalami penurunan (Nurwantoro dan Djariah 1997). Oleh karena itu, penurunan jumlah sel pada 53 suhu rendah relatif stabil dan dapat mempertahankan viabilitas sel mikroba bila dibandingkan dengan penyimpanan pada suhu ruang (280C). Penyimpanan pada suhu 280C menyebabkan sel mikroba lebih aktif membelah sehingga terjadi kompetisi nutrisi antar mikroba dalam kultur campuran sehingga banyak sel yang menjadi mati. V. PENUTUP A. Simpulan Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan, maka dapat disimpulkan bahwa : 1. Viabilitas mikroorganisme dalam ragi kakao pada suhu 280C selama penyimpanan dapat bertahan hingga 60 hari penyimpanan dengan persentase viabilitas berkisar antara 56,2% hingga 61,57% pada 60 hari penyimpanan. 2. Viabilitas mikroorganisme dalam ragi kakao pada suhu 50C selama penyimpanan dapat bertahan hingga 60 hari penyimpanan dengan persentase viabilitas berkisar antara 91,88% hingga 98,24%. 3. Penyimpanan ragi kakao pada suhu 50C dapat mempertahankan viabilitas mikroorganisme dengan persentase tertinggi selama 60 hari. B. Saran Saran yang dapat diajukan pada penelitian ini adalah sebaiknya : 1. Untuk menjaga viabilitas mikroba dalam ragi kakao, sebaiknya ragi kakao disimpan pada suhu 50C (di dalam kulkas). 2. Perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai penggunaan ragi kakao dengan viabilitas terbaik selama penyimpanan. 3. Perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai penyimpanan ragi kakao dengan waktu yang lebih lama. 54 DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2014, Sulawesi Tenggara dalam Angka, Badan Pusat Statistik Provinsi Sulawesi Tenggara, Kendari. Anonim, 2015, Statistik Perkebunan Indonesia Komoditas Kakao 2013-2015, Direktorat Jendral Perkebunan, Kementerian Pertanian, Jakarta. Anonim, 2015, Sulawesi Tenggara dalam Angka, Badan Pusat Statistik Provinsi Sulawesi Tenggara, Kendari. AOAC, 2005, Official Method 931.40 Moisture in Cocoa Product, Association of Official Analytical Chemistry (AOAC). Ardhana, M.M., and Fleet, G.H., 2003, The Microbial Ecology of Cocoa Bean Fermentations in Indonesia, Internasional Journal of Food Microbiol, 86 : 87-99 Atlas, M.A., 1995, Microorganism In Our World, St. Louis Missouri, Mosby Year Book, Inc, USA. Atlas, M.A., 2004, Handbook of Microbiological Media 3rd Edition, CRC Press, London. Atmawinata, O., Sri, M., Widyotomo, S., dan Yusianto., 1998, Teknik PraPengolahan Biji Kakao Segar Secara Mekanis untuk Mempersingkat Waktu Fermentasi dan Menurunkan Keasaman Biji, Pelita Perkebunan, 14 (1) : 48-62 Bamforth, C.W., 2005, Food, Fermentation and Microorganisms, Blackwell Publishing, USA. Campbell, N.A. dan Reece, M., 2003, Biologi Edisi Kelima Jilid 3, Erlangga, Jakarta. Camu, N., Tom, D.W., Kristof, V., Ilse, C., Peter, V., Jemmy, S.T., Marc, V., and Luc, D.V., 2007, Dynamics and Biodiversity of Populations of Lactic Acid Bacteria and Acetic Acid Bacteria Involved in Spontaneous Heap Fermentation of Cocoa Beans in Ghana, Applied and Environmental Microbiology, 73 (6) : 1809–1824 Chong, C.F., Shepherd, R. and Poo, Y.C., 1978, Mitigation of Cocoa Bean Acidity Fermentary Investigation, Int. Conf. On Cocoa and Coconut. Kuala Lumpur. 55 56 Daulay, D., 1991, Fermentasi Asam Laktat dalam Pengolahan Pangan, IPB, Bogor. Dwidjoseputro, D., 1978, Pengantar Mikologi, Djambatan, Jakarta. Faisal, A., 2002, Pengantar Pangan dan Gizi, Swadaya, Jakarta. Fardiaz S., 1989, Analisa Mikrobiologi Pangan, Raja Grafiondo Persada, Jakarta. Fardiaz, S., 1992, Mikrobiologi Pangan I, Gramedia, Jakarta. Gan, P.M dan Sherrington, K.B., 1992, Ilmu Pangan Pengantar Ilmu Pangan Nutrisi dan Mikrobiologi, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Gandjar, I., Wellyzar, S., dan Ariyanti, O., 2006, Mikologi Dasar Terapan, Yayasan Obor Indonesia, Jakarta. Haryadi dan Supriyanto., 2012, Teknologi Coklat, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Hauser, J.T., 2006, Techniques for Studying Bacteria and Fungi, Microbiology Department, Carolina Biological Supply Company, USA. Hernani dan Haliza, W., 2013, Optimasi Komposisi Nutrien untuk Pembentukan Komponen Cita Rasa pada Fermentasi Biji Kakao Asalan, Jurnal Pascapanen, 10 (2) : 74-75 Hidayat, N., Padaga, M.C., Suhartini S., 2006, Mikrobiologi Industri, C.V Andi Offset, Yogyakarta. Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Stanley, J.T., and Williams, S.T., 1994, Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th ed., Liplincot, Williams and wilkins, Baltimore. Iriyani., 2005, Penggunaan Media Tepung Sagu sebagai Media Inokulasi Ragi Roti dalam Fermentasi Bij Kakao Kering, Fakultas Pertanian, Universitas Tadulako, Palu. Jamili., Yanti, N.A., and Susilowati, P.E., 2014, Enhancement of Cocoa Quality by The Indigenous Yeast Candida tropicalis KLK4 Through Cocoa Bean Fermentation, Journal of Advanced in Biotechnology, 4 (1) : 327-335 Joetono, Soedarsono, S., Hartadi, S., Kabirun, S., Darmosuwito, S., dan Soesanto, 1975, Pedoman Praktikum Mikrobiologi untuk Perguruan Tinggi. Departemen Pertanian, Fakultas Pertanian, UGM. Yogyakarta. 57 Jojima, Y., Mihara, Y., Suzuki, S., Yokozeki, K., Yamanaka, S., and Fudou, R., 2004, Saccharibacter Floricola gen, Nov., sp. Nov., a Novel Osmophilic Acetic Acid Bacterium Isolated from Pollen, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. Jumiati, 2014, Karakterisasi Bakteri Asam Asetat Lokal dari Biji Kakao Fermentasi dan Peranannya Terhadap Kualitas Biji Kakao (Theobroma Cacao L.), Skripsi Tidak Dipublikasikan, Universitas Halu Oleo, Kendari. Kasmidjo, R.B., 1990, Tempe : Mikrobiologi dan Kimia Pengolahan serta Pemanfaatannya, PAU Pangan dan Gizi UGM, Yogyakarta. Kusnadi., Syulasmi, A., Adisendjaja, Y. H., 2009, Pemanfaatan Sampah Organik Sebagai Bahan Baku Produksi Bioetanol Sebagai Energi Alternatif, Laporan Penelitian Strategis Nasional, Universitas Pendidikan Indonesia. Kustyawati, M.E., dan Setyani, S., 2008, Pengaruh Penambahan Inokulum Campuran terhadap Perubahan Kimia dan Mikrobiologi Selama Fermentasi Coklat, Jurnal Teknologi Industri dan Hasil Pertanian, 13 (2) : 83 Kusumaningtyas, E., Raphaella, W., Istiana, R., Maryam., Tarmudji, 2005, Viabilitas Saccharomyces cerevisiae, Rhizopus oligosporus dan Campurannya dalam Tepung Beras, Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner, Bogor. Kusumawati, E. 2008. Kajian Formulasi Sari Mentimun (Cucumis sativus L.) sebagai Minuman Probiotik Menggunkan Campuran Kultur Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus subsp. salivarus, dan Lactobacillus casei subsp. Rhamnosus, Naskah Skripsi S-1, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Lay, B.W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, Rajawali Pers, Jakarta. Lee, J.M., 1992, Biochemical Engineering, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey. Lian, W.C., Hsio, H.C., and Chou, C.C., 2002, Survival of Bifidobacterium longum after Spray Drying, International Journal Food Microbiology, 74 : 79-86 Lunggani, A.T., 2007, Kemampuan Bakteri Asam Laktat dalam Menghambat Pertumbuhan dan Produksi Alfatoksin B2 Aspergillus flavus, Bioma, 9(2) : 45-51 58 Malaka, R. dan Laga, A., 2005, Isolasi dan Identifikasi Lactobacillus Bulgaricus Strain Ropy dari Yoghurt Komersial, Jurnal Sains & Teknologi, 5 (1) : 5058 Miftahuddin, 2014, Karakteristik Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi Biji Kakao dan Peranannya terhadap Kualitas Biji Kakao (Theobroma cacao L.), Skripsi Tidak Dipublikasikan, Universitas Halu Oleo, Kendari. Partanto dan Dahlan., 1991, Kamus Ilmiah Popular, Arloka, Surabaya. Pelczar, M.J. dan Chan, E.C.S., 1986, Dasar-Dasar Mikrobiologi, UI Press, Jakarta. Purwadi, R., Nicko., Stephanie, P., 2009, Optimasi Temperatur Udara Pengering dan Laju Alir Umpan pada Proses Pengeringan Ragi Roti, Jurnal Teknik Kimia Indonesia, 8(1) : 1-5 Rahman, A., Fardiaz, S., Rahaju, W.P., Suliantari dan Nurwitri, C.C., 1992, Teknologi Fermentasi Susu, Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Rizal, H.M., Dewi, M.P., dan Abdullah, S., 2013, Pengaruh Penambahan Gula, Asam Asetat dan Waktu Fermentasi Terhadap Kualitas Nata de Corn, Jurnal Teknik Kimia, 19 (1) : 38 Rizqiati, H., Jenie, B.S.L., Nurhidayat, N., dan Nurwitri, C., 2005, Ketahanan dan Viabilitas Lactobacillus plantarum yang Dienkapsulasi dengan Susu Skim dan Gum Arab setelah Pengeringan dan Penyimpanan, Animal Production, 10(3) : 179-187 Rodriguez, C.J., Escalona, B.H.B., Orozco, A.I., Lugo, C.E., Jaramillo, F., 2011, Dynamics of Volatile and Non Volatile Compounds in Cocoa (Theobroma cacao L.) during Fermentation and Drying Processes using Principal Components Analysis, Food Research International, 44 : 250258 Rukmi, W.D., Zubaidah, E., dan Maria, M., 2007, Pembuatan Starter Kering Kultur Campuran Bakteri Asam Laktat dan Saccharomyces cereviceae untuk Proses Fermentasi Produk Sereal Instan, Jurnal Tek. Pert., 4(1) : 69 Sastramihardja, I., 1989, Prinsip Dasar Mikrobiologi Industri, PAU, ITB, Bogor. Schwan, R.F., 1998, Cocoa Fermentations Conducted with a Defined Microbial Cocktail Inoculum, Jurnal Microbiol, 14 : 1477-1483 59 Sopandi, T., dan Wardah, 2014, Mikrobiologi Pangan (Teori dan Praktik), Andi, Yogyakarta. Spreutels, L., Debaste, F., Legros, R., and Haut, B., 2013, Experimental Characterization and Modelling of Baker's Yeast Pellet Drying, Food Research Internasional, 52 : 275-287 Sugireng, 2014, Karakterisasi Khamir Lokal dari Biji Kakao Fermentasi, Skripsi Tidak Dipublikasikan, Universitas Halu Oleo, Kendari. Sugyono, 2009, Metode Penelitian Kualitatif dan Kuantitatif R & K, Alfabet, Jakarta. Suprapti, M.L., 2005, Kecap Tradisional, Kanisius, Yogyakarta. Suriawiria, U., 1983, Mikrobiologi Masa Depan Penuh Kecerahan Di Dalam Pembangunan, Kumpulan Beberapa Tulisan dari Unus Suriawiria, Jurusan Biologi, ITB, Bandung. Susiwi, 2009, Regulasi Pangan (K1 531), Universitasitas Pendidikan Indonesia. Syarief, R., Laega, dan Nurwitri, 2003, Mikotoksin Bahan Pangan, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Thanh, N.Y. and Noul, M.J., 2004, Dormancy, Activation and Viability of Rhizopus oligosporus Sporangiospores, Int. J. Food Microbiol, 92(2) : 171–179 Waluyo, L., 2004, Mikrobiologi Umum, Universitas Muhamadiyah Malang, Malang. Winarno, F. G., 1984, Seri Teknologi Pangan III, Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi Pangan IPB, 11-19. Wulandari, U.T., 2005 , Uji Viabilitas dan Efektivitas Bakteri Pelarut Fosfat pada Media Kombinasi Senyawa Humik, Mollase dan Zeolit pada Tanah Masam, Skripsi, Universitas Jember. Yanti, N.A., Jamili dan Susilowati, P.E., 2014, Peningkatan Kualitas Biji Kakao Melalui Proses Fermentasi Oleh Mikroba Lokal Asal Sulawesi Tenggara, Prosiding pada Seminar Nasional Semirata 2014 Bidang MIPA BKSPTN Barat, IPB, Bogor, 9-11 Mei 2014. Yuwono, T., 2008, Biologi Molekuler, Erlangga, Jakarta. Lampiran 1. Dokumentasi Penelitian A B C D Gambar 6. Penyiapan Media dan sterilisasi. (a) Menghomogenkan media dengan Hot plate, (b) Media CAAR, PDA & MRSA, (c) Alat & bahan yang siap disterilisasi, (d) Sterilisasi dengan autoklaf. A B C D Gambar 7. Penyiapan inokulum mikroba. (a) Peremajaan isolat, (b) Inokulasi isolat pada media cair, (c) inkubasi shaker, (d) Perhitungan jumlah sel mikroba 60 61 A C B D Gambar 8. Penyiapan starter mikroba. (a) Pemisahan pelet dan supernatan, (b) inkubasi shaker, (c) Starter mikroba, (d) Perhitungan jumlah mikroba pada starter dengan metode tuang A B Gambar 9. Pembuatan ragi kakao. (a) Pencampuran adonan serta ragi yang telah dibentuk dan diinkubasi satu malam, (b) Penjemuran ragi kakao 62 A C B D Gambar 10. Pengujian viabilitas. (a) Ragi kakao dan proses penumbuhan mikroba, (b) Inkubasi ragi kakao, (c) Perhitungan jumlah koloni mikroba (d) Pengukuran kadar air ragi kakao Gambar 11. Koloni bakteri asam laktat (BAL) selama penyimpanan, (atas) suhu 50C ; (bawah) suhu 280C 63 64 Gambar 12. Koloni bakteri asam asetat (BAA) selama penyimpanan, (atas) suhu 50C ; (bawah) suhu 280C 65 Gambar 13. Koloni khamir selama penyimpanan, (atas) suhu 50C ; (bawah) suhu 280C Lampiran 2. Tabel 9. Jumlah Mikroba pada starter mikroba (CFU/mL) Jumlah Koloni Jenis -4 Mikroba 10 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 BAL TBUD 326 83 BAA TBUD TBUD 385 224 211 145 Khamir TBUD 340 60 Tabel 10. Jumlah mikroba sebelum pengeringan (CFU/g) Jumlah Koloni Jenis Mikroba Ulangan 10-4 10-5 10-6 1 TBUD 167 79 BAL 2 TBUD 254 187 3 TBUD 215 95 1 TBUD 210 BAA 2 TBUD 102 3 TBUD 225 1 TBUD 85 37 Khamir 2 TBUD 223 230 3 TBUD 122 47 TPC 8,3 x 107 1,5 x 1011 6,0 x 107 10 -7 94 82 135 - Perhitungan TPC jumlah mikroba dalam ragi kakao : Jumlah koloni per pengencer : Ulangan 1 : 10 -4 = TBUD 10 -5 = 167 106 = 79 Ulangan 2 : 10 -4 = TBUD 10 -5 = 254 106 = 187 Ulangan 3 : 10 -4 = TBUD 10 -5 = 215 106 = 95 Rata-rata : TBUD 212 120 Nilai TPC dihitung menggunakan rumus : 1 Jumlah Koloni = Jumlah koloni X 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 Sehingga diperoleh nilai TPC yaitu : 1 Pengencer 10 -6 : Jumlah sel = 120 X 10−6 = 1,2 x 108 CFU/g 66 TPC (CFU/g) 1,2 x 108 1,1 x 109 1,0 x 108 67 Tabel 11. pH ragi kakao selama penyimpanan Waktu Penyimpanan (Hari) Suhu Penyimpanan 0 10 20 30 40 280C 6 6 5,5 5 5 0 5C 6 6 5,5 5,5 5,5 Tabel 12. Pengukuran kadar air ragi kakao selama penyimpanan Suhu Lama Ulangan Penyimpanan Penyimpanan Jumlah 0 ( C) (Hari) 1 2 3 0 28 C 10,88 10,81 10,74 32,43 0 0 5C 10,88 10,81 10,74 32,43 0 28 C 10,58 10,92 10,85 32,35 10 0 5C 11,08 11,25 11,25 33,58 0 28 C 10,77 10,24 10,48 31,49 20 0 5C 10,89 10,73 11,28 32,8 280C 9,62 9,79 9,51 28,92 30 50C 10,99 10,73 10,98 32,7 280C 6,11 6,12 6,23 18,46 40 50C 10,99 10,53 11,28 25,53 280C 8,64 8,76 9,01 26,41 50 0 5C 8,26 8,2 8,01 24,47 0 28 C 4,18 3,01 4,67 11,86 60 0 5C 6,15 7,21 5,50 18,86 50 5 5,5 60 5 5,5 Rerata (%) 10,81 10,81 10,78 11,19 10,49 10,96 9,64 10,96 6,15 8,51 8,80 8,15 3,95 6,28 Rumus: % kadar air = Berat bobot x 100% Berat awal sampel Contoh: kadar air “ragi kakao” pada penyimpanan 10 hari : Diketahui : Berat awal : Ulangan 1 = 3,6600 Ulangan 2 = 3,9012 Ulangan 3 = 3,7262 Berat akhir : Ulangan 1 = 3,2728 Ulangan 2 = 3,4752 Ulangan 3 = 3,3216 Berat bobot: Berat awal – Berat akhir Ditanyakan : Kadar air “ragi kakao” pada penyimpanan 10 hari ? 68 Penyelesaian: Ulangan 1 % kadar air = 3,6600−3,2728 3,6600 𝑥 100% = 10,58% Ulangan 2 % kadar air = 3,9012−3,4752 3,9012 𝑥 100% = 10,92% Ulangan 3 % kadar air = 3,7262−3,3216 3,7262 𝑥 100% = 10,85% Selanjutnya hasil yang diperolah dari 3 ulangan dijumlahkan dan hasilnya dirata-ratakan, sehingga diperolah persentase kadar air “ragi kakao” pada penyimpanan 10 hari yaitu : 10,58% + 10,92% + 10,85% = 32,35% 32,35% : 3 = 10,78% 69 Tabel 13. Pengamatan jumlah penyimpanan (CFU/g) Waktu Suhu Ulangan 280C 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 0 Hari 50C 280C 10 Hari 50C 280C 20 Hari 50C 280C 30 Hari 50C 280C 40 Hari 50C 280C 50 Hari 50C 280C 60 Hari 50C bakteri asam laktat Jumlah Koloni 10-4 10-5 10-6 TBUD 203 14 TBUD TBUD 154 TBUD TBUD 42 TBUD 203 14 TBUD TBUD 154 TBUD TBUD 42 TBUD 51 24 TBUD 176 136 TBUD 187 42 TBUD 230 161 TBUD TBUD 156 TBUD 189 30 TBUD 22 17 TBUD 99 20 TBUD 51 11 TBUD 180 42 TBUD 54 16 TBUD 74 17 46 36 31 73 46 40 22 17 12 126 93 64 63 37 26 173 116 42 8 5 0 24 15 0 5 0 0 217 91 21 132 98 41 292 43 20 10 0 0 13 1 0 20 0 0 289 122 42 261 153 36 226 73 16 5 0 0 7 0 0 6 0 0 138 61 17 135 95 17 TBUD 78 24 (BAL) selama 7,0x107 Log Jumlah Sel 7,85 7,0x107 7,85 6,7x107 7,83 1,2x108 8,08 1,6x107 7,2 2,5x107 7,4 2,7x107 7,43 4,4x107 7,64 1,0x106 6 2,7x107 7,43 1,0x105 5 3,1x107 7,49 6,0x104 4,67 1,7x107 7,23 TPC 70 Tabel 14. Pengamatan jumlah penyimpanan (CFU/g) Waktu Suhu Ulangan 280C 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 0 Hari 50C 280C 10 Hari 50C 280C 20 Hari 50C 280C 30 Hari 50C 280C 40 Hari 50C 280C 50 Hari 50C 280C 60 Hari 50C bakteri asam asetat Jumlah Koloni 10-4 10-5 10-6 TBUD 209 14 22 52 25 TBUD 177 56 TBUD 209 14 22 52 25 TBUD 177 56 TBUD 155 16 TBUD 152 82 TBUD 35 32 TBUD 207 185 TBUD 197 151 TBUD 132 84 89 33 13 146 54 11 72 53 27 TBUD 53 27 TBUD 125 41 TBUD 168 45 24 20 15 44 36 25 27 30 13 102 32 46 132 64 39 70 76 65 33 11 2 10 0 0 31 18 1 71 20 10 132 18 16 103 41 33 80 6 0 53 11 0 67 5 0 45 30 25 140 20 18 159 19 11 5 0 0 10 0 0 8 0 0 107 58 20 93 51 15 109 46 16 (BAA) selama 7,4x107 Log Jumlah Sel 7,87 7,4x107 7,87 4,3x107 7,63 1,4x108 8,15 1,7x107 7,23 3,7x107 7,57 1,7x107 7,23 5,0x107 7,7 2,0x106 6,3 2,0x107 7,3 7,0x105 5,84 1,8x107 7,26 7,0x104 4,84 1,7x107 7,23 TPC 71 Tabel 15. Pengamatan jumlah khamir selama penyimpanan (CFU/g) Jumlah Koloni Waktu Suhu Ulangan TPC -4 10 10-5 10-6 280C 1 TBUD 77 45 4,5x107 2 TBUD 175 58 0 Hari 3 TBUD 132 34 0 5C 1 TBUD 77 45 4,5x107 2 TBUD 175 58 3 TBUD 132 34 280C 1 TBUD 180 12 3,1x107 2 TBUD 93 55 10 Hari 3 TBUD 101 26 50C 1 TBUD TBUD 262 1,7x108 2 TBUD 262 196 3 246 103 42 0 28 C 1 31 28 16 1,1x107 2 74 33 7 20 Hari 3 52 24 12 50C 1 62 58 40 3,5x107 2 174 40 27 3 283 35 39 0 28 C 1 36 53 6 6,0x106 2 21 14 0 30 Hari 3 14 8 5 50C 1 156 90 51 3,5x107 2 118 53 24 3 39 131 32 0 28 C 1 0 0 0 1,2x106 2 0 0 0 40 Hari 3 15 12 0 0 5C 1 285 104 14 1,5x107 2 231 40 12 3 232 53 20 280C 1 0 0 0 5,0x104 2 5 0 0 50 Hari 3 1 0 0 0 5C 1 426 135 18 1,6x107 2 278 92 20 3 218 48 10 280C 1 2 0 0 2,0x104 2 0 0 0 60 Hari 3 0 0 0 0 5C 1 300 60 34 3,3x107 2 222 58 15 3 349 90 51 Log Jumlah Sel 7,65 7,65 7,49 8,23 7,04 7,54 6,78 7,54 6,08 7,18 4,7 7,2 4,65 7,52 72 Tabel 16. Viabilitas mikroba selama penyimpanan (CFU/g) Suhu Viabilitas BAL Viabilitas BAA Penyimpanan (%) (%) 0 ( C) Waktu 280C 50C 280C 50C Penyimpanan (Hari) 0 100 100 100 100 10 99,76 103 97 103,5 20 91,83 94,3 91,88 96,17 30 94,73 97,43 91,88 97,84 40 76,48 94,73 80,07 92,78 50 63,73 95,49 74,28 92,2 60 60,91 92,17 61,57 91,88 Viabilitas Khamir (%) 280C 50C 100 97,89 92,01 88,57 79,43 61,4 56,2 100 107,5 98,57 98,57 93,77 94,13 98,24 Rumus: Log jumlah sel setelah penyimpanan Viabilitas = x 100% Log jumlah sel sebelum penyimpanan Contoh: Viabilitas bakteri asam laktat pada penyimpanan 10 hari : Diketahui : Log jumlah sel setelah penyimpanan = 7,83 (CFU/g) Log jumlah sel setelah penyimpanan = 7,85 (CFU/g) Ditanyakan : Persentase viabilitas = ......? Penyelesaian : Viabilitas = Log jumlah sel setelah penyimpanan Log jumlah sel sebelum penyimpanan 7,83 = 7,85 𝑋100% = 99,76% x 100%
