36 Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian Ganoderma sp. isolat

36
Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian
Ganoderma sp. isolat Banyumas 2
Penyediaan inokulum
dalam cawan petri
dengan medium PDA
Kultivasi miselium pada
medium PDYB
Inkubasi miselium dalam
medium cair PDYB dan di
shaker selama 14 Hari
Inkubasi miselium dalam
medium cair PDYB dan di
shaker selama 28 Hari
Miselium dipanen menggunakan kertas
saring Whatman no 41, penyaringan
dibantu dengan pompa vakum
Miselium dikeringkan pada suhu
60°C
Miselium diekstraksi dengan
pelarut n-heksan
Uji sitotoksik metode MTT
menggunakan cell line HeLa
Hasil IC50
37
Lampiran 2. Alur Kerja Uji Sitotoksik MTT
Mengambil sel dari Inkubator CO2, dan mengamati kondisi sel.
Memanen sel sesuai dengan protokol panen
Mentransfer sel ke dalam sumuran masing-masing 100 µL
Menyisakan 3 sumuran kosong
Mengamati keadaan sel di mikroskop inverted untuk melihat distribusi sel dan
mendokumentasikannya.
Menginkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar pulih kembali setelah
panen)
Membuat seri konsentrasi sampel untuk perlakuan (termasuk kontrol sel dan
kontrol DMSO) sesuai dengan protokol preparasi kontrol
Mengambil plate yang telah berisi sel dari inkubator CO2
Membuang media sel
Memasukkan 100 µL PBs ke dalam semua sumuran yang terisi sel, kemudian
membuangnya
Memasukkan seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran (triplo)
Lampiran 3. Perhitungan Analisis Regresi Sampel Ekstrak Miselium Ganoderma sp. isolat Banyumas 2 inkubasi 28 hari
Kadar
(µg/mL)
log
kadar
Kontrol
media
Kontrol
sel
31,25
1,49
62,5
1,80
125
2,10
250
2,40
500
2,70
1000
3,00
Absorbansi
Viabilitas
V7
V8
SD
A7
0,071
A8
0,094
A9
0,093
Rata-rata
0,086
V9
Rata-rata
0,539
0,626
0,633
0,599
97,051
95,029
107,919
100,000
0,027
0,592
0,63
0,609
0,610
98,571
105,974
101,883
102,143
0,019
0,561
0,563
0,571
0,565
92,532
92,922
94,481
93,312
0,005
0,511
0,566
0,497
0,525
82,792
93,506
80,065
85,455
0,036
0,454
0,45
0,457
0,454
71,688
70,909
72,273
71,623
0,003
0,147
0,145
0,178
0,157
11,883
11,494
17,922
13,766
0,018
0,157
0,232
0,2
0,196
13,831
28,442
22,208
21,494
0,037
0,027
Lampiran 4. Perhitungan Analisis Regresi Sampel Ekstrak Miselium Ganoderma sp. isolat Banyumas 2 inkubasi 14 hari
Kadar
(µg/mL)
log
kadar
Kontrol
media
Kontrol
sel
31,25
1,49
62,5
1,80
125
2,10
250
2,40
500
2,70
1000
3,00
Absorbansi
Viabilitas
V7
V8
V9
SD
A7
0,071
A8
0,094
A9
0,093
Rata-rata
0,086
Rata-rata
0,539
0,626
0,633
0,599
101,040
111,378
87,581
100,000
0,061
0,567
0,609
0,56
0,579
93,701
101,883
92,338
95,974
0,026
0,547
0,546
0,556
0,550
89,805
89,610
91,558
90,325
0,005
0,475
0,495
0,491
0,487
75,779
79,675
78,896
78,117
0,010
0,452
0,456
0,46
0,456
71,299
72,078
72,857
72,078
0,004
0,231
0,228
0,26
0,240
28,247
27,662
33,896
29,935
0,017
0,213
0,186
0,19
0,196
24,740
19,481
20,260
21,494
0,014
0,061
Lampiran 5. Persediaan Inokulum Ganoderma sp. isolat Banyumas dan Kultur
Miselium Dalam Medium PDYB
a.
b.
c..
d.
e.
Keterangan :
a. Tampak depan
b. Tampak belakang
c. Hifa
d. Inkubasi 14 Hari
e . Inkubasi 28 Hari
Lampiran 6. Pemanenan Miselium dan Pengeringan Miselium
a.
b.
c.
d.
e.
Keterangan :
a.
b.
c.
d.
e.
Penuangan Kultur
Penyaringan Di Pompa Vakum
Penimbangan Bobot Basah
Pengeringan Miselium Dalam Oven
Miselium Kering
Lampiran 7. Ekstraksi
a.
c.
Keterangan
a. Pelarut n-Heksan
b. Proses Maserasi dalam Ruangan Asam
c. Maserasi
d. Ekstrak kering
b.
d.
Lampiran 8. Preparasi Sampel
a.
c.
Keterangan :
a. Penimbangan Ekstrak Kering
b. Vortex
c. Ekstrak Untuk Treatment
b.
Lampiran 9. Uji MTT
a.
c.
e.
b.
d.
f.
g.
h.
i.
j.
Keterangan :
a. Mikropipet Berbagai Ukuran
b. Medium Kultur
c. Penuangan Medium
d. Pembuatan Seri Konsentrasi
e. well-plate berisi kultur sel kanker
f. Inkubator
g. Pengamatan sel di Mikroskop
h. Reagen Stopper (SDS)
i. ELISA reader
j. Hasil Pembacaan Absorbansi
Lampiran 10. Contoh perhitungan % Inhibisi dan & Hidup sel konsentrasi 1000
µg/mL
% viabilitas sel =
X100 %
=
=
,
,
,
,
,
,
X100 %
X100 %
= 21,4 %

Perhitungan IC50 Ekstrak Miselium Inkubasi 14 hari
Dari regresi linear kurva y = a + bx
y = -0,079x + 90,63
IC50 = (50-90,63)/-0,079
= 514 µg/mL

Perhitungan IC50 Ekstrak Miselium Inkubasi 28 hari
Dari regresi linear kurva y = a + bx
y = -0,089x + 93,88
IC50 = (50-93,88)/-0,089
= 493 µg/mL
Lampiran 11. Hasil Uji MTT ekstrak miselium Ganoderma sp. isolat Banyumas 2
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
Keterangan:
1. Kontrol Sel
2.Pemberian Konsentrasi 31,25 µg/mL
3. Pemberian Konsentrasi 62,5 µg/mL
4. Pemberian Konsentrasi 125 µg/mL
5. Pemberian Konsentrasi 250 µg/mL
6. Pemberian Konsentrasi 500 µg/mL, sel HeLa rusak
7. Pemberian Konsentrasi 1000 µg/mL, sel HeLa rusak