Isolasi dan Screening Mikrobia

A. Isolasi Mikrobia
merupakan proses pemisahan mikrobia dari lingkungannya di alam dan
menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan
harus diketahui cara-cara penumbuhan mikrobia pada media
biakan dan syarat-syarat yang diperlukan (faktor nutrisi dan kebutuhan
oksigen)
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam isolasi mikrobia:
1. sifat-sifat spesial mikrobia yang diisolasi
2. Tempat hidup atau asal mikrobia
3. Medium pertumbuhan yang sesuai
4. Cara menanam dan inkubasi mikrobia
5. Cara menguji mikrobia hasil isolasi (biakan murni)
6. Cara memelihara mikrobia hasil isolasi agar tetap berupa biakan murni
 Isolasi
Bakteri
a. Cara goresan (streak plate method)
suspensi bahan yang mengandung bakteri, digoreskan pada
medium agar (Nautrien agar) dalam petridish. Inkubasikan sehingga
pada bekas goresan tumbuh koloni-koloni bakteri. Lakukan isolasi
lebih lanjut untuk masing-masing koloni yang tumbuh.
b. Cara taburan (pour plate method)
inokulasikan medium agar yang sedang mencair pada suhu 500C
dengan suspensi bahan yang mengandung bakteri. Tuangkan
secara bersamaan ke dalam petridish. Inkubasikan sehingga
tumbuh koloni-koloni bakteri. Isolasi lebih lanjut koloni bakteri yang
diinginkan
 Isolasi Khamir/yeast
a. Cara goresan dan taburan
sama dengan isolasi bakteri, hanya media agar yang digunakan berupa
PGY (potato glucose yeast) atau PDA (potato dextrose agar)
b. Menggunakan mikro manipulator
satu sel khamir diambil dan dimasukkan ke dalam medium, sehingga
pertumbuhannya hanya berasal dari satu sel saja. Untuk mengetahuinya
digunakan mikroskop yang dilengkapi dengan mikromanipulator
 Isolasi Jamur
a.
b.
c.
d.
Cara pengenceran dan penaburan (dilution plate method)
Cara isolasi dengan spora dari satu sporangium
Cara perkecambahan dari satu spora
Cara biakan dalam tanah – air (soil water culture)
B. Sreening
Seleksi untuk mendapatkan mikrobia yang potensiil untuk
proses fermentasi (industri) dan memisahkannya dari mikrobia yang
tidak berguna untuk proses produk
a. Seleksi awal
hanya menentukan mikrobia yang dapat menghasilkan suatu
produk, tetapi belum memperhatikan kemampuannya untuk
berproduksi
secara kualitatif
b. Seleksi lanjut
hasil seleksi awal/primer digunakan untuk memilih mikrobia yang
potensiil untuk proses industri
secara kuantitatif
Pada tahap sreening dilakukan identifikasi dan determinasi biakan murni
hasil isolasi yang meliputi:
 Morfologi individual
(ukuran, bentuk, ada/tidak spora, reaksi pengecatan dll)
 Morfologi koloni
(bentuk, ukuran, warna, tekstur koloni dll)
 Sifat biokimia
faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan
(perubahan KH, hidrolisa lemak/protein, reduksi unsur-unsur,
pembentukan pigmen)
 Patogenitas
 Dll
Pengujian Kualitatif:
a. Mikrobia penghasil enzim amilase
mikrobia hasil isolasi ditumbuhkan pada petridish berisi pati
+ agar, inkubasikan
gores dan masukkan ke dalam tabung reaksi, + larutan Iod
apabila dalam tabung reaksi terbentuk warna biru kehitaman
maka mikrobia menghasilkan enzim amilase
b. Mikrobia penghasil enzim lipase
mikrobia hasil isolasi ditumbuhkan dalam pertidish berisi
tributirin + agar, inkubasikan
koloni bakteri digores, jika sekitar goresan terbentuk warna
terang berarti ada enzim lipase
c. Mikrobia penghasil enzim protease
mikrobia hasil isolasi ditumbuhkan dalam media yang
mengandung 1% skim + agar, inkubasikan.
koloni bakteri digores, jika sekitar goresan berwarna terang
berarti mengandung enzim protase
Pengujian Kuantitatif:
Di lakukan untuk mengukur kemampuan mikrobia yang dipilih untuk
keperluan industri
Dilakukan dengan:
a. Menghitung jumlah sel
b. menghitung konsentrasi produk yang dihasilkan
Kultur hasil isolasi dan screening disimpan untuk dipelihara lebih lanjut
kultur yang dipelihara harus memenuhi syarat:
1. Memiliki genetika yang stabil serta tak mudah mengalami mutasi
2. Dapat tumbuh dengan cepat
3. Dapat dipelihara dalam waktu lama
4. Segera membentuk sel vegetatif atau spora sesuai yang diinginkan
5. Memiliki kemampuan sistem protek si diri
Pengujian Kuantitatif:
Dilakukan untuk mengukur kemampuan mikrobia yang dipilih untuk
keperluan industri
Dilakukan dengan:
a. menghitung jumlah sel
b. Menghitung konsentrasi produk yang dihasilkan
Kultur hasil isolasi dan screening disimpan untuk dipelihara lebih
lanjut
kultur yang dipelihara harus memenuhi syarat:
1. Memiliki genetika yang stabil serta tak mudah mengalami mutasi
2. Dapat tumbuh dengan cepat
3. Dapat dipelihara dalam waktu lama
4. Segera membentuk sel vegetatif atau spora sesuai yang
diinginkan
5. Memiliki kemampuan sistem proteksi diri
Penyimpanan /Pemeliharaan Kultur
1. Penyimpanan suhu Rendah
a. Penyimpanan dalam agar miring
kultur ditumbuhkan dalam agar miring
simpan dalam refrigerator (5oC) atau freezer (-20oC)
setiap 6 bulan sekali dipindahkan ke media agar miring baru
b. Penyimpanan spora dalam air
spora jamur disuspensikan dalam air destilasi steril
simpan pada suhu 5oC
c. Penyimpanan dengan nitrogen cair
Kultur sel pada fase stasioner disuspensikan dalam larutan
cryoprotective agent (Gliserol 10%)
masukkan dalam wadah bertutup, bekukan dengan nitrogen cair
hingga suhu – 150 s/d – 196oC
selama penyimpanan dapat terjadi kehilangan kemampuan
hidup/viabilitas
permasalahan : biaya tinggi
kerusakan alat karena perlakuan suhu rendah
2. Penyimpanan pada kondisi kering
a. Kultur tanah (untuk menyimpan jamur/actinomycetes)
tanah basah steril diinokulasikan dengan kultur jamur
inkubasi beberapa hari sehingga tumbuh jamur
keringkan pada suhu kamar, simpan dalam RH rendah atau refrigerator 50 %
actynomycetes yang dikeringkan, dapat bertahan selama 20 tahun
b. Lyophilization (Liofilisasi/freeze drying)
- merupakan proses pembekuan kultur yang diikuti dengan pengeringan
pada kondisi vacum dengan proses sublimasi sempurna cairan sel
- kultur sel pada fase stasioner disuspensikan dalam medium pelindung
(susu, sodium glutamat, glukosa-pepton)
- beberapa tetes suspensi dimasukkan ke dalam ampul
dibekukan dalam ruang vacum, dilanjutkan pengeringan sehingga terjadi
sublimasi sempurna, ampul
sublimasi = molekul air dalam protoplasma langsung dirubah menjadi uap
air tanpa melalui fase cair
Hasil liofilisasi : sel mikrobia bersifat liofilik (berupa tepung yang
higroskopis)
Dalam lingkungan mikrobiologi dikenal 2 tipe kultur
1. Working Culture
merupakan kultur yang dipakai dalam kondisi tidak
terkontaminasi dan disimpan dalam agar stab/agar slant
preparasi dalam bentuk spora/kultur broth yang disimpan dalam
refrigerator (dikenal juga sebagai kultur stock)
harus dilakukan pengujian secara periodik terhadap µ, produksi,
kontaminasi
2. Primary Culture
merupakan kultur yang disimpan dalam jangka waktu lama dan
digunakan untuk membandingkan atau program seleksi lanjut
preparasi dilakukan dengan tanah steril atau agar broth yang
dilengkapi dengan penutup minyak steril atau disimpan dengan
metode liofilisasi