BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancang Penelitian

BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancang Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental untuk menentukan
formula yang optimal terhadap karakteristik fisik sediaan pasta gigi ekstrak
kayu siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav.) dengan menambahkan berbagai konsentrasi Na-CMC
untuk stabilitas.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah variasi konsentrasi Na-CMC.
2. Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah sifat fisik sediaan pasta gigi
dan diameter zona hambat pasta gigi terhadap pertumbuhan bakteri
Streptococcus mutans.
3. Variabel Terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak kayu
siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav.) serta metode pembuatan sediaan pasta gigi.
C. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Teknologi Farmasi dan
Laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah
Purwokerto serta Laboratorium Mikrobiologi dan Virologi Fakultas Biologi
Universitas Muhammadiyah Purwokerto yang dilakukan selama 5 bulan.
D. Alat dan Bahan
1. Bahan penelitian
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah batang kayu
siwak dan daun sirih merah , etanol 70% no.batch 870170201 diproduksi
PENGGUNAAN Na-CMC (GELLING AGENT) DALAM ...Van Fatkhan Sofyan, FARMASI. UMP 2017
oleh PT.Brataco Cikarang, Gliserin, Na-CMC kualitas farmasi dikemas
ulang PT.Brataco, kalsium karbonat light (CaCO3 light) kadar 98.5100.5% batch orginal 62525 ex. Konoshima chemical co. ltd (Jepang)
dikemas ulang oleh PT.Brataco , Na-Lauril sulfat, Na-sakarin, oleum
menthae piperitae, metil paraben dan propil paraben diproduksi oleh
PT.Brataco, Aquadest, HCL pekat, FeCl 1 %, Nutrien Agar dan Nutrien
Borth, dan bakteri Streptococcus mutans dari laboratorium mikrobiologi
Universitas Jenderal Soedirman.
2. Alat penelitian
Alat yang digunakan adalah Oven UM-300 memmert dan Oven
memmert tipe UM-400 made in jerman, Gelas ukur Pyrex® 10ml; 100ml,
Timbangan analitik shimadzu model TXB622L dan model ATX224,
Cawan porselen, pH 0-14 Universal indicator werck merck KGaA 64217
darmstadt germany, Rotary evaporator (vacobrand CVC 3000 IKA®HB10
model RV 10 8599 made in IKA), H-3F-27L Water bath model XMTD204, Mortir dan Stamper, Slides microscope made in china, Centrifuge
OLC Series PLC-03, Viskometer Brookfield tipe DV2T LV spindel, Jarum
ose tumpul, Spektrofotometri uv-vis tipe 9100 merk palintest-UK, Cawan
petri herma 100x15 mm dan petridish glass 60x15mm, Lampu spiritus,
Centrifuge merk table top centrifuge pic03 230 VAC produksi germany
industrial Corp, Sumuran, Hot plate IKA C-MAG HS 7, Autoklaf All
American Electric Sterilizer 75X dan Horizontal Laminar Air Flow
mascotte model LH S.
E. Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi ini dimaksudkan untuk menetapkan atau memastikan
kebenaran dari sampel yang digunakan dalam penelitian yaitu benar kayu
siwak (Salvadora persica L.) dan daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz
& Pav.) yang dimaksud. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium
Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman.
PENGGUNAAN Na-CMC (GELLING AGENT) DALAM ...Van Fatkhan Sofyan, FARMASI. UMP 2017
2. Pembuatan simplisia tanaman
Tanaman kayu siwak (Salvadora persica L.) diperoleh di Toko Herbal
Arab di kawasan kota Cirebon Jawa Barat yang telah di determinasi
kemudian dibersihkan dengan air mengalir agar tidak ada debu atau
kotoran yang menempel. Daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
diperoleh dikawasan Majenang, Jawa Tengah, daun sirih merah yang telah
di determinasi kemudian
dibersihkan dari kotoran-kotoran yang
menempel dengan cara dicuci dengan air mengalir sampai bersih.
Kayu siwak (Salvadora persica L.) dan
daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav.) yang telah bersih dan bebas dari sisa air cucian
dikeringkan dalam lemari pengering selama 3 hari dengan tujuan untuk
mengurangi kadar air dan menghentikan proses reaksi enzimatik dalam
kayu siwak (Salvadora persica L.) dan daun sirih merah (Piper crocatum
Ruiz & Pav.), sehingga mencegah penurunan mutu atau rusaknya
kandungan simplisia. Setelah itu simplisia kering dibersihkan kembali dari
kotoran yang mungkin tidak hilang pada saat pencucian. Tahap selanjutnya
simplisia kering diblender sehingga menjadi simplisia serbuk untuk
memperkecil ukuran partikel kayu siwak (Salvadora persica L.) dan daun
sirih merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav.) sehingga luas permukaan
partikel daun yang nantinya kontak dengan pelarut akan maksimal pada
proses maserasi, setelah itu serbuk simplisia diayak dengan menggunakan
ayakan, kemudian disimpan dalam wadah bersih dan tertutup rapat.
3. Penetapan susut pengeringan
Ekstrak kayu siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih
merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) masing-masing ditimbang seksama
lebih kurang 1 g, dalam botol kaca dangkal bertutup yang sebelumnya
telah dipanaskan dengan suhu 105 ºC selama 30 menit dan telah ditara.
Masing-masing
ekstrak
diratakan
dalam
botol
kaca
dengan
menggoyangkan botol. Botol dimasukkan ke dalam oven, tutupnya dibuka,
panaskan pada suhu 105 ºC selama 1 jam. Botol didinginkan dalam
desikator selama 15 menit, kemudian ditimbang hingga bobot tetap
(Moerfiah, 2011).
PENGGUNAAN Na-CMC (GELLING AGENT) DALAM ...Van Fatkhan Sofyan, FARMASI. UMP 2017
4. Metode ekstraksi
Pembuatan ekstrak kayu siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak
daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) dilakukan dengan metode
maserasi. Perbandingan antara serbuk dengan larutan penyari yaitu 1:10
(b/v). Serbuk simplisia dimaserasi dengan etanol 70% sebagai pelarut,
pemilihan etanol 70% dikarenakan penyari tersebut tidak beracun,
absorbsinya baik, panas yang diperlukan untuk pemekatan lebih sedikit
dan dapat menyari zat aktif. Maserasi dilakukan selama 5 hari dengan cara
serbuk simplisia kayu siwak (Salvadora persica L.) dan daun sirih merah
(Piper crocatum Ruiz & Pav.) yang telah ditimbang masing masing
dimasukkan ke toples besar, kemudian ditambahkan pelarut etanol 70%,
dan diaduk selama 2 jam setiap harinya. Proses pengadukan dilakukan
agar penyari tidak menjadi jenuh, karena apabila penyari menjadi jenuh
maka akan sulit untuk menyari zat aktif. Perendaman ini dilakukan pada
suhu kamar (28-32 ºC). Setelah 5 hari kemudian disaring dengan kain
flanel (Andini et al., 2014).
Proses maserasi diperoleh maserat yang diuapkan dengan rotary
evaporator dan menggunakan water bath pada suhu 60 ⁰C. Proses
penguapan dilakukan selama 5 hari dimana 1 hari untuk rotary evaporator
dan 4 hari untuk penguapan di water bath sampai dihasilkan ekstrak
kental. Penguapan dilakukan untuk menghilangkan penyari di dalam
maserat. Ekstrak dikemas setelah bobot konstan (Karima, 2015).
Ekstrak kayu siwak (Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih
merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) yang telah kental dimasukkan ke
dalam wadah tertutup rapat dan disimpan di dalam lemari pendingin
dengan suhu 2-8 °C. Penyimpanan ekstrak berfungsi untuk menjaga
kualitas dari ekstrak dan untuk menghindari kerusakan zat aktif serta untuk
menghindari dari jamur atau mikroba. Kemudian ekstrak kayu siwak
(Salvadora persica L.) dan ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz
& Pav.) yang di dapat dihitung bobot rendemennya dengan cara bobot
ekstrak dibagi dengan bobot serbuk dikali 100%.
PENGGUNAAN Na-CMC (GELLING AGENT) DALAM ...Van Fatkhan Sofyan, FARMASI. UMP 2017
5. Identifikasi senyawa
a. Saponin (Depkes RI, 1979)
Sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 10 ml
air, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Positif jika terbentuk
buih kurang dari 10 menit.
b. Flavonoid (Harbone, 1987)
Sampel dicampur dengan 5 ml etanol, dikocok, dipanaskan, dikocok
lagi kemudian disaring, dan ditambahkan Mg 0,2 g serta 3 tetes HCL
pekat pada masing-masing filtrat. Terbentuknya warna merah pada
lapisan etanol menunjukkan adanya flavonoid.
c. Tanin (Rahman, 2009)
Sebanyak 10 g serbuk ditambah 10 ml air, didihkan selama 15
menit, setelah dingin kemudian di saring dengan kertas saring. Filtrat
ditambah 1-2 tetes FeCl 1%, terbentuknya warna biru, hijau atau hitam
menunjukkan adanya senyawa golongan tanin.
6. Pembuatan sediaan pasta gigi
a. Komponen formula
Tabel 3.1. Komponen Formula
Bahan
Ekstrak kayu siwak
Ekstrak daun sirih merah
Na-CMC
CaCO3
Gliserin
Na-Lauril sulfat
Na-sakarin
Oleum menthae piperitae
Metil paraben
Propil paraben
Akuades
(Nursal, 2010)
1
5%
5%
0,5%
30%
25%
2%
0,2%
0,5%
0,18%
0,02%
ad 100%
Formula
2
3
5%
5%
5%
5%
1,0%
1,5%
30%
30%
25%
25%
2%
2%
0,2%
0,2%
0,5%
0,5%
0,18%
0,18%
0,02%
0,02%
ad 100% ad 100%
4
5%
5%
2,0%
30%
25%
2%
0,2%
0,5%
0,18%
0,02%
ad 100%
b. Pembuatan formulasi
Formula pasta gigi ekstrak kayu siwak (Salvadora persica L.) dan
ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) sebanyak 50 g.
Kemudian timbang semua bahan yang akan digunakan, panaskan mortir
dan stamper. Kemudian Na-CMC dimasukkan dengan cara ditaburkan
diatas gliserin secukupnya didalam mortir panas sehingga homogen dan
PENGGUNAAN Na-CMC (GELLING AGENT) DALAM ...Van Fatkhan Sofyan, FARMASI. UMP 2017
tidak terdapat gumpalan, selanjutnya melarutkan metil paraben dan
propil paraben dengan gliserin secukupnya di atas kaca arloji kemudian
masukan ke dalam campuran. Ekstrak kayu siwak (Salvadora persica
L.) dan ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
dimasukkan kedalam campuran diaduk sampai halus dan homogen,
tambahkan CaCO3 sedikit demi sedikit dengan akuades kemudian aduk
sampai halus dan homogen. Na-Sakarin yang telah dilarutkan dengan
sisa gliserin dimasukkan ke dalam campuran sampai homogen. NaLauril sulfat yang telah dilarutkan dengan sisa gliserin dimasukkan
kedalam campuran sediaan dan diaduk dengan kecepatan rendah.
Oleum menthae piperatae ditambahkan ke dalam campuran tersebut
lalu diaduk hingga homogen, sediaan yang telah jadi kemudian
dimasukkan ke dalam wadah, setiap formula direplikasi 3 kali (Nursal,
2010).
7. Evaluasi pasta gigi
a. Organoleptis (SNI)
Pemeriksaan sediaan pasta dilakukan uji organoleptis meliputi
pemeriksaan warna, bau, homogenitas sediaan. Sediaan dapat dikatakan
stabil jika bau, warna dan homogenitas secara visual sama seperti
setelah pembuatan dan tidak ditumbuhi jamur, diamati selama 28 hari
(Sanja., 2011).
b. Homogenitas
Pasta gigi dioleskan di atas kaca objek, ditutupi dengan cover glass,
diamati secara visual. Homogenitas sediaan diamati dari permukaan
yang terbentuk pada kaca objek.
Pasta pada masing-masing formula diambil 1 g dan dioleskan pada
plat kaca, diraba, dan digosokkan. Masa pasta harus menunjukkan
susunan homogen yaitu tidak terasa adanya bahan padat pada kaca
(Sanja., 2011).
PENGGUNAAN Na-CMC (GELLING AGENT) DALAM ...Van Fatkhan Sofyan, FARMASI. UMP 2017
c. Pengukuran pH
Sebanyak 0,5 g pasta diencerkan dengan 5 ml akuades, kemudian
pH stik dicelupkan selama 1 menit. Perubahan warna yang terjadi pada
pasta menunjukkan nilai pH dari pasta (Naibaho et al., 2013).
d. Pengukuran tinggi busa (Rieger., 1985)
1) Pengukuran tinggi busa dalam air suling (Akuades)
Tinggi busa dari 0,1% larutan sediaan dalam air suling, dapat
diukur menggunakan gelas ukur. Pengukuran dilakukan dengan
menggunakan metode sederhana yang akan menghasilkan hasil
yang dapat disamakan dengan tes Ros miles antara lain: 25 ml
larutan dimasukkan ke dalam gelas ukur 100 ml, kocok dengan cara
membalikkan gelas ukur lebih dari 5 kali, lalu segeralah amati
tinggi busa yang dihasilkan.
2) Pengukuran tinggi busa dalam air sadah
Prosedur serupa dengan pengukuran tinggi dan stabilitas busa
dalam air suling. Namun air yang digunakan merupakan air sadah
yang dibuat dengan melarutkan 0,233 g kalsium karbonat dan 0,116
g magnesium karbonat dalam air suling sedikit demi sedikit dan
ditambahkan HCL setetes demi setetes hingga larut dalam labu ukur
1000 ml, dan ditambahkan akuades hingga tanda pada labu ukur.
e. Uji pemisahan fase (Lachman et al., 1994)
1) Metode sentrifugasi
Sampel dimasukkan di dalam tabung sentrifugal, kemudian alat
diatur dengan kecepatan 3750 rpm selama 5 jam.
2) Metode freeze thaw (Uji Stabilitas)
Siklus pemisahan fase dengan metode freeze thaw pada sediaan
pasta gigi dilakukan selama 6 siklus. Uji ini dilakukan dengan
menyimpan sediaan sebanyak 8 g pada suhu 4 °C selama 24 jam,
kemudian sediaan dipindahkan ke suhu 45 °C selama 24 jam (1
siklus).
PENGGUNAAN Na-CMC (GELLING AGENT) DALAM ...Van Fatkhan Sofyan, FARMASI. UMP 2017
f. Viskositas (Lachman et al., 1994)
Viskositas
sediaan
pasta
gigi
diukur
dengan
menggunakan
Viskometer Brookfield pada kecepatan 50 rpm dengan menggunakan
spindle nomor 64 (Olii, 2013). Hasil viskositas dicatat setelah viskotester
menunjukkan angka yang stabil. Viskositas diukur selama 28 hari.
8. Uji aktivitas antibakteri
a. Sterilisasi alat dan bahan
Sterilisasi
merupakan
proses
penghilangan
semua
jenis
mikoorganisme hidup (protozoa, fungi, bakteri, mikoplasma, virus)
yang terdapat di dalam suatu benda. Pada uji antibakteri perlakuan
harus dalam keadaan steril, sehingga semua alat dan bahan yang akan
dipergunakan juga harus dalam keadaan steril. Kesterilan dari alat dan
bahan harus dijaga agar media yang digunakan tidak terkontaminasi
oleh mikrorganisme lain yang dapat mempengaruhi hasil uji aktivitas
antibakteri. Cara untuk mensterilkan alat dan bahan yaitu dengan
sterilisasi basah menggunakan autoklaf. Autoklaf dapat membunuh
mikroorganisme pada suhu 121 °C pada tekanan 1 atm selama 15
menit. Selain dengan autoklaf, ose disterilkan dengan pembakaran
menggunakan api langsung (Ari, 2008).
b. Pembuatan media NA (Nutrien Agar)
Media NA (Nutrien Agar) digunakan sebagai media padat
pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Membuat media agar NA
yaitu sebanyak 2,3 g serbuk NA dimasukkan kedalam erlenmeyer lalu
dilarutkan dalam 100 ml akuades. Lalu dipanaskan diatas hot plate
sambil diaduk sampai mendidih kemudian masukkan kedalam tabung
reaksi masing-masing tabung berisi 7 ml, disterilkan dengan
menggunakan autoklaf dengan suhu 121 ⁰C selama 15 menit dengan
tekanan 2 atm, lalu didiamkan dalam suhu kamar sampai membeku
sebagian pada posisi miring. Dan sebagian pada posisi tegak, kemudian
disimpan dalam lemari pendingin (Kaliyah, 2015).
PENGGUNAAN Na-CMC (GELLING AGENT) DALAM ...Van Fatkhan Sofyan, FARMASI. UMP 2017
c. Pembuatan media NB (Nutrien Broth)
Media NB (Nutrien Broth) digunakan sebagai media cair untuk
pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans pada pembuatan suspensi
bakteri. Membuat media NB yaitu masing-masing tabung berisi
sebanyak 0,8 g serbuk NB dimasukkan kedalam erlenmeyer lalu
larutkan dalam 100 ml akuades, lalu dipanaskan diatas hot plate sambil
diaduk sampai mendidih, lalu disterilkan dengan menggunakan autoklaf
dengan suhu 121 ⁰C selama 15 menit, kemudian masukkan kedalam
tabung reaksi masing-masing 7 ml, lalu didiamkan dalam suhu kamar
sampai membeku pada posisi miring, kemudian disimpan dalam lemari
pendingin (Kaliyah, 2015).
d. Peremajaan isolat bakteri
Penanaman isolat Streptococcus mutans dalam medium NB
dilakukan dengan cara isolat Streptococcus mutans yang berasal dari
stok diambil dengan jarum ose steril lalu disuspensikan kedalam tabung
reaksi yang berisi NB secara aseptik, kemudian di inkubasi pada suhu
37 ⁰C selama 24 jam. Inkubasi dilakukan pada suhu optimum yaitu 37
⁰C selama 24 jam. Inkubasi merupakan suatu teknik perlakuan bagi
mikroorganisme yang telah diinokulasi pada media. Bakteri yang
diinkubasi disimpan didalam inkubator pada suhu tertentu. Pada hal ini
penyimpanan dilakukan pada suhu 37 ⁰C karena pada suhu tersebut
bakteri Streptococcus mutans akan tumbuh pada waktu 18-24 jam.
Apabila penyimpanan tidak sesuai dengan suhu yang dikehendaki
biasanya bakteri tidak akan tumbuh (Hadioetomo, 1985).
e. Pembuatan suspensi isolat bakteri Streptococcus mutans
Bakteri
yang dibiakan
pada
media
agar
diambil
dengan
menggunakan jarum ose steril kemudian ditanam pada media
pertumbuhan NA miring dan diinkubasi pada 37 ⁰C selama 24 jam.
Bakteri Streptococcus mutans diambil satu sampai dua ose dilarutkan
dalam media cair yaitu media NB (Nutrien Broth) yang dilakukan di
dalam Laminar Air Flow. Kemudian diinkubasi pada suhu optimum
yaitu 37 ⁰C selama 24 jam. Media NB (Nutrien Broth) merupakan
PENGGUNAAN Na-CMC (GELLING AGENT) DALAM ...Van Fatkhan Sofyan, FARMASI. UMP 2017
media cair untuk pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Pada
pembuatan suspensi bakteri, media NB (Nutrien Broth) yang sudah
ditanam selama 24 jam, bakteri uji diukur serapannya dengan
menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm
sampai memberikan absorbansi 0,1 (setara dengan 1,5x108 CFU/ml)
(Tiara, 2014).
f. Uji aktivitas antibakteri
Sebagai ukuran aktivitas anti mikrobanya maka dilakukan
pengukuran zona hambat berupa area bening disekitar sumuran dengan
menghitung diameter hambatnya menggunakan jangka sorong. Lakukan
replikasi sebanyak 3 kali. Semakin besar atau luas zona hambatnya
maka semakin kuat aktivitas antibakterinya.
Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi agar
dengan sumuran. Suspensi bakteri ditambahkan kedalam media padat
NA, lalu diputar supaya homogen, didinginkan dan menjadi padat
dalam cawan petri steril, kemudian dibuat sumur dengan diameter 6
mm dengan menggunakan perforator, setelah itu dimasukkan 50 mg
masing-masing sampel dan pembanding. Kemudian diinkubasi pada
suhu 37 °C. Diameter hambat diamati setelah periode inkubasi.
Semakin besar atau luas zona hambat maka semakin kuat aktivitas
antibakterinya. Lakukan replikasi 3 kali (Fulviana, 2013).
9. Analisis hasil
Berdasarkan data dari hasil uji sifat fisik organoleptis, homogenitas
analisis yang digunakan adalah analisis deskriptif. Uji tinggi busa, uji
pemisahan fase, uji pH, uji viskositas, dan uji aktivitas antibakteri
menggunakan analisis statistik yang digunakan adalah analisis statistik one
way ANOVA pada taraf kepercayaan 95% (α= 0,05) untuk melihat adanya
perbedaan atau tidak menggunakan program SPSS versi 16 for windows.
PENGGUNAAN Na-CMC (GELLING AGENT) DALAM ...Van Fatkhan Sofyan, FARMASI. UMP 2017