BAB 3 METODE PENELITIAN

21
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1.Alat – Alat
NamaAlat
Merek
- Tabung Reaksi Steril
Pyrex
- Cawan Petri Steril
Iwaki
- Pipet Ukur 2 ml Steril
Pyrex
- Gelas Ukur 50 ml Steril
Kimax
- Gelas Ukur 10 ml Steril
Kimax
- Erlenmyer 250 ml Steril
Iwaki
- Bunsen
-
- Jarum Ose
-
- Rak Tabung Reaksi
-
- Autoklaf
Autoclave Electric
- Oven
Sharp- E0-18 LW
- conony Counte
Scepter
- Spatula
-
Universitas Sumatera Utara
22
- Inkubator
Exterior CB 150 dimension 680
- Hot plate
-
- Biological Safety Cabinet
-
3.2. Bahan
- Amylum Maydis
- Lactose Broth
- Media TSA (Tripple Sitrat Agar)
- NaCl 0,9%
- Media EMBA (Eosin Methylen Blue Agar)
- Aquadem
3.3.
Prosedur Percobaan
3.3.1. Pembuatan Media Lactose Broth ( LB )
Prosedur
Ambil 13 garam lactose broth dalam 1 liter aquadem,dipanaskan
aquadem terlebih dahulu,kemudian dilarutkan dengan aquadem yang
telah dipanaskan sambil diaduk hingga merata,kemudian dipanaskan
diatas hot plate.
Universitas Sumatera Utara
23
3.3.2. Pembuatan Media Eosin Methylen Blue Agar ( EMBA )
Prosedur
Ambil 10 gram Eosin Methylen Blue Agar dalam1 liter Aquadem,
dilarutkan dengan aquadem mendidih sebanyak 1 liter,kemudian
sterilkan media dengan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit 1
atm,selanjutnya tuang media sebanyak 15 ml kedalam cawan petri,
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30-35ºC.
3.3.3. Pembuatan Uji Batas Mikroba
Prosedur
Timbang 10 gram Amylum Maydis dalam beaker glass steril, larutkan
dengan Media Lactose Broth sebanyak 100 ml sedikit demi sedikit,
kemudian tuang kedalam cawan petri steril inkubasi selama 48 jam
pada suhu 35 – 37ºC,lalu digores Media EMBA setelah 48 jam yang
telah memadat,selanjutnya dibungkus dengan kertas partament
inkubasi petri dalam keadaan terbalik selama 48 jam pada suhu 3537ºC, kemudiaan diamati ada tidaknya bakteri Escherichia Coli
dengan melihat adanya perubahan warna biru hitam kilau logam yang
khas.
Universitas Sumatera Utara
24
3.3.4. Pembuatan Media Lactose Broth ( LB )
Prosedur
Ambil 13 gram Lactose Broth dalam 1 liter Aquadem, dipanaskan
aquadem terlebih dahulu,kemudian dilarutkan dengan aquadem yang
telah dipanaskan sambil diaduk hingga merata, kemudian dipanaskan
diatas hot plate.
3.3.5. Pembuatan Media Tripple Sitrat Agar ( TSA )
Prosedur
Ambil 13 gram Media Tripple Sitrat Agar
dalam 1 litern
aquadem,panaskan aquadem terlebih dahulu, kemudiaan dilarutkan
dengan aquadem sebanyak 1 liter dan diaduk hingga merata,
selanjutnya dipanaskan diatas hot plate.
3.3.6. PembuatanUji Angka Lempeng Total
Prosedur
Timbang 10 gram Amylum Maydis dalam Erlenmeyer steril,
tambahkan media Lactose Broth Cair aduk hingga merata, kemudian
tuang kedalam petri steril dan tuang Media TSA sebanyak 15 ml, lalu
masukkan kedalam inkubator pada suhu 35-37ºC, selanjutnya inkubasi
selam 3 hari untuk Uji ALT, kemudiaan dihitung jumlah koloni yang
tumbuh dengan melihat adanya warna merah bata.
Universitas Sumatera Utara
25
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil
4.1.1. Tabel
Hasil Identifikasi Bakteri Escherichia coli terhadap bahan baku
Amylum Maydis dapat dilihat pada table di bawah ini:
NO
Pemeriksaan
Persyaratan
Hasil
1
Pemerian
Serbuk sangat halus, putih Serbuk
sangat
halus,
( 1-9 )
atau putih kekuningan
atau
putih
putih
kekuningan
2
Kelarutan
Praktis tidak larut dalam air Praktis tidak larut dalam
( 1-9 )
dingin dan dalam etanol
air dingin dan dalam
etanol
3
Angka
Maks. 1000 cfu/g
40 cfu/g
Lempeng Total
( 1-9 )
4
Uji
Batas Tidak
Mikroba
5
Identifikasi
mengandung
Escherichia Coli
Memenuhi Pengujian
bakteri Tidak
mengandung
bakteri Escherichia Coli
Memenuhi Pengujian
Universitas Sumatera Utara
26
4.2. Pembahasan
4.2.1 Tabel Perhitungan Angka Lempeng Total
Jumlah Koloni yang tumbuh
Hari/Tanggal Sampel
28 – 12
Jumlah Koloni
- Aylum
2015
Maydis
1 – 1 – 2016
Amylum
10‾¹
10‾²
Tidak ada koloni yang
Tidak ada koloniyang
tumbuh
tumbuh
40
25
15
45
10
25
50
100
50
Maydis
Rumus untuk perhitungan koloni
Faktor Pengenceran = Pengenceran × Jumlah Koloni
1. 10‾¹ = 8
= 8 × 10 =80 : 2 = 40
2. 10‾¹ = 5
= 5 × 10 = 50 : 2 = 25
3. 10‾¹ = 3
= 3 × 10 = 30 ; 2 = 15
4. 10‾¹ = 9
= 9 × 10 = 90 : 2 = 45
Universitas Sumatera Utara
27
5. 10‾¹ = 2
= 2 × 10 = 20 : 2 = 10
6. 10‾¹ = 5
= 5 × 10 = 50 : 2 = 25
7. 10‾² = 1
= 1 × 100 = 100 : 2 = 50
8. 10‾² =2
= 2 × 100 = 200 : 2 = 100
9. 10‾² = 1
= 1 × 100 = 100 : 2 = 50
Jadi jumlah seluruh koloni yang tumbuh : jumlah perlakuan360 : 9 = 40 cfu/g.
Identifikasi bakteri Escherichia Coli terhadap bahan baku Amylum Maydis
dilakukan dengan pemerian sebanyak 9 kali yang menghasilkan serbuk sangat
halus berwarna putih dan putih kekuningan,kelarutan tidak larut dalam air dingin
dan etanol tetapi larut dalam air panas /mendidih, ,selanjutnya dilakukan dengan
dua metode yaitu Uji Angka Lempeng Total dan Uji Batas Mikroba untuk
melihat adanya jumlah koloni dan bakteri Escherichia Coli pada bahan baku
amylum maydis dan identifikasi telah memenuhi syarat dan standart Farmakope
Edisi V.
Pada pengujian Angka Lempeng Total digunakan media Lactose Broth
(LB) sebagai pengencer suspense dan menggunakan media Tripple Sitra Agar
(TSA) sebagai media padatnya, pengujian Angka Lempeng Total ini harus
dilakukan secara steril dan aseptik, dipipet 1 ml sampel yang telah disuspensi
kedalam tabung reaksi steril yang telah berisi 9 ml NaCl 0,9% dan
Universitas Sumatera Utara
28
dihomogenkan selama 30 detik sehingga diperoleh suspense dengan pengenceran
10‾ ¹ , disiapkan 5 tabung masing – masing terdiri dari 9 ml NaCl 0,9%.hasil dari
homogenisasi pada penyiapan sampel yang merupakan pengenceran 10‾¹ dipipet
sebanyak 1 ml kedalam tabung reaksi pertama dikocok homogen hingga
pengenceran 10‾² dibuat pengenceran selanjutnya dari setiap pengenceran dipepit
1 ml kedalam cawan petri.dituangkan media Tripple Sitrat Agar (TSA) sebanyak
15
ml
cawan
petri
digoyang
dan
diputar
hingga
suspense
merata
seluruhnya,setelah media memadat cawan diinkubasi pada suhu 35 – 37 ºC
selama 24 jam dengan posisi terbalik, setelah itu jumlah koloni yang tumbuh
diamati dan dihitung.
Besarnya jumlah koloni tercemar dalam sampel ( amylum maydis )
tersebut dapat disebabkan akibat proses pembuatan sampel yang kurang
memperhatikan unsur sanitas dan higenis, dapat pula diakibatkan oleh adanya
kontaminasi mikroba pada saat pengerjaan atau pemeriksaan.kurangnya
kebersihan dari wadah sangat mempengaruhi besarnya jumlah kontaminan
mikroba pada sampel ( bahan baku amylum maydis ).
Kontaminasi dapat terjadi dari proses awal pembuatan sampel, yaitu
melalui proses penyiapan bahan yang tidak steril hingga proses distribusi dan
penjualan pada konsumen, dimana faktor lingkungan terutama area pengujian
yang tidak steril memberikan peran cukup besar pada kontaminasi sampel oleh
mikroba yang terdapat pada udara.berdasarkan ketentuan farmakope edisi V pada
uji angka lempeng total ini masih sesuai dengan standart dimana batas koloni
sebanyak 10 – 150 cfu/g dan koloni yang diperoleh pada pengujian ini sebanyak
40 cfu/ g.
Universitas Sumatera Utara
29
Dalam proses ini prosedur Uji Batas Mikroba Sampel yang ditimbang
adalah bahan baku amylum maydis sebanyak 10 gram ,kemudian dimasukkan
kedalam beaker glass steril lalu dilarutkan dengan media lactose broth sebanyak
100 ml dan dikocok hingga homogeny, kemudian media dituang kedalam cawan
petri steril,diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 – 37 ºC, setelah media
memadat digores dengan media EMBA ,lalu dibungkus dengan kertas partament,
kemudiaan diinkubasi selama 48 jam dalam keadaan petri terbalik pada suhu 3537 ºC ,setelah itu diamati ada tidaknya bakteri Escherichia Coli dengan melihat
adanya warna biru hitam kilau logam.Berdasarkan standart farmakope jilid V
untuk pemeriksaan bahan baku amylum maydis harus bebas dari bakteri
Escherichia Coli karena bakteri ini dapat menyebabkan penyakit seperti:
1. infeksi saluran kemih
E coli adalah penyebab utama infeksi saluran kemih ( ISK ) dan diperkirakan
sekitar 90% ISK pada wanita muda disebabkan oleh E Coli.
Gejala – gejala ISK antara lain adalah poliuria, dissuria, hematuria, dan piuria
serta serta nyeri panggul berhubungan dengan infeksi saluran kemih bagian
atas. ISK dapat menyebabkan bakterimia dengan tanda klinis sepsis.terjadinya
gangguan ginjal berhubungan dengan E Coli.
2. diare
-
E Coli yang menyebabkan diare diklasifikasikan berdasarkan karakteristik
sifat – sifat virulensannya dan setiap grup menyebabkan penyakit melalui
mekanisme yang berbeda.
Universitas Sumatera Utara
30
-
E Coli enteropatogen ( EPEC ) merupakan penyebab diare terpenting pada
bayi, terutama dinegara yang sedang berkembang.
-
E Coli enterotoksigenik ( ETEK ) merupakan penyebab diare pada pelancong
(traveller’s diarrhea ).
-
E Coli enterohemogarik ( EHEK ) dan jalur yang memproduksi verotoxin
(VTEX) di amerika serikat menyebabkan sejumlah kejadian luar biasa diare,
colitis hemogarik dan HUS. Colitis hemogarik dan HUS merupakan
komplikasi dari diare ringan yang pertama kali pada anak- anak umur pra
sekolah dan penderita dewasa.sumber infeksi dapat berasaldari daging dan
poduk hewan seperti susu dan humburger.
-
E Coli enteronvasif ( EIEC ) menyebabkan penyakit yang sangat mirip dengan
shigellosis. Penyakit ini paling banyak terjadi pada anak – anak dinegara yang
sedang berkembang dan pada para pelancong.
-
E Coli enteroagregatif ( EAEC ) menyebabkan diare akut dan kronik pada
orang- orang dinegara yang sedang berkembang.
3. Sepsis
E Coli bisa masuk peredaran darah dan menyebabkan sepsis.Bayi – bayi
yang baru lahir sangat peka terhadap sepsis disebabkan E Coli karena mereka
tidak memiliki antibody IgM.Sepsis bisa terjadi sebagai efek sekunder dari ISK.
4. Meningitis
E Coli merupakan penyebab utama meningitis pada bayi, disamping
stereptokokus grup B. kurang lebih 75 % E Coli dari kasus meningitis memiliki
antigen KI, antigen ini bisa bereaksi silang dengan polisakarida kapseluler grup B
dari neisseria meningitis.
Universitas Sumatera Utara
31
Sehingga pada pengujian Identifikasi Bakteri Escherichia Coli Terhadap
Bahan Baku Amylum Maydis didapat jumalah koloni sebanyak 40 cfu/g dengan
melihat adanya warna merah bata dan koloni ini masih sesuai dengan standart
farmakope edisi V dimana dalam buku tersebut,koloniyang diperbolehkan itu
berjumlah sebanyak 10 – 150 cfu/gkoloni tersebut didapat karena terjadinya
kontaminasi udara maupun ruangan yang kurang steril dan bersih.Pada pengujian
Batas Mikroba tidak diperoleh atau ditemukan bakteri Escherichia coli yang
menunjukkan adanya perubahan warna biru hitam kilau logam yang kahas, ini
dikarenakan pengujian yang memenuhi standart sesuai dengan Farmakope Edisi V
dimana pada saat pengujian harus steril dan ruangan tidak terkontaminasi oleh
bakteri lain dan pengujian Batas Mikroba ini dilakukan didalam ruang Unit Safety
Cabinet yaitu ruang Uji yang steril dan memasuki ruangan ini harus memakai
berbagai macam alat dan pakaian yang steril.
Universitas Sumatera Utara
32
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
-
Dapat disimpulkan bahwa koloni yang tumbuh pada media TSA ( Tripple
Sitrat Agar) sebanyak 40 cfu/g dengan melihat adanya warna merah bata.
-
Hasil yang diperoleh pada uji Batas Mikroba tidak terdapat bakteri
Escherichia coli dengan melihat adanya warna biru hitam kilau logam.
5.2. Saran
Dalam pengolahan bahan baku amylum maydis sebaiknya pemeriksaan
terhadap bakteri Escherichia coli perlu di perhatikan karena dengan uji batas
mikroba kita dapat mengetahui kualitas dari bahan baku tersebut.
Universitas Sumatera Utara