bahan dan metode

13
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai bulan Januari sampai dengan Juli 2010 di
Laboratorium Farmasi, Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi, Kandang
Hewan Coba Bagian Farmakologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan
Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan antara lain tikus putih, pakan, air, daun
Mimba (Azadirachta indica juss), etil asetat, pereaksi Meyer, HgCl2, KI, pereaksi
Dragendorf, bismut subnitrat, pereaksi Wagner, I2, kloroform, NH4OH, H2SO4
2M, serbuk Mg, HCl pekat, pereaksi Lieberman-Burchard, H2SO4 pekat, FeCl3,
gelatin, NaOH 1 N, NaCl 0.90 %, aquades, aloksan, glibenklamid, alkohol 70%.
Alat yang digunakan antara lain syringe 1 ml, tempat makan dan minum,
kandang, lampu, kipas angin, timbangan gram kasar, botol ekstrak, maserator,
lemari pengering, Mesh 20, gelas ukur, corong, cawan porselen, batang pengaduk,
lap, spidol, stiker label, kapas, tisu, Blood Glucose Meter merk Finetest
TM
, strip
glukosa.
Metode Penelitian
Pembuatan Simplisia
Daun mimba diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat
(BALITRO). Bagian yang digunakan adalah daun yang sudah tua. Daun mimba
dibersihkan dari kotoran yang menempel, kemudian dicuci dengan air mengalir
sampai bersih dan ditiriskan. Daun mimba dikeringkan dengan lemari pengering
pada suhu 40 °C selama empat hari. Daun yang telah kering dipisahkan dari
pengotornya kemudian digiling dan diayak sehingga diperoleh serbuk simplisia
dengan ukuran Mesh 20.
Pembuatan Ekstrak Etil Asetat Daun Mimba
Ekstraksi daun mimba kering dilakukan dengan metoda maserasi. Daun
mimba kering sebanyak 50 g dimasukan ke dalam maserator ditambah etil asetat
14
sebanyak 500 ml dan direndam selama 24 jam, setiap 6 jam dilakukan
pengadukan. Disaring dan ditampung di dalam tabung. Proses ini dilakukan
pengulangan 2 kali. Hasil saringan dipekatkan dengan menggunakan rotary
evaporator pada suhu 40 °C dan 50 rpm yang bertujuan menguapkan pelarutnya
hingga berupa ekstrak kental. Setelah itu ditimbang rendemennya.
Penapisan Fitokimia
Kandungan senyawa organik yang umum diidentifikasi adalah alkaloid,
tanin, flavonoid, saponin, steroid, dan triperpenoid.
Uji Alkaloid. Digunakan tiga pereaksi untuk uji alkaloid, yaitu pereaksi
Meyer, pereaksi Dragendroff, dan pereaksi Wagner. Pereaksi Meyer dibuat
dengan melarutkan 1,36 g HgCl2 dalam 60 ml aquades, dicampur dengan larutan 5
g KI dalam 10 ml aquades, dan diencerkan sampai 100 ml dengan aquades.
Pereaksi Dragendorf dibuat dengn melarutkan 8 g KI dalam 20 ml aquades,
dicampur dengan larutan 0,85 g bismut subnitrat dalam 40 ml aquades dan
diencerkan sampai 100 ml dengan aquades. Pereaksi Wagner dibuat dengan
melarutkan 2 g KI dalam 40 ml aquades, ditambah 1 g I2 dan dikocok sampai
homogen, diencerkan dengan aquades sampai 100 ml.
Sebanyak 1 ml ekstrak etil asetat daun mimba ditambah 10 ml kloroform
dan 3 tetes NH4OH dalam tabung reaksi. Ekstrak kloroform dipisah dan diberi 10
tetes H2SO4 2M. Lapisan asam dipisah ke dalam 3 bagian ditetesi pereaksi Meyer,
Dragendorf dan Wagner. Terdapatnya alkaloid ditandai dengan terbentuknya
endapan putih oleh pereaksi Meyer, endapan merah oleh pereaksi Dragendorf dan
endapan coklat oleh pereaksi Wagner.
Uji Flavonoid. Sebanyak 2 ml ekstrak etil asetat daun mimba dimasukkan
ke dalam air mendidih selama 5 menit. Ditambah serbuk Mg, 1 ml HCl pekat dan
20 tetes alkohol lalu dikocok kuat. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga
menunjukkan terdapatnya senyawa flavonoid.
Uji Terpenoid dan Steroid. Sebanyak 1 ml ekstrak etil asetat daun
mimba dimaserasi dengan 10 ml eter selama 10 menit. Lapisan eter dipisah lalu
ditambah 3 tetes pereaksi Lieberman-Burchard dan 1 tetes H2SO4 pekat.
Terbentuknya warna merah atau ungu menunjukkan kandungan triterpenoid
sedangkan warna hijau atau biru menunjukkan kandungan steroid.
15
Uji Saponin. Sebanyak 2 ml ekstrak etil asetat daun mimba dikocok
selama 15 detik. Timbulnya busa hingga selang waktu 10 menit menunjukkan
adanya saponin.
Uji Tanin. Sebanyak 1 ml ekstrak etil asetat daun mimba ditambah 2 tetes
FeCl3. Terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan
terdapatnya tanin.
Uji Kuinon. Sebanyak 5 ml larutan ekstrak etil asetat daun mimba
ditambahkan gelatin kemudian disaring filtratnya dan ditambahkan NaOH 1 N.
Jika terbentuk warna merah berarti mengandung kuinon.
Pengujian Aktivitas Antihiperglikemik
Penelitian mengenai aktivitas antihiperglikemik dari daun mimba ini
dilakukan dengan menggunakan 18 ekor tikus putih jantan galur Sparaque dawley
berumur 4-5 bulan, dengan bobot badan 180-280 gram. Tikus ini dibagi dalam 6
kelompok, setiap kelompok terdiri dari 3 ekor tikus. Perlakuan untuk masingmasing kelompok adalah :
1.
Kelompok kontrol normal (K1) : tikus disuntik dengan NaCl 0.90 % dan
dicekok aquades.
2.
Kelompok kontrol negatif (K2) : tikus disuntik aloksan dan dicekok
aquades.
3.
Kelompok kontrol positif (K3) : tikus disuntik aloksan dan dicekok obat
glibenklamid dosis 3,5 x 10-6 mg/kgBB.
4.
Kelompok perlakuan (KP1, KP2, KP3) : tikus disuntik aloksan dan dicekok
ekstrak etil asetat daun mimba dengan dosis 30, 60, 90 mg/kgBB.
Kelompok selain K1 ditingkatkan kadar glukosa darahnya dengan cara
disuntik aloksan dosis 150 mg/kgBB sampai terjadi hiperglikemia secara
intraperitonial. Penyuntikan aloksan dilakukan pada hari ke-0 dan perlakuan
diberikan pada hari ke-6 sampai hari ke-10 (Wardhana 2005).
Pengukuran Glukosa Darah
Konsentrasi glukosa darah diukur sebanyak 3 kali, yaitu sebelum percobaan
(hari ke-0), setelah pemberian aloksan (hari ke-6), dan setelah pemberian obat
16
antihiperglikemik/ekstrak etil asetat daun mimba (hari ke-10). Pengukuran darah
pada hari ke-6 bertujuan untuk mengetahui apakah sudah terjadi peningkatan
kadar glukosa darah dan pengukuran pada hari ke-10 untuk mengetahui kadar
glukosa darah setelah diberi perlakuan. Pengukuran glukosa darah tikus dilakukan
setelah tikus dipuasakan selama ± 16 jam. Glukosa darah tikus diukur
menggunakan Blood Glucose Meter merk Finetest
TM
. Caranya dengan setetes
darah tikus yang berasal dari ujung ekor diteteskan pada strip glukosa yang telah
dimasukkan dalam glukometer. Sebelumnya pada glukometer dilakukan
penyesuaian kode yang tertera pada kemasan strip glukosa. Setelah darah
diteteskan pada strip, ditunggu selama 9 detik untuk menunggu hasil pembacaan
konsentrasi glukosa darah oleh glukometer. Nilai yang tertera pada glukometer
merupakan nilai konsentrasi glukosa darah dengan satuan mg/dL.
Pengukuran Bobot Badan
Bobot badan diukur 4 kali, yaitu saat tikus mulai dipelihara, sebelum
pemberian aloksan (hari ke-0), setelah pemberian aloksan (hari ke-6), dan setelah
pemberian perlakuan (hari ke 10). Pengukuran bobot badan menggunakan
timbangan gram kasar.
Analisis statistik
Data hasil uji pengukuran efek antihiperglikemik diolah secara statistika
menggunakan uji sidik ragam ANOVA yang dilanjutkan dengan uji wilayah
berganda Duncan untuk melihat ada tidaknya perbedaan. Adapun model tersebut
ialah :
Yij
= µ + αi +εij
Keterangan :
µ
= pengaruh rataan umum
αi
= pengaruh perlakuan ke –i i= 1,2,3,4,5,6
εij
= pengaruh galat perlakuan ke =i dan ulangan ke-j, j= 1,2,3,4
Yij
= pengamatan perlakuan ke-i dan ulangan ke-j