Perlakuan Tripsin dan Pronase terhadap Perkembangan Embrio

Media Kedokteran Hewan
Vol. 23, No. 3, September 2007
Perlakuan Tripsin dan Pronase terhadap Perkembangan Embrio Mencit
yang Dicemari dengan Escherichia coli K99
Trypsin and Pronase Treatment on the Development of Mouse Embryos
Contaminated by K99 Escherichia coli
I Wayan Batan 1, Arief Boediono 2, Ita Djuwita2, Bibiana Widiati Lay 3, dan Supar4
1Bagian Klinik Hewan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana,
Jalan Raya Sesetan Gang Markisa 6 Denpasar Bali 80232. Telp./Fax. 0361-8423062
2Dept Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, 3Dept Ilmu Penyakit Hewan F KH IPB,
Jl. Agatis Kampus IPB Dramaga Bogor 16680
4Balai Besar Penelitian Veteriner Jl. Martadinata No 30, Bogor 1611
email : [email protected]
Abstract
The objectives of this studies wer e to investigate the effect of washing on development of
embryos wich experimentally exposed with K99 E.coli. The embryos were exposed to K99 E.coli in
appropriate amount of 10 3 CFU/ml and then incubated at 37 0C for an hour, then they were devided
into three groups. The first group were washed with mPBS and KSOM, the se cond group of embryo
were treated with trypsin for 90 second, the third group were treated with pronase for 60 second. Each
group of the embryos were washed 6 times in mPBS and 4 times in KSOM, Thereafter, the embryos
were cultured in the drops of KSOM wit hout antibiotic and incubated in incubator 5% CO 2 at
370C. The development embryos were observed every six hours interval for 48 hours period. The
result of this studies showed that the development of pronase treated embryos were better than that of
the mPBS washing and the trypsin treated. In conclussion of the present studies show that the
development of embryos could be influenced by the K99 E.coli contaminated medium. Trypsin and
pronase treatment could minimize the negative effect of K99 E.coli on embryos under in vitro
conditions.
Key words: embryos, K99 E.coli, contaminated, trypsin, and pronase

Pendahuluan
Banyak agen penyebab penyakit dapat ditular kan
atau mencemari embrio pada percobaan -percobaan
manipulasi embrio, seperti virus blue tongue, virus
penyakit mulut dan kuku, bovine herpes virus-1, bovine
viral diarrhea (Vanroose, 1999; Stringfellow dan
Givens, 2000; Kafi et al., 2002); bakteri Leptospira
borgpetersenii (Bielanski dan Surujballi 1996), dan
Escherichia coli K99 (Otoi et al., 1993). E.coli K99 merupakan bakteri penting karena menyebabkan diare
yang mematikan pada anak sapi (Supar dkk., 1998).
Bakteri tersebut dapat ditularkan terutama melalui
per oral. Di samping itu, Mycoplasma bovigenitalium
dapat mencemari embrio (Bielanski et al., 2000),
demikian halnya parasit Trichomonas foetus (Bielanski
et al., 2004).
Pencegahan penularan mikroorganisma pada
embrio, dapat dilakukan dengan cara mencuci embrio
161
dengan suspensi pencuci dan memberikan perlakuan
tripsin untuk melepaskan mikroorganisme yang
masih melekat pada embrio (Stringfellow dan Seidel,
1990). Namun demikian, dalam praktek perlakuan
pencucian tersebut, kurang efektif untuk mengelimi nasi mikroorganisma kontaminan. Otoi et al. (1993) melaporkan bahwa pencemaran bakteri E.coli K99 pada
embrio dan diberikan perlakuan pencucian di samping
perlakuan tripsin seperti yang disarankan oleh The
International Embryos Transfer Society (Stringfellow dan
Seidel, 1990), akan tetapi E.coli K99 masih dapat
terdeteksi setelah perlakuan tersebut.
Enzim pronase adalah protease yang umum
dipakai untuk menghilangkan zona pelusida. Oleh
karena itu pengaruh perlakuan pronase diberikan
hanya dalam waktu yang singkat terhadap embrio
yang dicemari dengan E.coli K99. Dengan perlakuan
pronase, dapat melepaskan bakteri E.coli K99 di
Batan; Perlakuan Tripsin dan Pronase terhadap Perkembangan Embrio Mencit yang …
permukaan zona pelusida yang dilekati oleh bakteri
tersebut, namun tidak merusak zona pelusida.
Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui
pengaruh perlakuan pronase untuk melepaskan
ikatan E.coli K99 dari permukaan zona pelusida. Di
samping itu untuk mengetahui efektifitas pronase
untuk menyingkirkan bakteri E.coli K99 yang melekat
pada permukaan embrio.
Metode Penelitian
Embrio
Mencit betina berumur delapan minggu yang
berasal dari koloni bebas penyakit dirangsang foli kulogenesisnya dengan menyuntikkan hormon pregnant
mare’s serum gonadotropine (Folligon, Intervet, Boxmeer,
Holland) 5 IU secara intraperitoneum pada pukul
16.00, dan diikuti dengan penyuntikan human chorionic
gonadotropine (Chorulon, Intervet, Boxmeer, Holland),
5-IU hormon 48 jam pasca pemberian PMSG. Segera
setelah pemberian hCG, mencit betina tersebut di kawinkan dengan mencit pejantan dengan perban dingan 1:1 (Hogan et al., 1994). Tiga hari kemudian
mencit betina yang telah bunting tersebut dikorban kan nyawanya dengan cara melakukan dislokasio os
aksis tulang leher. Bagian oviduk atau tuba falopii
diisolasi dan ditempatkan pada medium mPBS. Tuba
falopii dicacah menggunakan jarum suntik 26G.
Sambil diamati di bawah mik roskop, embrio delapan
sel atau morula yang dipanen, dicuci berturut -turut 23 kali dengan cara merendamnya ke dalam larutan
PBS yang mengandung BSA 3% atau mPBS, tanpa
antibiotik (Otoi et al., 1992).
Penyiapan Bakteri E.coli K99
Bakteri E.coli diperoleh dari Balai Penelitian
Veteriner (Balitvet) Bogor. Bakteri E.coli K99 tersebut
diisolasi dari anak sapi. Isolat E.coli dibiakkan semalam
dalam media agar Minca plus vitox (Oxoid, UK)
pada cawan petri. Setelah inokulasi selanjutnya
diinkubasikan pada suhu 370C selama satu malam.
Pada suhu tersebut antigen K99 lebih banyak
diproduksi dibandingkan dengan suhu di bawah 25 0C
(Guinee et al., 1977). Setelah diinkubasi, sel-sel bakteri
pada permukaan agar dibilas dengan NaCl fisiologis
steril, kemudian sel-sel itu dicuci tiga kali. Sel -sel
dipisahkan dengan sentrifugasi 4000 rpm selama 20
menit. Endapan sel dari pencucian terakhir kemudian
dibuat suspensi dengan kekeruhan setara dengan
tabung standar Mc Farland nomor 10 (Supar, 1986).
Pencemaran Embrio dengan E.coli K99
Embrio mencit tahap delapan sel atau morula
dibagi kedalam tiga kelompok perlakuan. Sebelum
dibagi dalam kelompok embrio tersebut dicemari
dengan bakteri E.coli K99 dalam mPBS yang mengan dung bakteri 10 3 CFU/ml dan kemudian diinkubasi
selama satu jam dalam inkubator 37 0C. Setelah
dicemari dengan bakteri, kelompok I, dibasuh dengan
cara memindahkan embrio yang ditempatkan dalam
tetesan (drop) mPBS pertama ke kesembilan tetes
mPBS yang lain, dalam satu cawan petri plastik (35
mm) yang steril. Larutan mPBS yang dipakai tidak
mengandung antibiotik. Embrio tersebut dipindah kan dari tetesan mPBS (50µl) ke tetesan lainnya
menggunakan mikropipet steril. Embrio kelompok II
(perlakuan dengan tripsin), setelah dicemari dengan
bakteri E.coli K99, dimasukkan ke dalam tetesan
(50µl) medium mPBS yang mengandung tripsin 0,1%
(Trypsin, Sigma, St.Louis), dan ditempatkan dalam
tetesan tersebut selama 90 detik. Selanjutnya embrio
tersebut dicuci dengan memindahkannya dalam
tetesan-tetesan medium mPBS tanpa antibiotik ,
sebanyak enam kali dan empat kali pada tetesan tetesan KSOM (kalium simplex optimized medium ).
Embrio kelompok III (perlakuan dengan pronase),
setelah dicemari dengan bakteri langsung dimasukan
kedalam tetes mPBS (50µl) yang mengan dung
pronase 0,25% (Protease, Sigma, St. Louis). Embrioembrio tersebut berada dalam larutan pronase selama
sekitar 60 detik yang sebelumnya dihangatkan hingga
±370C (Vanroose, 1999) dan sambil diamati di bawah
mikroskop binokuler, untuk memantau agar jangan
sampai zona pelusida meluruh secara keseluruhan
akibat kerja enzim pronase yang berlebihan. Setelah
itu dibasuh dalam mPBS sebanyak enam kali dan
pada tetesan KSOM sebanyak empat kali.
Seluruh embrio perlakuan yang telah dicuci
tersebut selanjutnya dipindahbiakkan dalam medi um
KSOM tanpa antibiotik. Ke dalam setiap tetesan me dium (13 µl) dimasukan paling banyak lima embrio
perlakuan. Tetesan-tetesan medium KSOM disiapkan
dalam petri plastik 35 mm sreril, kemudian ditutupi
dengan mineral oil. Embrio ini dimasukan kedalam
inkubator CO 2 5% pada suhu 37 0C, selama 48 jam.
Rancangan Percobaan.
Penelitian dirancang berdasarkan rancangan
acak lengkap pola split in time. Perlakuan yang
diberikan terhadap embrio tercemar E.coli K99 adalah
pencucian dengan mPBS, perlakuan dengan trip sin
atau pronase. Pengamatan dilakukan setiap enam jam
selama 48 jam. Setiap perlakuan terdiri dari 23
ulangan dan setiap ulangan terdiri dari satu embrio.
Pencemar E.coli K99 yang diberikan ke seluruh
embrio adalah 10 3 CFU/ml dalam mPBS. Parameter
yang dievaluasi adalah tingkat perkembangan embrio.
Setiap tingkat perkembangan yang dicapai oleh
embrio diskor. Perkembangan embrio yang diamati
adalah mulai dari tingkat delapan sel, kompak
morula, morula (Hogan et al., 1994), blastosis dan
blastosis ekspan (Gilbert, 1988). Perhitungan jumlah
sel embrio pada tingkat perkembangan tersebut
162
Media Kedokteran Hewan
Vol. 23, No. 3, September 2007
(Gilbert 1988; Hogan et al., 1994) dipakai sebagai
dasar pemberian skor. Untuk tingkat perkembangan
delapan sel, morula, morula kompak, blastosis, dan
blastosis ekspan, diberi skor secara berurutan sebagai
berikut : 8, 14, 16, 32, dan 64. Jika embrio perlakuan
mati selama pengamatan, skor yang diberikan sama
dengan skor tingkat perkembangan yang diperoleh
sebelum embrio tersebut mati. Data tingkat perkembangan embrio dianalisis dengan sidik ragam meng gunakan program SPSS versi 10:0 .
Hasil dan Pembahasan
Pengaruh cemaran E.coli K99 terhadap perkembangan embrio mencit setelah dilakukan pencucian
dengan mPBS, tripsin, dan pronase ditampilkan pada
Tabel 1. Embrio yang mendapatka n perlakuan
pencemaran E.coli K99 kemudian dicuci dengan
mPBS, tripsin, dan pronase, semuanya berkembang
dengan baik selama 48 jam masa pengamatan. Pada
semua perlakuan ada embrio -embrio yang setelah
dikultur dalam KSOM mampu berkembang sampai
ke tingkat hatching bahkan hatched. Namun demikian
dari ke tiga perlakuan tersebut, yang dapat mencapai
tahapan tersebut, kelompok embrio yang mendapat kan perlakuan pronase menunjukkan persentase
cakupan hatched paling besar (Tabel 2).
Tingkat perkembangan embrio pad a pengamatan
selang waktu tiap enam jam, menunjukkan: bahwa
satu jam setelah dicemari dan diinkubasi dalam
inkubator 37 0C, tingkat perkembangan embrio pada
ke tiga perlakuan tidak berbeda nyata (Tabel 1). Pada
pengamatan jam ke-6 dan ke-12 setelah perkembangan embrio pada medium KSOM yang diinkubasi
dalam inkubator CO 2 5%, 370C, tidak menunjukkan
perbedaan nyata. Pada jam ke -18 setelah inkubasi,
tampak mulai adanya perbedaan dalam tingkat
perkembangan embrio antar perlakuan. Pengamatan
pada jam ke-18 menunjukkan bahwa embrio yang
mendapatkan perlakuan pronase berkembang lebih
lambat dibandingkan embrio yang dicuci dengan
mPBS dan perlakuan tripsin.
Setelah jam ke-24, perkembangan embrio kelom pok perlakuan pronase mengalami perkembangan
yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok
embrio yang mendapatkan perlakuan tripsin. Tetapi,
pada jam ke-30, justru perkembangan embrio yang
mendapatkan perlakuan tripsin lebih baik dibanding kan embrio yang mendapatkan perlakuan lainnya.
Selanjutnya pada pengamatan ja m ke-36, ke-42, dan
jam ke-48 tingkat perkembangan embrio -embrio yang
mendapatkan perlakuan pronase jauh lebih baik
dibandingkan dengan embrio -embrio yang dicuci
dengan mPBS atau yang mendapatkan perlakuan
tripsin (Tabel 1).
Pengamatan embrio yang mendapat perlakuan
pencemaran E.coli K99 dan dikultur selama satu jam,
kemudian dicuci dengan mPBS, tripsin, dan pronase
secara berturut-turut dapat dilihat seperti pada
Gambar 1A dan 1B. Pada Gambar 1B, terlihat jumlah
sel embrio jumlahnya lebih dari delapan sel, tidak
seperti pada embrio pada gambar 1A, namun rataan
jumlah sel embrio pada awal perlakuan pada ketiga
perlakuan jumlah selnya tidak berbeda nyata (Tabel
1). Pada Gambar 1C dan 1D, merupakan gambaran
perkembangan embrio pada 24 jam pascainkubasi,
dan gambar tersebut menunjukkan pertumbuhan
yang mencapai tahap blastosis ekspan, setelah dicuci
(sesuai urutan) dengan mPBS, tripsin, atau pronase.
Embrio yang dicuci dengan mPBS ada yang
berkembang hingga hatching. Tingkat perkembangan
embrio yang dicuci dengan mPBS selama inkubasi 24
jam, tidak berbeda nyata dengan pronase, akan tetapi
lebih baik dibandingkan dengan embrio yang dicuci
dengan tripsin (Gambar 1C).
Tabel 1. Skor Perkembangan Embrio Setelah Dicemari E.Coli K99 Kemudian Dibasuh mPBS, Tripsin, d an Pronase
Pengamatan pada jam ke :
Rataan skor perkembangan embrio pada perlakuan
1
6
12
18
24
30
36
42
48
mPBS
Tripsin
Pronase
5,12a)
5,12 a)
8,26 ± 5,12 a)
14,42 ± 5,12 a)
16,00 ± 5,12 a)
22,26 ± 5,12 a)
45,91 ± 5,12 b)
64,00 ± 5,12 a)
97,39 ± 5,12 b)
109,91 ± 5,12 b)
132,17 ± 5,12 b)
8,52 ±
13,45 ± 5,12 a)
17,30 ± 5,12 a)
28,52 ± 5,12 b)
45,22 ± 5,12 b)
57,74 ± 5,12 a)
69,57 ± 5,12 a)
94,61 ± 5,12 a)
104,35 ± 5,12 a)
8,52 ±
14,44 ± 5,12 a)
16,00 ± 5,12 a)
27,83 ± 5,12 b)
41,04 ± 5,12 a)
66,78 ± 5,12 b)
82,09 ± 5,12 a)
98,78 ± 5,12 a)
114,09 ± 5,12 a)
Keterangan : Dalam satu baris, rataan yang diikuti oleh huruf yang sama, tidak berbeda nyata setelah diuji
dengan uji jarak berganda duncan .
163
Batan; Perlakuan Tripsin dan Pronase terhadap Perkembangan Embrio Mencit yang …
A
B
C
D
E
F
G
Gambar 1 A. embrio tercemar E.coli dicuci tripsin setelah satu jam. B. embrio tercemar E.coli dicuci pronase
setelah satu jam. C. embrio tercemar E.coli dicuci tripsin setelah 24 jam. D. embrio tercemar
E.coli dicuci pronase setelah 24 jam. E. embrio tercemar E.coli dicuci tripsin setelah 42 jam. F. embrio
tercemar E.coli dicuci pronase setelah 42 jam. G. embrio tercemar E.coli dicuci tripsin setelah 48 jam.
H. embrio tercemar E.coli dicuci pronase setelah 48 jam. Bar 20µm.
164
Media Kedokteran Hewan
Vol. 23, No. 3, September 2007
Tabel 2. Tingkat Perkembangan Embrio Tercemar E.Coli K99 Pasca Perlakuan Pembasuhan, Setelah 48 Jam
Inkubasi
Perlakuan
Jumlah
Tahap perkembangan embrio (%)
embrio
Hatching
Hatched
Blastosis
Blastosis Ekspan
Pronase
24
0 (0%)
4 (17%)
11 (46%)
9 (37%)
Tripsin
25
1 (4%)
7 (28%)
12 (48%)
5 (20%)
mPBS
23
0 (0%)
11 (48%)
7 (30%)
5 (22%)
Hasil pengamatan embrio 42 jam pascainkubasi
memperlihatkan bahwa embrio dengan perlakuan
mPBS dan pronase (Gambar 1F) menunjukkan
perkembangan tahap hatching, sedangkan pada
perlakuan tripsin menunjukkan tahap perkembangan
blastosis ekspan (Gambar 1E). Pada pengamatan 42
jam pascainkubasi tersebut, tingkat perkembangan
embrio yang dicuci dengan pronase, nyata berkem bang lebih lanjut dibandingkan yang dicuci dengan
mPBS dan tripsin (Tabel 1). Perkembangan embrio 48
jam pascainkubasi, pada embrio yang dicuci pronase
mengalami hatched (Gambar 1H), begitu pula yang
dicuci dengan mPBS dan tripsin. Namun demikian,
kelompok embrio yang memperoleh perlakuan pro nase menunjukkan perbedaan nyata bila dilihat dari
rataan skor perkembangan embrio bila diban dingkan
dengan perlakuan mPBS dan tripsin (Tabel 1).
Berbagai jenis mikroorganisma seperti virus,
bakteri, mikoplasma, dan parasit, mampu mencemari
embrio. Untuk menekan pengaruh mikro organisma
tersebut terhadap embrio, lembaga The International
Embryo Transfer Society (IETS) telah mengeluarkan
petunjuk baku, yakni dengan pencucian berulang dan
memberikan perlakuan tripsin terhadap embrio
(Stringfellow dan Seidel, 1990). Pencucian berulangkali seperti yang disyaratkan oleh IETS tidak sepe nuhnya efektif untuk membebaskan embrio dari
mikroorganisma, seperti bovine viral diarrhea virus
(BVDV), namun pencucian ini mampu menurunkan
jumlah virus kontaminan pada embrio (Bielanski dan
Jordan, 1996). Hal itu diperkuat oleh penelitian yang
dilakukan oleh Trachte et al. (1998), bahwa perlakuan
pencucian dengan mPBS maupun dengan perlakuan
tripsin ternyata tidak dapat menghilangkan virus
BVD dari permukaan zona pelusida utuh pada
embrio sapi. Dari hasil penelitian ini, perlakuan
pencucian dengan tripsin, maupun pronase terhadap
embrio yang dicemari dengan bakteri E.coli K99
mampu menekan keberadaan bakteri tersebut. Hal ini
terbukti dari minimnya akibat yang ditimbulkan
pada perkembangan embrio yan g telah dicemari
bakteri dan kemudian mengalami perlakuan tripsin
atau pronase.
Bakteri E.coli biasanya dengan mudah dapat
diisolasi pada vagina sapi dara dan dapat menyebab -
165
kan penurunan tingkat keberhasilan kebuntingan,
setelah dilakukan embrio transfer nirbedah (non
surgical). Adanya bakteri patogen maupun bakteri
komensal di dalam saluran reproduksi sangat ber peluang mencemari embrio, sehingga mempengaruhi
perkembangannya (Cottel et al., 1996). Infeksi pada
saluran reproduksi hewan betina dapat terja di karena
mendapat limpahan bakteri dari anus yang ada di
atasnya.
Embrio dapat mengalami pencemaran atau
infeksi oleh mikroorganisma pada saat masih berben tuk ovum karena berkontak dengan jaringan atau
cairan folikel ovarium yang mengalami infeksi.
Infeksi dapat juga terjadi setelah ovulasi karena di buahi oleh spermatozoa yang tercemari atau ovi duknya mengalami infeksi (Bielanski dan Jordan 1996).
Untuk mengatasi cemaran, maka terhadap embrio itu
dilakukan pemrosesan berupa pembasuhan atau
perlakuan dengan tripsin. Aplikasi perlakuan pem basuhan dalam pemrosesan embrio mudah dilakukan
dalam rangkaian produksi embrio, untuk menghi langkan berbagai cemaran patogen secara in vitro,
baik yang berasal dari induk berpenyakit maupun
embrio yang tercemar (Stringfellow dan Givens 2000).
Pada penelitian pencemaran embrio yang dilakukan
oleh Otoi et al., (1992; 1993), menunjukkan bahwa
embrio sapi yang dicemari dengan E.coli sebanyak 10 9
CFU/ml selama satu jam ternyata tidak dapat
dihilangkan dengan pembasuhan dengan tripsin,
demikian halnya pencemaran dengan jumlah bakteri
105 CFU/ml selama 18 jam. Dalam penelitian ini,
embrio mencit yang dicemari dengan bakteri E.coli
K99 sebanyak 10 3 CFU/ml dan diinkubasi selama
satu jam mampu disingkirkan dengan per lakuan
tripsin dan pronase. Dilaporkan sebelumnya bahwa
tripsin dapat dipakai secara efektif menying kirkan
atau menginaktivasi patogen -patogen tertentu yang
melekat ke permukaan zona pelusida (Stringfellow
dan Siedel 1990), tetapi kurang efektif untuk
pencucian cemaran E.coli K99, hal ini mungkin
disebabkan oleh konsentrasi E.coli K99 yang terlalu
tinggi.
Tripsin merusak reaksi perlekatan mikroorga nisma pada zona pelusida (Otoi et al. 1993). Perlekatan E.coli K99 ke permukaan sel epitel difasilitasi oleh
Batan; Perlakuan Tripsin dan Pronase terhadap Perkembangan Embrio Mencit yang …
fimbriae (Vazquez et al., 1996), dan perlekatan bakteri
tersebut ke permukaan zona pelusida embrio bersifat
spesifik (Batan et al., 2006). Reseptor E.coli berdasarkan bobotnya, 19% mengandung asam amino
dan 81% karbohidrat. Unsur karbohidratnya terdiri
dari glukosa, manosa, galaktosa dan fukosa (Dean
dan Isaacson 1985). Sedangkan unsur protein pada
reseptor E.coli K99 berdasarkan beratnya terdiri dari
tiga unsur, yang memiliki bobot 17 kDa, 29,3 kDa,
dan 30,9 kDa (Vazquez et al., 1996). Adanya unsur
protein dan karbohidrat inilah yang membuat tripsin
mampu mencerna reseptor tersebut.
Dalam penelitian pencemaran E.coli K99 ke
embrio mencit, semata -mata dilakukan untuk menca ri model, dengan memanfaatkan agen infeksius
seperti bakteri E.coli K99 yang melekat pada permukaan zona pelusida dan dapatkah agen -agen tersebut
dieliminasi dengan pembasuhan ?.
Dilakukan
pencemaran E.coli K99 sebanyak 10 3 CFU/ml,
menunjukkan bahwa embrio tetap bertahan hidup
secara in vitro dalam medium yang dicemari bakteri
tersebut selama tiga hari (Batan et al., 2006).
Setelah pembuahan oosit oleh spermatozoa,
embrio yang terbentuk melintas dalam saluran
oviduk menuju uterus. Selama perlintasan tersebut
pada permukaan zona pelusida dan ruang perivitelin
tertumpuk glikoprotein seperti mu sin yang berasal
dari oviduk (Buhi, 2002). Embrio yang melintasi
oviduk tersebut mengalami pengerasan ( hardening)
zona pelusida. Kejadian tersebut membuat zona
pelusida lebih resisten terhadap re aksi kimia dan
enzimatik. Namun perubahan resistensi proteoli tik
zona pelusida tidak mempengaruhi perlekatan
patogen ke permukaannya (Bielanski et al., 2003;
Buhi, 2002). Penelitian-penelitian mendalam yang
telah dilakukan menunjukkan bahwa zona pelusida
merupakan barier yang efektif guna menahan
penetrasi beberapa patogen hewan, dan ada bakteri
maupun virus yang mampu melekat erat ke
permukaan zona pelusida (Bielanski , 1997).
Tingkat perkembangan embrio tercemar E.coli
K99 setelah 30 jam diinkubasi menunjukkan skor
(57,74) tingkat perkembangan lebih lambat diban dingkan dengan embrio yang diberi perlakuan tripsin
(66,78) ataupun pronase (64,00). Selanjutnya tingkat
perkembangan embrio yang mendapatkan perlakuan
tripsin, tingkat perkembangannya tidak berbeda
nyata, tetapi bila dibandingkan dengan embrio yang
mendapat perlakuan pronase, lebih lambat. Tingklat
perkembangan embrio setelah 48 jam diinkubasi
menunjukkan bahwa embrio yang mendapat perlaku an pronase, skor perkembangannya paling tinggi
(132,17) dibandingkan kelompok embrio yang men dapat perlakuan tripsin(1 14,09), dan kontrol (104,35)
(Tabel 1).
Enzim pronase dilaporkan lebih efektif mencerna
zona pelusida dibandingkan dengan tripsin. Dalam
melakukan pencernaan tersebut enzim pronase
menghidrolisis protein ZP1 dan ZP2 dari zona
pelusida (Kolbe dan Holtz 2005). Proses pencernaan
oleh enzim pronase yang lebih efektif membuat
bakteri yang melekat pada permukaan zona pelusida
lebih banyak pula yang disingkirkan.
Embrio yang mengalami hatched pada perlakuan
pronase menunjukkan persentase yang paling tinggi
(37%) sedangkan perlakuan tripsin dan kontrol hanya
menunjukkan 22% dan 20% (Tabel 2) . Embrio pada
stadium blastosis ekspan menghasilkan stripsin suatu
bahan sejenis tripsin, pada sel-sel trofoblas yang
bersinggungan dengan zona pelusida (Gilbert , 1988),
dengan perlakuan tripsin dari luar embrio pada pem basuhan embrio menyebabkan zona pelusida lebih
mudah ditembus oleh embrio yang ukurannya terus
membesar. Begitu pula dengan enzim pronase, selain
menginaktivasi reseptor E.coli (987P) dengan merusak
ikatan bagian asam amino dan karbohidrat nya (Dean
dan Isaacson, 1985), enzim pronase bekerja mengikis
permukaan zona pelusida beserta bakteri E.coli yang
melekat padanya, juga mencerna zona pelusida
sehingga membuat zona pelusida menipis disamping
merapuh. Embrio yang terus berkembang dan meluas
akan lebih mudah mendesak zona pelusida, membuat
embrio yang mendapat perlakuan pronase paling
banyak mengalami hatching dan hatched.
Kesimpulan
Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa:
pencucian embrio menggunakan mPBS, tripsin, dan
pronase untuk mengeliminasi cemaran bakteri E.coli
K99 10 3 CFU/ml tidak mengakibatkan kematian
embrio, tetapi dapat menghambat perkembangan
bakteri. Pembasuhan dengan pronase 0,25% dalam
mPBS merupakan larutan paling efektif untuk
menghilangkan bakteri dari permukaan embrio,
ditandai dengan tingkat perkembangan embrio yang
nyata lebih baik dibandingkan dengan pencucian
dengan mPBS dan tripsin.
Ucapan Terima Kasih
Penulis mengucapkan terima kasih kepada
BPPS Dikti Depdiknas yang telah m embiayai penelitian ini. Ucapan yang sama juga ditujukan kepada
Laboratorium Embriologi FKH Institut Pertanian
Bogor di Darmaga, atas ijin yang diberikan untuk
memanfaatkan semua fasilitas lab dan Balai Besar
Penelitian Veteriner Bogor, atas bantuan is olat bakteri
E.coli K99 dan ijin menggunakan fasilitas
laboratorium bakteri. Kepada semua pihak yang telah
membantu, penulis menyampaikan penghargaan
setinggi-tingginya.
166
Media Kedokteran Hewan
Daftar Pustaka
Batan IW, Boediono A, Djuwita I, Lay BW, dan
Supar. 2006. Pelacakan perlekatan bakteri
Escherichia coli K99 pada zona pellucida embrio
mencit
dengan
metode
enzym
linked
immunosorbent assay (ELISA) dan scanning
electron microscope (SEM). J. Veteriner. 7: 29-38.
Bielanski A. 1997. A review on disease transmission
studies in relationship to production of embryos
by in vitro fertilization and to related new
reproductive technology. Biotech Advance 15:
633-656.
Bielanski A, Devenish J, and Phipps-Todd B. 2000.
Effect of Mycoplasma bovis and Mycoplasma
bovigenitalium in Semen on fertlization and
association with in vitro produced morula and
blastocyst stage embryo. Theriogenology. 53:
1213-1223.
Bielanski A, Ghazi DF, and Phipps-Todd B. 2004.
Observation
on
the
fertilization
and
development
of
preimplantation
bovine
embryos in vitro in the p0esence of Trichomonas
foetus. Theriogenology. 61: 821-829.
Bielanski A, and Jordan L. 1996. Washing or washing
and trypsin treatment is ineffective for removal
of noncytopathic bovine viral diarrhea virus
from bovine oocytes or embryos after
experimental viral contamination of an in vitro
fertilization system. Theriogenology. 1467-1476.
Bielanski A, Lutze-Wallace CL, and Nadin-Davis
S. 2003. Adherence of bovine viral diarrhea virus
to bovine oocytes and embryos with hardened
zona pellucida cultured in vitro. Can J Vet Res
67: 48-51.
Bielanski, A and Surujballi O. 1996. Association of
Leptospira borgpetersenii serovar hardjo type
hardjobovis with bovine ova and embryo
produced by in vitro fertilization. Theriogenelogy 46: 45-55.
Buhi WC. 2002. Characterization and biolo gical roles
of
oviduct
specific.
estrogen-dependent
glycoprotein. Reproduction. 123: 355-362.
Cottell E, McMorrow J, Lennon B, Fawsy M,
Cafferkey M, and Harrison RF. 1996. Microbial
contamination in an in-vitro fertilization embryo
transfer system. Fertil Steril. 66(5): 776-780.
Dean EA, and Isaacson RE. 1985. Purification and
characterization of receptor for 987P pilus of
Escherichia coli. Infect Immun. 47: 98-105.
167
Vol. 23, No. 3, September 2007
Gilbert FS. 1988. Development Biology . Massachusetts : Sinauer Assoc. Inc. Pub. p. 82-92.
Guinee PAM, Veldkamp J, and Jansen WH. 1977.
Improved minca medium for detection of K99
antigen in calf enterotoxigenic strains of
Escherichia coli. Infect.Immun. 15: 676-678.
Hogan BR, Beddington F, Costantini, and Lacy E.
1994. Manipulating the Mouse Embryo a
Laboratory Manual. 2nd Ed. Danvers: Cold
Spring Harbor Laboratory Press. p. 49.
Kafi M, McGowan MR, and Kirkland PD. 2002. In
vitro maturation and fertilization of bovine
oocyte and in vitro culture of preservative
zygotes in the presence of bovine pesti virus. Animal Reprod Sci. 71: 169-179.
Kolbe T, and Holtz W. 2005. Differences in protease
digestibelity of the zona pellucida of in - vivo
and in-vitro derived porcine oocytes and
embryos. Theriogenology. 65: 1695-1705.
Otoi T, Tachikawa S, Kondo S, and Suzuki S. 1992.
Effect of antibiotics treatment of in vitro
fertilized bovine embryos to remove adhering .
J. Vet. Med. Sci. 54(4): 763 - 765.
Otoi T, Tachikawa S, Kondo S, and Suzuki S. 1993.
Effect of washing, anti biotic and trypsin
treatment of bovine embryos on the removal of
adhering K99 Escherichia coli. J Vet Med Sci. 55
(6): 1053-1055.
Stringfellow
DA,
and
Givens
MD.
2000.
Epidemiologic concerns relative to in vivo and
in vitro production of livestock embryos . Anim
Reprodu Sci. 60-61: 629-642.
Stringfellow DA, and Seidel SM (eds). 1990. Manual
of the international embryos transfer society : A
procedural guide and general information for
the use of embryos transfer technology.
emphasizing sanitary precautions. Champaign
IL , IETS: 1-65.
Supar. 1986. Penggunaan metode enzyme -linked
immunosorbent assay (elisa) untuk deteksi
antigen pili K99 dan K88 pada Escherichia coli
dari anak sapi dan anak babi diare. Penyakit
Hewan. 32: 159-167.
Supar, Kusmiyati, dan Poerw adikarta MB. 1998.
Aplikasi vaksin
enterotoksigenik Escherichia
coli (ETEC) K99, F41 polivalen pada induk sapi
perah bunting dalam upaya pengendalian
kolibasilosis dan kematian pedet neonatal. J.
Ilmu Ternak dan Vet. 3(1): 27-33.
Batan; Perlakuan Tripsin dan Pronase terhadap Perkembangan Embrio Mencit yang …
Trachte ED, Stringfellow, Riddell K, Galik P, Riddell
JrM, and Wright J. 1998. Washing and trypsin
treatment of in vitro derived bovine embryos
exposed to bovine viral diarrhea virus.
Theriogenology. 50: 717-726.
Vanroose G. 1999. Interaction of bovine herpesvirus -1
and bovine viral diarrhea virus with bovine
gametes and in vitro
Disertation. Uni. of Gent .
produced
embryo.
Vazquez F, Gonzales EA, Garabal JI, and Blanco
J. 1996. Fimbriae Extracts from Enterotoxi genic
Escherichia coli Strains of Bovine and Porcine
Origin with K99 and/or F41 Antigens. Vet
Microbiol. 48: 231-241.
168