Proses Sterilisasi dan Penanganan Kontaminasi

PROSES
STERILISASI DAN PEN.{I{GANAN KONTAMINASI
-)
Drs. LUCKY PRAYOGA' MP...r
PENDAHULUAN
Sterilisasi mempunyai peranana penting dalam keberhasilan teknik kultur
jaringan. Guna mencegah terjadinya kontaminasi maka perlu dirancang suatu
laboratorium/ruang kerja kultur jaringan yang khusus, terpisah antara bagian
persiapan, pembuatan media dan ruang penabur (penanaman)
Ruang persiapan merupakan ruangan yang digunakan untuk mempersiapan
pembuatan media perncucian botol-botol untuk media maupun persiapan sterilisasi
eksplant yang diambil dari lapangan- Hindarkan tempat tersebut dari genangan air
ruilpun lembab.
Ruang pembuatan medi4 biasa dipisahkan antara ruang penimbangan dan
ruang tempat penyimpanan bahan kimia. Bahan kimia sebaiknya ditempatkan pada
tempat yang kering, kerena berguna untuk menghindari mencairnya beberapa bahan
kimia yang bersifat higroskopis. Ada beberapa bahan kimia yang ditempatkan dalam
alamari es seperti hormon tanaman. SelanjuUrya ruang penabur sangat menentukan
keberhasilan teknik kultur jaringan sehingga perlu dijaga sterilitasnya.
St€rilisasi dalam kultur jaringan pada umumnya dikelompokkan dalam (1)
sterilisasi alat serta media yang akan digunakarq (2) sterilisasi eksplant atau bahan
tarrarnan yang akan digunakan dan (3) sterilisasi rwrng penabur dan laminaer air Jlow
amupun enkas.
STERLISASI ALAT DAN MEDIA TANAM
Nat-alat yang akan digunakan utnuk penanaman harus dalam kondisi steril.
Alat-alat logam dan gelas dapat diterilkan dalam aoutoklaf Sedangkan alat tanam
seperti pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan
penumasan dalam oven. Khusus untuk skapel, tangkainya dapat disterilkan dengan
menggunakan aoutoklaf, namum pisaunya (blade) akan tumpul apabila dipanaskan
pada temperatur tinggi. Oleh karena itu utnuk sterilisasi sebaiknya dilakukan dengan
pencelupan dalam alkohol.
*) Disampaikan dalam rangka Pengenalan Telarik Kultur Invitro Anggrek MGMP
guru SMAN Tegal, Purwokerto, 15 Desember 2015
**) Dosen Tetap Fakultas Biologi Unsoed
bio.unsoed.ac.id
2
'femperatur yang digunalian untuk sterilisasi adalah 121 oC dengan tekananan
17,5 psi Qtounds per square inch) selama 1 jam Perhitungan waktu sterilisasi dimulai
setelah tekanan yang diingkan tercapai.
Sterilisasi media yang mengandung bahan kimia tidak mudah rusak dilakukan
sterilisasi dengan menggunakan aoutoklaf pada temperrtur 121 "C dengan tekanan
anatara 15
-
17,5 psi dengan waktu antua 20
-
25 menit tergantung dari volume
wadah dan media.
Bahan-bahan yang bersifat heat labile dalam bentuk larutan, sterilisasi
dilakukan dengan cara rnenyaring dengan menggunakan filter yang berukuran 0,2
-
0,22 1tM, contoh bahan kimia yang bersifat heat labile arrtara lain GA3, thiamin HCI
dan beberapa antibiotik seperti cqnaftnis ine, carbenocillin.
STERILISASI BAHAN TANAMAN
Pada teknik kultur jatingar,, inisiasi kultur yang bebas dari kontaminasi
merupakan langkah yang sangat penting. Bahan tanaman dari lapangan banyak
mengandung debu, kotoran-kotoran dan berbagai kontaminan lainnya seperti
cendawarq bakteri
rnpun spora. Apabila kontaminan tidak dihilangkan maka dalam
media yang banyak mengandung karbohidrat, vitamin dan berbagai mineral akan
s€gera ditumbuhi bakteri maupun cendawan. Dalam beberapa hari saja eksplan yang
telah ditanam akan tertutupi oleh kontaminan tersebut, sehingga eksplan akan mati.
Bahan yang digunakan untuk sterilisasi eksplant
bermacam-macarn,
bergantung pada jenis tanamannya, bahan tanaman yang akan digunaka4 lingkungan
tempat tumbuh, musim, umur tanaman dan kondisi tanaman. Dalam sterilisasi bahan
tanaman hal penting yang hans diperhatikan adalah bahwa sel tanaman dan sumber
kontaminan sama-sama benda hidup, sehingga dalam sterilisasi sumber kontaminan
dapat mati tetapi sel tanaman yang akan ditanam dapat hidup.
Pada table dibawah menunjukkan beberapabahan kimia yang dapat digunakan
untuk sterilisasi bahan tanaman yang akan digunakan Bahan kimia yang akan
digunakan dapat hanya I jenis bahan kimia atau kombinasi dari beberapa bahan kima,
misalnya sterilisasi dengan menggunakan alcohol yang akan dilajutkan dengan
menggunakan fungisida atau antibiotic. Apabila bahan tanaman banyak mengandung
rambut-rambut/bulu-bulu (trfkhomnta) dalam sterilisasi sebaiknya ditambahkan tween
bio.unsoed.ac.id
(detergen) dengan tujuan memperluas permukaan kontak arfiala bahan kimia
(desinfektan) dengan bahan tanaman.
Jenis bahan kimia
Konsentrasi
Waktu untuk sterilisasi
Kalsium hipoklorat
t-t0%
5
-
30 menit
Natrium hipoklorat
1
-2%
7
-
15 menit
Fungisida: benlate
2 e/l
20
Antibiotic
50 mg/l
30
Alcohol
70
o/o
-30 menit
- 60 menit
30 - 60 menil
Bahan yang telah disterilkan dengan menggunakan bahan kim ia seperti di
hans dicuci dengan menggunakan aquadest steril (aquadest yang telah
disterilkan), minimal 3 kali dengan tujuan menghilangkan pengaruh negative dari
atas,
desinfehan, sehingga sel dapat turnbuh dan berkembang. Bahan yang telah steril
ditempatkan dalam petridist steril yang beralaskan kertas saring untuk dipotongpotong dan dibuang bagran yang kontak dengan desinfektaru karena bagian tersebut
biasanya mengandung sel yang telah mati karena pengaruh desinfektan. Jaringan yang
steril dan hidup selanjutnya di tanam dalam media steril. Perlu diperhatikan bahwa
pekerjaan tersebut di atas dilakukan di dalam Laminaier air
atau enkas yang
flow
telah disetrilkan.
STERILISASI KOTAK PENABUR
Kotak penabur merupakan tempat yang digunakan untuk menanam eksplan ke
dalam media. Ternpat ini dapat berupa kotali yang dibuat sendiri (bahan d.ari kaca)
yang baiasanya dikenal dengan enkas atau yang dibuat oleh pabrik yang dikenal
dengan Laminaier
air flow. Sebelum digunakan, kotak purabur harus disterilkan
terlebih dahulu. Bahan yang digunakan untuk sterilisasi dapat berupa lampu UV (ultra
violet), alcohol
70o/o maupun
formalin. Lampu UV ditempatkan di dalam nulngan
dimana kotak penabur ditenpatkan nurupun didalam kotak
sekurang-kurangnya 15 menit s/d
t hari sebelum penanaman
itu sendiri. Nyalakan
eksplan. Apabila akan
memasuki ruangan tersebut matikan lampu [rV, karena lampu UV mempunyai energi
cukup besar dapat menyebabkan irritasi pada organ yang sensitive. Setelah lampu LfV
dimatikan semprotkan dengan menggunakan alcohol 70%o ata| formatin. Gunakan
laminaier atau kotak penabur setelah diperkirakan uap formarin hilang.
bio.unsoed.ac.id
4
PENUTUP
Keberhasilan dalam sterilisasi kotak penabur, media dan bahan yang akan
ditanam (eksplan) sangat menentukan keberhasilan dalam teknik kutur jaringan
tanaman, oleh karena itu teknik sterilisasi harus dilakukan dengan benar.
DAFTAR PUSTAKA
George, A.S dan P.D. Sheringlon. 1984. Plant Propagation
by Tissue
Culture.
Exegenic Limited. England.
Suryowinoto M. 1988. Petunjuk Laboratorium Pemuliaan secara in vitro PAU UGM.
Yogyakarta.
bio.unsoed.ac.id