Imunohistokimia untuk mendeteksi sel-sel saraf dan inflamasi dalam jaringan otak kuda Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi panel penanda sel untuk mempelajari patogenesis seluler pada penyakit otak menular kuda. Secara khusus, protokol untuk fenotip glia reaktif, neuron, dan infiltrasi sel mononuklear darah dan sel polimorfonuklear di otak kuda dikembangkan. Antibodi yang tersedia secara komersial untuk limfosit T-CD3 +, subpopulasi sel T CD8 + dan CD4 +, limfosit B, makrofag, mikroglia, astrosit, dan neuron diselidiki untuk reaktivitas dalam jaringan FFPE yang normal dan sakit. Optimalisasi protokol imunohistokimia manual (IHC) dilakukan dengan menggunakan berbagai reagen pewarnaan dan metode IHC. MATERIAL DAN METODE Sampel jaringan Protokol imunohistokimia dikembangkan pada jaringan kuda yang sakit dan normal. Kuda yang sakit terdiri dari virus West Nile (WNV) yang terkena secara klinis, yang terinfeksi secara alami dan eksperimental, dan infeksi Sarcocystis neurona (Beckstead, 1994; Gutierrez et al., 1999; Porter et al., 2003; Seino et al., 2007). Jaringan difiksasi dalam formalin buffer netral 10% dan diproses menjadi blok parafin yang tertanam sekitar satu minggu setelah fiksasi. Evaluasi awal pengikatan antibodi diuji pada kelenjar getah bening kuda yang tidak terinfeksi dan limpa untuk target limfositik, hati dan timus untuk target jaringan makrofag, dan otak untuk mikroglia, astrosit, dan neurons Pemrosesan jaringan Prosedur IHC yang tidak berubah-ubah untuk semua protokol termasuk membelah jaringan FFPE pada 5 mm dan menempatkannya pada slide kaca yang bermuatan positif. Slide direndam dalam xylene (Fischer Scientific, Pittsburg, PA, USA) tiga kali selama 5 menit untuk menghilangkan parafin. Bagian-bagian ini kemudian direhidrasi melalui gradien etanol (Fischer Scientific) selama 5 menit di setiap konsentrasi, 100%, 100%, 95%, dan 70% etanol, diikuti oleh air terionisasi. Untuk mengurangi volume reagen yang diuji dan kehilangan cairan, jaringan dikelilingi oleh pena penghalang hidrofobik (Pena ImmEdgeTM, Ted Pella Inc., Redding, CA, USA). Antigen membuka kedok Tiga metode slide pemanas untuk menyelidiki efektivitas Epitope Retrieval (HIER) yang diinduksi panas termasuk menggunakan pressure cooker, microwave, dan double boiler. Memasak bertekanan dilakukan pada 125 C selama 30 detik diikuti oleh 90 C selama 10 detik (Matyjaszek et al., 2009; Grosche et al., 2012), atau microwave dilakukan selama 10 menit (Kumar & Rudbeck, 2009) menggunakan iklan meja oven 1000W GE. Untuk pendidihan ganda, dua slide jaringan diapungkan kembali ke belakang dalam 25 ml larutan pengambilan dalam tabung kerucut plastik 50 ml. Tabung kerucut kemudian ditempatkan di air pra-hangat dari gelas gelas 250 ml di atas kompor listrik. Suhu air dipertahankan pada 90 C. Setelah sekitar 5 menit pemanasan larutan pengambilan, HIER diatur waktunya selama 10 menit. Tabung kerucut kemudian dikeluarkan dari double boiler dan dibiarkan dingin selama 15 menit pada 27 C. Jaringan dibilas dalam air deionisasi tiga kali selama 2 menit. Buffer pengambilan epitop yang diinduksi panas diuji terutama menggunakan sistem boiler ganda. Bupati termasuk dua buffer sitrat komersial, Epitope Retrieval Solution pH 6 (Novacastra, Leica, Newcastle Upon Tyne, UK) dan Solution Retrieval Solution pH 6 (Dako, Glostrup, Denmark), dan larutan asam etilenadiaminetetraasetat (EDTA) buffered pada pH 9 ( Basis Tris 10 mM, larutan EDTA 1 mM, 0,05% Tween 20, dan NaOH dititrasi hingga pH 9). Konsentrasi 1 setiap larutan baru dibuat dengan mengencerkan larutan stok dengan air deionisasi. Untuk pengambilan epitop proteolitik, jaringan diperlakukan dengan 200 ug / ml larutan proteinase K (Tris HCL 100 mM pH 8,2, Tween 20, dan Proteinase K (Ambion, Foster City, CA, USA)) selama 10 menit pada 37 C. Pemblokiran peroksidase endogen Larutan netralisasi peroksidase yang diuji meliputi dua larutan hidrogen peroksida (H2O2), 3% dan 0,3% H2O2, dan pereaksi komersial siap pakai, Blok Peroxidase (Sistem Deteksi Polimer NovolinkTM; Sistem Leica, Wetzlar, Jerman). Larutan yang mengandung 3% dan 0,3% H2O2 dibuat segar untuk setiap upaya pewarnaan dengan mengencerkan 30% H2O2 (Fischer Scientific) dalam 1 salin fosfat buffered (PBS) (10 PBS, Fischer Scientific). Jaringan direndam dalam larutan pemblokiran peroksidase selama 5 menit diikuti oleh dua kali, pembilasan 5 menit dalam PBS. Pemblokiran protein non-spesifik Teknik pemblokiran non-spesifik meliputi empat pereaksi komersial dan satu solusi yang disiapkan laboratorium. Reagen komersial termasuk 10% Normal Goat Serum (Invitrogen, Frederick, MD, USA), Protein Block (NovolinkTM Polymer Detection Systems; Leica, Wetzlar, Germany), NovocastraTM IHC / ISH Solusi Super Blocking (Leica), dan NovocastraTM Liquid Serum, Normal Reagen Pemblokiran Kambing Serum (Leica, Wetzlar, Jerman). Selain itu, larutan serum kambing 5% disiapkan dengan mengencerkan Immunopure Goat Serum (ThermoFischer Scientific, Waltham, MA, USA) dalam 1 PBS. Reagen pemblokiran protein diaplikasikan selama 20 menit dengan pengecualian NovolinkTM Protein hanya 5 menit. Reagen pemblokiran dihilangkan tanpa pembilasan sebelum menambahkan antibodi primer. Antibodi primer Antibodi primer menguji populasi sel sasaran astrosit, mikroglia, neuron, Limfosit T, limfosit B, dan makrofag (Tabel 1). Semua antibodi primer diencerkan dalam satu dari dua pengencer komersial (IHC Diluent (Novacastra, Leica); Dako Antibody Diluent (Dako, Glostrup, Denmark)). Pengenceran serial dua kali lipat dari masing-masing antibodi diuji untuk menentukan kisaran pewarnaan yang optimal. Jika sinyal lemah atau tidak ada pewarnaan latar belakang, tes pengenceran tambahan dilakukan sampai pewarnaan optimal tercapai. Antibodi diterapkan dalam 37 C, inkubator yang dilembabkan untuk 60–120 menit atau semalam (~ 16 jam) pada suhu 4 C dalam piring tertutup yang lembab. Setelah inkubasi antibodi primer, slide dicuci tiga kali selama 5 menit masing-masing dalam 1 PBS sebelum aplikasi antibodi sekunder. Kontrol negatif untuk setiap antibodi primer terdiri dari kontrol primer negatif isotipe-cocok (MCA928, AbD Serotec, Kidlington, UK) untuk antibodi monoklonal atau serum kelinci untuk antibodi poliklonal. Sistem deteksi Tiga komersial, horseradish peroxidase (HRP) -tautan deteksi konjugat kit digunakan dengan mengikuti instruksi pabrik. Kit ini termasuk Vectastain ABC Kit-Mouse IgG (Laboratorium Vektor, Burlingame, CA, USA), Vectastain ABC Kit-Rabbit IgG, dan NovolinkTM Polymer Detection System (Leica, Wetzlar, Jerman). Terakhir, substrat-kromogen (Vektor NovaRED Peroksidase, Laboratorium Vektor) diaplikasikan selama 10 menit, dibilas dengan air terionisasi selama 5 menit, diimbangi dengan Hematoksilin Lab VisionTM Mayer (Ilmiah ThermoFisher) selama 1 menit, dan dibilas dengan running tap. air selama 2 menit. Semua bagian kemudian didehidrasi melalui peningkatan gradien etanol, 50%, 70%, 95%, dan 100%, masing-masing selama 2 menit. Slide dibersihkan dalam xylene tiga kali selama 3 menit masing-masing sebelum ditutup dengan media pemasangan PermountTM (Fischer Scientific, Hampton, NH, USA). HASIL Antigen membuka kedok Dari reagen yang diuji, larutan berbasis pH sitrat rendah menghasilkan pewarnaan yang unggul (Meja 2). Target Retrieval Solution pH 6 oleh Dako sudah cukup untuk sebagian besar antibodi; Namun, penggunaan Epitope Retrieval Solution pH 6 oleh Leica menghasilkan pewarnaan positif ketika produk Dako gagal menghasilkan pewarnaan dengan antibodi CD79ay +. Larutan Proteinase K diuji dengan antibodi makrofag dan menghasilkan peningkatan intensitas pewarnaan antibodi MAC387 +. Berbagai masalah ditemui dengan metode menerapkan panas. Memanfaatkan, satu antibodi, CD79ay +, hanya metode pendidihan ganda menghasilkan pewarnaan kelenjar getah bening positif yang konsisten. Memasak dengan tekanan tinggi dan microwave menghasilkan masing-masing tidak ada pewarnaan atau pewarnaan tidak merata. Selain itu, gangguan jaringan minimal dengan metode pendidihan ganda. Satu antibodi, Iba-1 +, tidak memerlukan pengambilan panas dan HIER apapun menghasilkan pewarnaan latar belakang yang tidak spesifik. Pemblokiran peroksidase endogen Dalam jaringan FFPE, larutan 3% H2O2 dapat diandalkan untuk mengurangi pewarnaan latar belakang tanpa gangguan jaringan. Tidak ada perbedaan antara reagen komersial dan lab yang diencerkan. Pemblokiran protein non-spesifik Beberapa kombinasi pengencer antibodi IHC dan reagen pemblokiran protein non spesifik diuji. Tidak ada perbedaan dalam intensitas pewarnaan yang dicatat antara kedua pengencer yang digunakan. Di antara solusi pemblokiran protein, 10% Normal Goat Serum, Protein Block dari NovolinkTM Polymer Detection System, dan 5% Immunopure Goum Serum dalam larutan PBS semuanya sama dalam memblokir pewarnaan non-spesifik. Spesifisitas dan sensitivitas monoklonal dan antibodi poliklonal Beberapa antibodi diuji untuk antigen CD spesifik limfosit termasuk CD3 +, CD4 +, CD5 +, CD8 +, CD20 +, CD21 +, dan CD79ay + (Tabel 1). Dari dua CD3 +, penanda sel pan-T yang diperiksa, kelinci antibodi poliklonal manusia (A0452, Dako) dengan tepat menodai korteks kelenjar getah bening (Gambar 1A), selubung limfatik periarterial dari limpa, dan manset perivaskular pada otak yang terinfeksi WNV (Gbr. 1B). Empat antibodi sel T-helper CD4 + diuji. Hanya antibodi tikus, monoklonal anti-equine (HB61A, VMRD, Pullman, WA, USA) pada 1:25 pengenceran positif bernoda korteks kelenjar getah bening; Namun, pewarnaan latar belakang tinggi ketika diterapkan pada jaringan otak. Dua penanda sel T sitotoksik CD8 + diselidiki, tetapi tidak ada penanda yang memiliki reaktivitas dalam jaringan FFPE. Antibodi terhadap CD5 +, CD20 +, CD21 +, CD79ay +, dan IgG (H + L) (Tabel 1) diuji untuk identifikasi populasi sel B. Penanda limfosit putatif, CD5 + (B29A, VMRD), dilaporkan memilih sel B dalam jaringan kuda. Meskipun antibodi ini sangat menodai pusat kelenjar getah bening FFPE, pewarnaan kortikal juga dicatat. Karena itu, CD5 + (B29A) tidak dapat diandalkan untuk perbedaan antara sel B dan Populasi sel T. Selain itu di jaringan otak, antibodi ini menghasilkan pewarnaan latar belakang yang tidak spesifik, yang tidak dapat diselesaikan. Tidak ada pewarnaan yang dicapai dengan antibodi CD20 +, CD21 +, atau antibodi IgG (H + L). CD79acy anti-manusia + (HM57; Dako, Glostrup, Denmark) antibodi monoklonal pada 1: 100 berhasil menodai pusat kelenjar getah bening kelenjar getah bening tanpa latar belakang pewarnaan di otak kuda (Gambar 1C dan 1D). Beberapa antibodi penargetan makrofag diselidiki. RAM 11 (Dako, Glostrup, Denmark), AM-3K (TransGenic Inc., Kobe, Jepang), dan CD68 + (KP1; Leica, Wetzlar, Jerman) antibodi tidak memiliki reaktivitas dengan jaringan kontrol; Namun, MAC387 + (Leica, Wetzlar, Jerman) reaktif. Penanda ini secara positif menodai kontrol hepatik dan makrofag timus (Gbr. 2A) dengan pewarnaan terbatas pada bagian kelenjar getah bening. Berdasarkan morfologi sel, sel polimorfonuklear dan mononuklear juga bernoda positif karena kurangnya spesifisitas makrofag dari antibodi. Tidak ada reaktivitas yang tercatat di otak kuda normal. Populasi sel MAC387 + berbeda dari distribusi limfosit CD3 + di bagian otak dengan peradangan karena infeksi WNV (Gambar 2B). Selain itu, antibodi makrofag ini memiliki sedikit atau tidak ada reaktivitas silang dengan mikroglia otak karena beberapa sel MAC387 + divisualisasikan dalam nodul glial otak WNV +. Untuk mengkarakterisasi gliosis reaktif, antibodi terhadap penanda mikroglial dan astrositik diuji. Pada jaringan otak yang tidak terinfeksi, antibodi Iba-1 + yang diwarnai tersebar mikroglia residen dengan intensitas rendah, namun proses mikroglial divisualisasikan (Gbr. 2C). Intensitas pewarnaan lebih tinggi pada otak yang terinfeksi WNV (Gbr. 2D). Populasi astrosit diidentifikasi dengan antibodi terhadap filamen menengah, protein asam glial fibrillary. (GFAP), khusus untuk astrosit dalam jaringan SSP. Antibodi ini bereaksi kuat dengan astrosit pada otak normal dan yang terinfeksi dengan proses astrositik yang berbeda. GFAP + astrosit didistribusikan di dalam parenkim otak, di batas glia, di sepanjang pembuluh darah otak, dan di area gliosis otak WNV + (Gbr. 3). Tiga antibodi yang menargetkan protein rantai berat neurofilamen (NF-H) akson neuron berhasil menodai jaringan otak kuda equine. Turunan babi, antibodi NAP4 (EnCor Biotechnology Inc., Gainesville, FL, USA), adalah neuron superior dan bernoda pada otak normal (Gambar 4) dan yang terinfeksi. Antibodi Neu-N monoklonal tikus (A60, Millipore, Billerica, MA, USA), yang menargetkan perikaryon neuronal, juga diuji tetapi tanpa reaktivitas yang berhasil dalam jaringan kuda. Protokol IHC manual yang berhasil untuk antibodi ini dalam jaringan saraf kuda diidentifikasi (Tabel 2). Perlu dicatat bahwa semalam, pendinginan dengan antibodi primer CD3 +, CD79 +, MAC387 +, GFAP +, dan Iba-1 + akan berhasil menodai jaringan dan dapat memberikan fleksibilitas dalam penjadwalan laboratorium jika penyelesaian protokol satu hari tidak memungkinkan 865/5000 arsitektur dan menonaktifkan agen infeksi potensial (Cantile et al., 2001; Ritchey et al., 2006; van Marle et al., 2007); Namun, proses ini dapat memblokir atau menghancurkan epitop sensitif (Beckstead, 1994; Me'rant et al., 2003; Terio et al., 2003; Ibrahim et al., 2007). Meskipun dilaporkan pembalikan dari perawatan ini, antigen kuda yang diturunkan, CD4 + dan CD8 + T tidak terdeteksi dalam FFPE. Hasil ini telah dijelaskan dalam spesies lain (Beckstead, 1994; Bilzer et al., 1995; Zeng et al., 1996; Gutierrez et al., 1999; Ha¨rtig et al., 2009). Namun, antibodi monoklonal anti-CD4 + (mAb HB61A, VMRD) dan CD8 + (mAb HT14A, VMRD) reaktif terhadap kelenjar getah bening kuda yang beku dan beku serta jaringan SSP yang infeksius. Jaringan pengarsipan baik dalam FFPE dan segar, format jaringan beku dianjurkan ketika menyelidiki epitop yang mungkin dipengaruhi oleh fiksasi. Setelah pewarnaan jaringan kontrol berhasil, sampel jaringan otak normal dan patologis kemudian diuji bersama kontrol jaringan positif dan negatif. Sampel jaringan patologis termasuk otak yang terinfeksi WNV, yang mengandung gliosis reaktif dan perivaskular sel peradangan (Cantile et al., 2001; Ibrahim et al., 2007; van Marle et al., 2007; Schnabel et al., 2013). Jaringan yang terinfeksi S. neurona juga digunakan, yang mengandung inflamasi nonsupuratif fokal, pemborgol perivaskular mononuklear, dan sel raksasa dan eosinofil (Boy, Galligan & Divers, 1990; Dubey et al., 2001). Mengikuti alur kerja pengujian jaringan ini membantu identifikasi reaktivitas antibodi yang berhasil. Beberapa rintangan harus diatasi untuk mengoptimalkan interaksi antibodi dengan target yang dituju. Aldehyde cross-link yang mengikat protein jaringan selama proses fiksasi formalin harus dihilangkan oleh HIER atau pengambilan proteolitik epitop untuk memungkinkan epitop melanjutkan konfirmasi yang lebih alami dan meningkatkan kapasitas pengikatan antibodi (Shi, Key & Kalra, 1991; Ferrier et al., 1998; Krenacs et al., 2010). Peroksidase yang secara alami terjadi di dalam jaringan harus dinetralkan dengan H2O2 untuk mencegah pewarnaan non-spesifik selama penerapan kit substrat berbasis peroksidase (Wendelboe & Bisgaard, 2013). Protein endogen dapat secara non-spesifik berinteraksi dengan antibodi dan menyebabkan pewarnaan latar belakang yang menutupi sinyal antigen target (Daneshtalab, Dore & Smeda, 2010; Buchwalow et al., 2011). Situs mengikat yang tidak diinginkan ini harus diblokir. Dalam penelitian ini berbagai reagen dan metode diuji untuk setiap protokol IHC manual individu. Seperangkat dasar dari solusi dan teknik yang dapat diandalkan untuk menguji antibodi diidentifikasi dalam penelitian ini. Ini termasuk 3% H2O2, pH rendah, pereaksi HIER berbasis sitrat dalam double-boiler, 5% Immunopure Goat Serum di PBS, Leica's IHC Diluent, inkubasi antibodi selama satu jam pada suhu 37 C, dan Sistem Deteksi Polimer NovolinkTM. Namun, dengan menyesuaikan setiap protokol antibodi secara teliti, hasil kami mengandung berbagai reagen yang akhirnya dipilih untuk setiap prosedur pewarnaan. Identifikasi antibodi kuda-reaktif dapat menjadi tantangan karena pengetahuan terbatas reaktivitas antibodi komersial dengan jaringan hewan dan kurangnya pengembangan beberapa reagen spesifik spesies. Evaluasi reaktivitas lintas spesies dari antibodi yang tersedia secara komersial, terutama antigen CD, telah banyak dilakukan dalam jaringan kuda yang disiapkan untuk analisis sel utuh seperti flow-cytometry (Johne et al., 1997; Me'rant et al., 2003; Terio et al., 2003; Kunisch et al., 2004; Ibrahim et al., 2007) atau pada spesimen segar atau beku (Bilzer et al., 1995; Zeng et al., 1996; Lemos et al., 2008; Ha¨rtig et al., 2009). Pemutaran besar antibodi yang berasal dari non-equine sering mengakibatkan identifikasi terbatas reagen kuda yang reaktif (Ibrahim et al., 2007; Schnabel et al., 2013; Szabo & Gulya, 2013). Dari 26 antibodi dalam penelitian ini, enam antibodi berhasil bereaksi dengan jaringan equine FFPE. Keenam antibodi itu berasal dari antigen non-equine. Reaktivitas mereka terhadap jaringan kuda kemungkinan karena target epitop yang dikonservasi dan lokasi intraseluler peptida antigen (Jones et al., 1993; Ahmed et al., 2007). Jika sekuens peptida antigen sangat terkonservasi di berbagai spesies, produksi antibodi dari inang yang diimunisasi dapat dihambat karena toleransi imun. Namun, karena antigen- antigen ini memiliki asal-usul intraseluler, inang (mis. Kelinci atau tikus) lebih mungkin untuk memperoleh respons imun pada paparan antigen. Dengan cara ini, antibodi ini terhadap antigen manusia atau babi dapat berhasil diproduksi dan bereaksi dengan equine atau jaringan spesies lain. Antibodi makrofag komersial tidak spesifik untuk makrofag dan sering bereaksi silang dengan monosit, granulosit, sel dendritik, dan fibroblas (Johne et al., 1997; Kunisch et al., 2004; Shaw et al., 2005; Sellner et al., 2014). Beberapa antibodi yang diarahkan makrofag dengan antigen target berbeda diuji sehingga perbedaan dapat dibuat antara populasi jaringan makrofag dan sel yang dapat bereaksi silang dengan antibodi tersebut. RAM11 (Dako, Glostrup, Denmark) mengenali antigen sitoplasma yang tidak dikarakterisasi khusus untuk makrofag kelinci. Antibodi anti-makrofag AM-3K (TransGenic, Strasborg, Prancis) yang dimunculkan terhadap antigen makrofag alveolar manusia mengenali epitop membran sitoplasma. Anti-CD68 + (KP1; Leica, Wetzlar, Jerman) mengakui terutama protein membran lisosom makrofag, membran makrofag sekunder, dan ditemukan pada monosit, neutrofil, basofil, dan limfosit besar. Tidak satu pun dari ketiga antibodi ini yang berhasil reaktif di otak FFPE atau jaringan limfoid. Meskipun sering digunakan sebagai penanda karakterisasi makrofag, MAC387 + (Leica, Wetzlar, Jerman) mengenali sitoplasma, antigen leukosit manusia, protein L1 yang ditemukan pada neutrofil, monosit, dan makrofag reaktif tertentu. Hanya antibodi MAC387 + yang reaktif dengan jaringan kuda FFPE, sehingga populasi yang bernoda positif harus dipertimbangkan sebagai campuran makrofag dan neutrofil. Populasi sel ini memiliki distribusi yang berbeda dalam bagian serial otak yang terinfeksi WNV yang masing-masing di-imunolabel untuk MAC387 +, limfosit T CD3 +, dan mikroglia. Dalam jaringan equine yang terinfeksi S. neurona, di mana sel raksasa multinukleasi diamati, antibodi MAC387 + tidak bereaksi dengan sel-sel ini meskipun ada reaksi dengan sel tunggal dalam setiap lesi. Mikroglia, yang merupakan keturunan monosit, diidentifikasi dengan antibodi anti-Iba-1 (Wako, Neuss, Jerman). Antibodi ini mengenali protein pengikat kalsium intraseluler yang pada dasarnya diekspresikan oleh mikroglia dan makrofag, dan diregulasi dalam mikroglia setelah cedera. Morfologi sel, khususnya proses mikroglial, dapat digunakan untuk memisahkan mikroglia dan populasi makrofag secara manual. Sejumlah studi kuda terbatas telah menyelidiki aktivasi mikroglial menggunakan penanda histokompatibilitas utama (MHC) (Mullen, Buck & Smith, 1992; Lemos et al., 2008). MHC terutama menargetkan populasi mikroglia teraktivasi, sedangkan antibodi anti-Iba-1 + akan menodai mikroglia baik dalam bentuk istirahat maupun aktifnya (Szabo & Gulya, 2013). Selain itu, menggunakan MHC sebagai penanda untuk sel mikroglial dalam penyakit inflamasi juga akan mengidentifikasi semua sel perifer dan SSP yang memiliki MHC diregulasi karena proses biologis ini. Oleh karena itu, karakterisasi dari total, baik yang beristirahat maupun yang diaktifkan, populasi mikroglia ditingkatkan dengan penggunaan antibodi Iba-1 + (Ahmed et al., 2007). Mengenai deteksi neuron, harus diakui bahwa protein NF-H terkonsentrasi dalam akson dan lemah hadir dalam tubuh sel. Perubahan intensitas pewarnaan dalam sel tubuh dan dendrit dengan antibodi NF-H, seperti NAP4 yang menargetkan protein NF-H terfosforilasi, berguna untuk mengidentifikasi neuropatologi (Shaw et al., 2005; Sellner et al., 2014). Untuk kuantifikasi populasi neuron, harus digunakan antibodi khusus untuk inti neuron. Antibodi Neu-N, yang menargetkan protein pengikat DNA dari inti saraf, biasanya digunakan untuk pewarnaan dan penghitungan perikaryon neuron (Mullen, Buck & Smith, 1992). Studi ini berhasil mengidentifikasi kumpulan protokol untuk karakterisasi populasi sel dalam histopatologi penyakit ensefalitis dalam jaringan SSP kuda. Rangkaian ini termasuk pewarnaan IHC limfosit T CD3 +, limfosit CD79acy + B, makrofag dan neutrofil MAC387 +, mikroglia Iba-1 +, astrosit GFAP +, dan neuron NF-H + pada jaringan FFPE. Rangkaian ini diperluas dengan memasukkan limfosit T CD4 + dan CD8 + di bagian jaringan yang segar dan beku. Aplikasi yang berguna dari antibodi ini didukung dengan karakterisasi neuropatologi pada kuda yang sakit dengan ensefalitis West Nile klinis dan eksperimental, mieloensefalitis protozoa kuda klinis, dan, awalnya, ensefalitis kuda equin klinis. Analisis western blot menggunakan antibodi ini selanjutnya harus dilakukan untuk mendukung spesifisitas reaktivitasnya pada kuda.
