Hitungan Cawan - WordPress.com
advertisement
Tanggal Praktikum Praktikum 3.3 23 Maret 2015 HITUNGAN CAWAN A. Prelab 1. Jelaskan prinsip dari metode hitungan cawan ! Prinsip dari metode hitungan cawan adalah jumlah mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba (Sumardjo, 2006). 2. Apakah metode hitungan cawan dapat menghitung jumlah sel? Menurut anda mengapa demikian? Jelaskan! Metode hitungan cawan ini dapat menghitung jumlah sel, karena prinsip dari metode hitungan cawan sendiri adalah menghitung jumlah koloni mikroba yang telah dibiakkan yang bisa dilakukan tanpa bantuan mikroskop. Dalam metode ini hanya sel yang masih hidup saja yang dapat dihitung, beberapa jenis mikroba juga dapat dihitung sekaligus serta dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu mikroba yang mempunyai penampakan pertumbuhan secara spesifik. Namun hasil perhitungan tidak selalu menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena sel yang berdekatan kemungkinan membentuk koloni (Harvey, 2007). 3. Apakah yang dimaksud dengan metode pour plate dan spread plate pada hitungan cawan? Jelaskan! Metode pour plate dilakukan dengan cara menuangkan kultur ke dalam cawan petri bersama dengan media yang sudah disterilkan dan diturunkan suhunya. Metode pour plate ini mempunyai kekurangan yaitu membutuhkan waktu yang lama dan bahan yang relatif banyak tetapi tidak memutuhkan keterampilan tinggi (Leong, 2005). Metode spread plate dilakukan dengan menyemprotkan suspensi ke atas medium agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan spreader. Dengan ini diharapkan bakteri terpisah secara individual, kemudian dapat tumbuh menjadi koloni tunggal (Rao, 2008). 4. Jelaskan prinsip pengujian biru metilen pada produk susu! Prinsip dari uji waktu reduktase adalah dalam susu terdapat enzim reduktase yang dibentuk oleh kuman-kuman, maka enzim ini akan mereduksi zat biru metilen menjadi larutan tidak berwarna. Semakin tinggi jumlah kuman di dalam susu, semakin cepat terjadi perubahan warna, maka dilakukan uji reduksi biru metilen yang dapat memberikan gambaran perkiraan jumlah kuman yang terdapat di dalam susu, kemudian diamati waktu yang dibutuhkan oleh kuman untuk melakukan aktifitas yang dapat menyebabkan perubahan warna dari zat warna biru metilen (Saragih, 2013). B. Diagram Alir a. Sampel Daging/Ikan Ikan Mujaer Di swab sebanyak 3 kali Swab direndam dalam pengencer Swab diputar-putar dan diperas pada dinding tabung Dilakukan pengenceran hingga 10-5 Diinokulasikan pada cawan petri dengan metode pour dan spread 3 pengenceran terakhir dengan menggunakan media SSA dan NA Diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam Dihitung jumlah koloni yang tumbuh pada media Hasil b. Sampel Sayuran Kubis Dipotong secara aseptis 2 x 2,5 cm Dicelupkan potongan tersebut ke dalam labu erlenmeyer berisi 25 ml larutan pengencer Dikocok sebanyak 25 kali Dilakukan pengenceran hingga 10-4 Diinokulasikan pada cawan petri dengan metode pour dan spread 3 pengenceran terakhir dengan menggunakan media MRSA dan NA Diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam Dihitung jumlah koloni yang tumbuh pada media Hasil c. Sampel Olahan Bakso Dipotong secara aseptis sebanyak 5 gram Dihancurkan Dilarutkan dalam pepton 45 ml (pengenceran 10-1) Dilakukan pengenceran hingga 10-5 Diinokulasikan pada cawan petri dengan metode spread dan pour 3 pengenceran terakhir dengan menggunakan media PCA dan VRBA Diinokulasi pada suhu 37°C selama 24 jam Dihitung jumlah koloni pada media Hasil 2. Tuliskan tahapan dan cara perhitungan anda untuk mendapatkan jumlah koloni pada masing-masing sampel ! Analisa Prosedur Pada praktikum ini, percobaan yang dilakukan adalah menghitung bakteri pada suatu sampel dengan menggunakan hitungan cawan dan pada kelompok kami menggunakan sampel olahan berupa bakso yang dibeli di kantin Kopma Universitas Brawijaya pada tanggal 23 Maret 2015. Alat dan bahan yang disiapkan adalah bunsen burner, 4 tabung reaksi yang telah berisi pepton 10 ml, alkohol 70%, beaker glass, tisu, sampel olahan berupa 1 buah bakso dengan berat + 5 gram, plastik PE, cobek, mikropipet, mikrotip, vortex, media agar cair VRBA, media agar cair PCA, 6 cawan petri kosong, 3 cawan petri berisi media agar padat VRBA, 3 cawan petri berisi media agar padat PCA dan 45 ml pepton. Langkah pertama adalah aseptis diri dan lingkungan dilanjutkan dengan menghancurkan sampel olahan berupa bakso. Bakso dimasukkan ke dalam plastik PE kemudian ditumbuk dan dihancurkan hingga halus dengan menggunakan cobek dari bagian luar plastik PE, ke dalam plastik PE ditambahkan 45 ml pepton dan dilanjutkan lagi penumbukkan hingga pepton bercampur dengan bakso, saat ditumbuk diusahakan plastik PE tidak sampai terjadi kerusakan, penambahan pepton 45 ml ini sudah termasuk kedalam pengenceran 10-1. Selanjutnya larutan pepton diambil dengan menggunakan mikropipet 1 ml. Tabung reaksi yang berisi mikrotip dibuka sedikit penutupnya, lalu mikropipet ditancapkan pada mikrotip dan ditarik keluar. Plastik PE yang berisi sampel olahan berupa bakso dibuka sedikit, tombol pada ujung mikropipet ditekan penuh namun tidak sampai terlalu dalam, mikropipet dimasukkan kedalam plastik PE dan diarahkan pada larutan pepton yang telah bercampur dengan bakso, tombol pada ujung mikropipet dilepaskan, mikropipet dikeluarkan dan plastik PE yang berisi sampel ditutup. Selanjutnya tabung reaksi yang berlabelkan 10-2 dipegang ditangan kiri, dan mikropipet masih ditangan kanan, sumbat atau tutup kapas pada mulut tabung reaksi dibuka dengan cara menjepitnya dengan menggunakan jari kelingking dan jari manis tangan kanan kemudian, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar diatas api bunsen, kemudian mikropipet dimasukkan dan tombol pada ujung mikropipet ditekan hingga penuh masuk kedalam sehingga semua cairan didalam mikrotip keluar. Mikropipet lalu dikeluarkan, mulut tabung reaksi kembali dipanasi dengan menggunakan api bunsen dan selanjutnya ditutup. Tabung reaksi berlabel 10-2 yang telah dicampuri pepton yang mengandung sampel olahan berupa bakso selanjutnya divortex hingga terbentuk pusaran air didalam tabung reaksi yang menandakan bahwa larutan telah bercampur. Setelah dipastikan larutan bercampur dengan sempurna, selanjutnya dilakukan pengenceran 10-3 hingga 10-5, ganti mikrotip setiap selesai mengencerkan dari tabung reaksi satu ke tabung reaksi lainnya. Selesai dengan pengenceran kemudian sampel dari tiga pengenceran terakhir diinokulasikan pada masing-masing cawan petri yang telah dilabeli dengan metode pour dan metode spread dengan menggunakan media VRBA dan PCA. Cara yang dilakukan untuk metode pour adalah pertama aseptis diri dan lingkungan. Selanjutnya memegang tabung reaksi yang berisi sampel yang akan diinokulasikan ditangan kiri dan mikropipet yang ujungnya telah terpasang mikrotip 1 ml ditangan kanan, menekan tombol diujung mikropipet hingga penuh namun tidak sampai masuk terlalu dalam, sumbat kapas pada tabung reaksi dibuka dengan cara dijepit dengan menggunakan jari kelingking dan jari manis tangan kanan kemudian ditarik keluar, setelah terbuka kemudian mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar diatas api bunsen lalu mikropipet dimasukkan hingga ujung mikrotip terendam, tombol pada ujung lain mikropipet dilepaskan hingga larutan pepton yang mengandung sampel masuk ke dalam mikrotip, mikropipet dikeluarkan dan mulut tabung reaksi dipanaskan sekali lagi untuk selanjutnya ditutup. Tabung reaksi diletakkan kembali di rak tabung. Cawan petri steril yang masih kosong dipegang ditangan kiri, dan mikropipet yang mengandung sampel masih dipegang ditangan kanan, pinggiran cawan petri dipanaskan diatas api bunsen kemudian dibuka sedikit, mikropipet dimasukkan kemudian tombol pada ujung ditekan hingga penuh masuk ke dalam, mikropipet dikeluarkan dan pinggiran cawan petri dipanaskan sekali lagi, dilepas mikrotip dan diletakkan terpisah seperti dimasukkan kedalam gelas beker, mikropipet diletakkan, selanjutnya memegang erlenmeyer yang mengandung media ditangan kanan, sumbat kapas dibuka dan mulut erlenmeyer dipanaskan, pinggiran cawan petri dipanaskan lagi lalu cawan petri dibuka sedikit, media didalam erlenmeyer dituangkan ke dalam cawan petri secukupnya hingga seluruh dasarnya tertutupi oleh media, kemudian cawan petri ditutup dan pinggirannya dipanaskan sekali lagi, mulut erlenmeyer dipanaskan sekali lagi dan ditutup kembali dengan menggunakan sumbat kapas, media dan sampel didalam cawan petri selanjutnya dicampurkan dengan cara digoyangkan cawan petri diatas meja rata membentuk angka 8 (delapan), dibiarkan sebentar hingga dingin, setelah dingin kemudian dibungkus dengan menggunakan kertas payung namun terlebih dahulu cawan petri dibalik sehingga posisi tutup atau yang lebih luas berada dibawah, setelah dibungkus kemudian diinkubasi didalam inkubator dengan suhu 37°C selama 24 jam sebelum dilakukan pengamatan untuk dihitung jumlah koloni yang tumbuh. Melakukan kegiatan yang sama untuk metode pour untuk pengenceran mulai dari 10-3 hingga 10-5 dengan media VRBA dan PCA, ganti mikrotip setiap selesai memindahkan sampel dari tabung reaksi ke cawan petri untuk menghindari kontaminasi dari sampel sebelumnya sehingga tidak terjadi kerancuan data. Setelah selesai dengan metode pour, selanjutnya dilakukan metode spread. Pertama dilakukan aseptis lingkungan, selanjutnya mengaseptis diri sendiri. Jika dirasa telah aseptis kemudian memegang tabung reaksi dengan pengenceran 10-3 ditangan kiri dan mikropipet steril yang diujungnya telah terpasang mikrotip 0,1 ml ditangan kanan, tombol pada ujung mikropipet ditekan penuh namun tidak sampai masuk dalam, sumbat kapas tabung reaksi dijepit dengan jari kelingking dan jari manis tangan kanan kemudian ditarik untuk membukanya, mulut tabung reaksi dipanaskan diatas api sebentar kemudian mikropipet dimasukkan kedalam tabung reaksi hingga mikrotip terendam separuhnya, tombol pada ujung atas mikropipet dilepaskan sehingga larutan sampel masuk ke dalam mikrotip, mikropipet selanjutnya ditarik keluar, mulut tabung reaksi kembali dipanaskan sebentar dan ditutup kembali dengan menggunakan sumbat kapas. Tabung reaksi diletakkan kembali pada rak tabung, cawan petri steril yang telah berisi media dipegang ditangan kiri sementara mikropipet yang sama masih dipegang ditangan kanan, pinggiran cawan petri dipanaskan sebentar diatas api bunsen kemudian dibuka sedikit, mikropipet dimasukkan mikrotipnya saja selanjutnya tombol pada ujung atas mikropipet ditekan penuh hingga masuk kedalam, mikropipet dikeluarkan dan diletakkan, cawan petri ditutup lalu dipanaskan kembali sebentar diatas api bunsen. Trigalski atau spreader dipegang ditangan kanan, spreader disterilisasi dengan cara mencelupkan ujung spreader yang akan digunakan kedalam alkohol kemudian dipanaskan di atas bunsen, dilakukan pensterilan hingga tiga kali, kemudian pinggiran cawan petri dipanaskan kembali sebentar dan dibuka sedikit, spreader yang telah steril dimasukan untuk meratakan sampel. Setelah sampel rata, spreader ditarik keluar dan dipanaskan sebentar di atas api bunsen, cawan petri ditutup dan pinggirannya kembali dipanaskan sebentar di atas api bunsen. Cawan petri langsung dibungkus dengan kertas payung namun terlebih dahulu dibalik, kemudian dimasukan kedalam inkubator untuk diinkubasikan dengan suhu 37°C selama 24 jam, pada percobaan ini menggunakan PCA karena media ini sesuai untuk semua jenis mikroorgansime sementara VRBA digunakan untuk mendeteksi keberadaan dari enterobakter yang biasanya terdapat pada produk olahan seperti bakso, sosis dan nuget. Sampel yang kedua dari kelompok lain adalah sayuran kubis yang dibeli secara acak tanpa diketahui tempat dan tanggal pembeliannya. Alat dan bahan yang diperlukan sama seperti percobaan pertama, namun sampel diganti dari sampel olahan berupa bakso menjadi sampel sayur berupa kubis dan media yang digunakan adalah MRSA dan NA, media MRSA digunakan untuk mendeteksi adanya kandungan bakteri lacto meskipun tidak terlalu patogen atau bersifat toksin lemah, sementara NA cocok digunakan untuk menumbuhkan semua bakteri. Pertama mengaseptis diri dan lingkungan, setelah dirasa aseptis kemudian mengupas kubis hingga tiga kali sehingga yang digunakan untuk percobaan adalah daun kubis yang terletak pada lapisan ke-empat. Kubis selanjutnya dipotong secara aseptis 2x2,5 cm kemudian potongan tersebut dicelupkan kedalam labu erlenmeyer yang berisi 25 ml larutan pengencer berupa pepton. Kemudian erlenmeyer dikocok sebanyak 25 kali untuk mencampurkan larutan dengan sampel. Selanjutnya larutan didalam sampel diambil dengan menggunakan mikropipet steril untuk dilakukan pengenceran hingga 10-4, dilakukan hanya sampai 10-4 karena lebih dari itu maka bakteri dianggap sudah tidak tumbuh lagi atau telah hilang. Tabung reaksi yang berlabelkan 10-2 dipegang ditangan kiri, dan mikropipet yang telah berisi sampel ditangan kanan, sumbat atau tutup kapas pada mulut tabung reaksi dibuka dengan cara menjepitnya dengan menggunakan jari kelingking dan jari manis tangan kanan kemudian ditarik, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar diatas api bunsen, kemudian mikropipet dimasukkan dan tombol pada ujung mikropipet ditekan hingga penuh masuk kedalam sehingga semua cairan didalam mikrotip keluar. Mikropipet lalu dikeluarkan, mulut tabung reaksi kembali dipanasi dengan menggunakan api bunsen dan selanjutnya ditutup. Tabung reaksi berlabel 10-2 yang telah dicampuri pepton yang mengandung sampel sayuran berupa kubis selanjutnya divortex hingga terbentuk pusaran air didalam tabung reaksi yang menandakan bahwa larutan telah bercampur. Setelah dipastikan larutan bercampur dengan sempurna, selanjutnya dilakukan pengenceran 10-3 dan 10-4, ganti mikrotip setiap selesai mengencerkan dari tabung reaksi satu ke tabung reaksi lainnya. Setelah diencerkan, sampel dalam tiap-tiap tabung reaksi selanjutnya diinokulasikan kedalam cawan petri dengan menggunakan metode pour dan metode spread seperti pada percobaan pertama dengan sampel olahan berupa bakso, namun media pada percobaan kedua ini dengan sampel sayur berupa kubis adalah MRSA dan NA. Setelah diinokulasikan kemudian diinkubasikan didalam inkubator bersuhu 37°C selama 24 jam. Sampel yang ketiga adalah sampel ikan berupa ikan mujaer yang dibeli pada tanggal 22 Maret 2015 tanpa diketahui tempat pembeliannya. Alat dan bahan yang dibutuhkan juga sama seperti pada percobaan-percobaan sebelumnya, namun sampel diganti menjadi ikan mujaer, media yang digunakan adalah SSA dan NA, digunakan media SSA karena untuk mendeteksi keberadaan dari bakteri salmonella didalam ikan dan NA cocok untuk menumbuhkan semua jenis bakteri, dan ditambah alat berupa swab atau cottonswab. Pertama dilakukan aseptis lingkungan dan diri. Jika telah aseptis, selanjutnya ikan diswab permukaanya sebanyak tiga kali kemudian ikan difillet dan diswab kembali bagian yang telah difillet sebanyak tiga kali kemudian difillet sekali lagi dan diswab kembali, saat diswab dipastikan satu arah supaya tidak ada sampel yang telah menempel pada swab tidak kembali ke semula. Swab kemudian direndam dalam larutan pengencer lalu swab diputarputar dan diperas dengan cara ditekankan pada dinding tabung reaksi hingga semua larutannya keluar. Kemudian dilakukan pengenceran hingga 10-5. Caranya adalah larutan didalam tabung reaksi diambil dengan menggunakan mikropipet yang diujungnya telah tertancap mikrotip 1 ml, tombol pada ujung atas mikropipet ditekan hingga penuh kemudian mikropipet dimasukkan kedalam tabung reaksi hingga mikrotipnya terendam sebagian, tombol dilepaskan, tabung reaksi yang berlabelkan 10-2 dipegang ditangan kiri, dan mikropipet yang telah berisi sampel ditangan kanan, sumbat atau tutup kapas pada mulut tabung reaksi dibuka dengan cara menjepitnya dengan menggunakan jari kelingking dan jari manis tangan kanan kemudian ditarik, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar diatas api bunsen, kemudian mikropipet dimasukkan dan tombol pada ujung mikropipet ditekan hingga penuh masuk kedalam sehingga semua cairan didalam mikrotip keluar. Mikropipet lalu dikeluarkan, mulut tabung reaksi kembali dipanasi dengan menggunakan api bunsen dan selanjutnya ditutup. Tabung reaksi berlabel 10-2 yang telah dicampuri pepton yang mengandung sampel sayuran berupa kubis selanjutnya divortex hingga terbentuk pusaran air didalam tabung reaksi yang menandakan bahwa larutan telah bercampur. Setelah dipastikan larutan bercampur dengan sempurna, selanjutnya dilakukan pengenceran 10-3 hingga 10-5, ganti mikrotip setiap selesai mengencerkan dari tabung reaksi satu ke tabung reaksi lainnya. Setelah diencerkan, sampel dalam tabung reaksi dengan pengenceran 10-3 hingga 10-5 selanjutnya diinokulasikan kedalam cawan petri dengan menggunakan metode pour dan metode spread seperti pada percobaan pertama dengan sampel olahan berupa bakso, namun media pada percobaan kedua ini dengan sampel ikan berupa ikan mujaer adalah SSA dan NA. Setelah diinokulasikan kemudian diinkubasikan didalam inkubator bersuhu 37°C selama 24 jam. Setelah 24 jam, cawan petri yang berisi sampel kemudian dikeluarkan dari inkubator untuk diamati dan hitung jumlah koloni yang tumbuh didalamnya baik yang aerob pada metode spread dan metode pour maupun yang anaerob pada metode pour saja. Tanda dari tumbuh dan berkembangnya bakteri dari sampel didalam media adalah adanya totol-totol yang menyebar secara menyeluruh di media. Jumlah totol yang dianggap koloni ini selanjutnya dihitung untuk dapat mengetahui jumlah total koloni pada media. Gunakan masker dan sarung tangan saat percobaan, mengamati dan menghitung sebagai langkah keselamatan dan pencegahan dari terinfeksi bakteri terutama pada sampel ikan dan media SSA karena yang tumbuh merupakan bakteri patogen salmonella yang dapat menyebabkan tipus. 3. Bahaslah hasil yang anda peroleh pada masing-masing media untuk satu jenis sampel bahan pangan ! Rumus dari perhitungannya adalah : π πͺπππππ πππππππ πΌπππ/ππ = π ππππππ ππππππ/ππππ ππππππ πππππππππππ 3.1 Sampel Ikan Jumlah Koloni Pada Media Pour Spread Media Pengenceran Pengenceran Jumlah Jumlah Koloni Koloni 10-3 10-4 10-5 10-3 10-4 10-5 6 NA 392 232 356 2,3x10 348 388 0 3,5x106 4 SSA 10 0 TBUD 1,0x10 1 0 0 1,0x104 a. Medium NA Pour : 232 x 1/10-4 = 2,3 . 106 CFU/gr Spread : 348 x 1/10-2 = 3,5 . 106 CFU/gr b. Medium SSA Pour : 10 x 1/10-4 = 1,0 . 104 CFU/gr Spread : 1 x 1/10-3 = 1,0 . 104 CFU/gr Setelah dilakukan percobaan dan pengamatan, didapatkan jumlah koloni pada media seperti pada tabel diatas. Pada metode pour dengan media NA, jumlah koloni pada pengenceran 10-3 adalah 392 dan pada pengenceran selanjutnya yaitu 10-4 adalah 232, namun pada pengenceran berikutnya untuk 10-5 terdapat kekeliruan dimana jumlah koloni yang seharusnya turun justru naik menjadi 356. Kekeliruan juga terjadi untuk metode pour dengan media SSA, pada pengenceran 10-3 didapatkan jumlah koloni sebanyak 10 dan pada pengenceran 10-4 didapatkan jumlah koloni sebanyak 0, namun pada pengenceran 10-5 dimana seharusnya jumlah koloni adalah 0 justru menjadi Terlalu Banyak Untuk Dihitung (TBUD). Pada metode spread, kesalahan terjadi pada media NA dimana jumlah koloni pada pengenceran 10-4 yaitu 388 lebih banyak dari pada jumlah koloni pada pengenceran 10-3 yaitu 348, untuk metode spread dengan media SSA, hasil telah sesuai dengan teori dan literatur. Telah terjadi kesalahan pada percobaan ini karena menurut teori jumlah koloni setiap diencerkan akan semakin sedikit dan semakin turun jumlahnya, namun pada percobaan ini justru sebaliknya, data menjadi rancu dan tidak akurat. Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor antara lain praktikan kurang cermat dalam melakukan percobaan, kurang aseptis, terlalu lama melakukan pengenceran dari tabung reaksi satu ke tabung reaksi lainnya dan pemindahan sampel dari tabung reaksi ke cawan petri, pencampuran dengan menggunakan vortex tidak dilakukan dengan benar sehingga sampel dengan larutan tidak tercampur dengan sempurna sehingga yang diambil tidak dapat mewakili populasi, kontaminasi dari luar yang menyebabkan pertumbuhan bakteri sampel terganggu meskipun telah memakai media yang khusus. 3.2 Sampel Sayur Kubis Media -2 Jumlah Koloni Pada Media Pour Spread Pengenceran Pengenceran Jumlah -3 -4 -2 Koloni 10 10 10 10-3 10-4 6 2 8,0x102 10 7 5 2 5 6 8,0x10 TBUD 9 52 10 NA 8 MRSA 8 a. Medium NA Pour : 8 x 1/10-2 = 8,0 . 102 CFU/gr Spread : 10 x 1/10-2 = 1,0 . 104 CFU/gr b. Medium MRSA Pour : 8 x 1/10-2 = 8,0 . 102 CFU/gr Spread : 52 x 1/10-2 = 5,2 . 106 CFU/gr Jumlah Koloni 1,0x104 5,2x106 Untuk sampel sayur berupa kubis, nilai yang didapatkan terlalu kecil. Hal ini disebabkan karena sampel diambil dari bagian layer ke 4 setelah permukaan sehingga diduga jumlah bakteri yang hidup terlalu sedikit atau lemah untuk tumbuh dan berkembang pada media. Untuk metode pour dengan media NA pada pengenceran 10-2 didapatkan jumlah koloni sebesar 8, pada pengenceran 10-3 sebesar 6 dan pada 10-4 sebesar 2. Masih dimetode pour, namun dengan media MRSA, pada pengenceran 10-2 didapatkan jumlah bakteri sebesar 8, pada pengenceran 10-3 sebesar 5 dan pada pengenceran 10-4 sebesar 6. Secara teori, jumlah koloni bakteri setiap kali diencerkan selalu menurun namun jumlah ini terlalu sedikit untuk memenuhi syarat statistik nilai koloni antara 30 – 300 sehingga tidak dapat mewakili sampel dari populasi bakteri. Untuk metode spread dengan Media NA pada pengenceran 10-2 didapatkan jumlah koloni sebesar 10, pada pengenceran 10-3 sebesar 7 dan pada 10-4 sebesar 5. Masih dimetode spread, namun dengan media MRSA, pada pengenceran 10-2 jumlah koloni TBUD, pada pengenceran 10-3 jumlah bakteri menurun ekstrem menjadi 9 dan pada pengenceran 10-4 meningkat menjadi 52. Kembali terjadi kesalahan dimana pada pengenceran 10-3 untuk metode spread dengan media MRSA nilainya lebih rendah daripada pengenceran 10-4. Ini dapat disebabkan karena kurang homogennya larutan dengan sampel sehingga saat diambil, jumlahnya bakteri sangat sedikit, dapat pula terjadi karena bakteri yang ditumbuhkan mati terkena spreader yang masih panas. 3.3 Sampel Bakso Jumlah Koloni Pada Media Pour Pengenceran Jumlah -3 -4 -5 Koloni 10 10 10 PCA TBUD TBUD 129 1,3x107 VRBA TBUD TBUD 191 1,9x107 a. Medium PCA Pour : 129 x 1/10-5 = 1,3 . 107 CFU/gr Spread : 204 x 1/10-4 = 2,0 . 107 CFU/gr b. Medium VRBA Pour : 191 x 1/10-2 = 1,9 . 107 CFU/gr Spread : 235 x 10-4 = 2,4 . 107 CFU/gr Media Spread Pengenceran 10-3 10-4 10-5 TBUD 204 9 TBUD 235 184 Jumlah Koloni 2,0x107 2,4x107 Setelah diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C, lalu dikeluarkan dan dilakukan penghitungan jumlah koloni yang hidup pada media di dalam cawan. Pada metode pour dengan media PCA untuk pengenceran 10-3 dan 10-4, koloni yang hidup dan tumbuh didalam cawan jumlahnya terlalu banyak melebihi dari syarat penghitungan statistik yaitu diatas 300 sehingga dapat dianggap TBUD atau Terlalu Banyak Untuk Dihitung. Hal ini juga terjadi pada metode pour dengan media VRBA untuk pengenceran 10-3 dan 10-4, TBUD dapat terjadi akibat terlalu rendahnya pengenceran sehingga perlu diencerkan kembali sekali lagi, ini terbukti dari hasil pengenceran berikutnya untuk metode pour dengan media PCA dan VRBA. Pada media PCA dengan pengenceran 10-5, didapatkan jumlah koloni yang terhitung sebesar 129 dan pada media VRBA dengan pengenceran 10-5 didapatkan jumlah koloni yang terhitung sebesar 191. TBUD pada media pour dapat juga terjadi karena yang tumbuh pada media adalah dua jenis bakteri, yaitu aerob pada permukaannya dan anaerob pada bagian dalam media. Untuk metode spread dengan media PCA dan media VBRA, pada pengenceran 10-3 keduanya sama-sama menunjukan hasil TBUD yang menandakan pengenceran masih terlalu rendah sehingga harus diencerkan kembali, Ini terbukti pada hasil selanjutnya dimana pada pengenceran 10-4 pada media PCA didapatkan hasil sebesar 204 dan pada media VRBA dengan pengenceran 10-4 didapatkan hasil sebesar 235. Pengeceran kembali ditingkatkan hingga 10-5 dan didapatkan hasil untuk media PCA sebesar 9 dan pada media VRBA sebesar 184. 4. Apa kesimpulan yang dapat ditarik dari praktikum ini? Prinsip dari Hitungan Cawan adalah menumbuhkan sel-sel mikroba yang masih hidup pada suatu atau beberapa media sehingga sel tersebut berkembang biak dan membentuk koloni-koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata telanjang tanpa menggunakan mikroskop. Dari praktikum kali ini, kita mendapatkan hasil berupa jumlah koloni yang tumbuh pada suatu media yang didapatkan dari sampel tertentu. Pada sampel ikan mujaer,dengan metode spread plate pada media SSA koloni yang tumbuh sebesar 1,0x104 CFU/g. Sedangkan pada media NA sebanyak 3,5x106 CFU/g koloni tumbuh. Untuk media SSA selanjutnya dengan metode pour plate, didapatkan koloni dengan jumlah 1,0x104 CFU/g. Sedangkan pada media NA, didapatkan koloni sejumlah 2,3x106 CFU/mL. Selanjutnya pada sampel kubis dengan metode spread plate pada media MRSA, kita mendapatkan koloni sebanyak 5,3x106 CFU/g dan pada media NA sebanyak 1,0x104 CFU/g. Sedangkan pada metode pour plate dengan media MRSA, kita mendapatkan koloni sebanyak 8,0x102 CFU/g dan pada media NA sebanyak 8,0x102 CFU/g. Pada sampel bakso, dengan metode spread plate pada media VRBA, kita dapatkan jumlah koloni sebanyak 2,4x107 CFU/g dan pada media PCA, koloni nya berjumlah 2,0x106 CFU/g. Untuk metode pour plate pada media VRBA, kita dapatkan koloni sejumlah 1,9x107 CFU/g dan pada media PCA sebanyak 1,3x107 CFU/g. D. Pembahasan 1. Sebutkan kelebihan dan kekurangan dari metode pour plate dan spread plate. Kapan kita dapat menggunakan metode tersebut? Jelaskan alasan anda! Metode agar tuang dilakukan dengan mencampurkan sampel pada media padat yang mendukung pertumbuhan mikroorganisme, dan kemudian menginkubasi pelat sehingga setial sel bakteri dapat membelah dan membentuk koloni. Dengan demikian, jumlah koloni dapat dihitung. Kelebihannya adalah mudah untuk dilakukan dan koloni dapat tersebar merata pada media. Kekurangannya butuh kehati-hatian dalam menuang ke media, kontaminasi sulit untuk dibedakan, koloni yang berbeda saling bertumpuk (Harmita, 2008). Teknik sebar di atas pelat agar adalah menyebarkan sampel (yang telah diencerkan) di atas permukaan pelat agar rata di dalam cawan petri. Umumnya 0,1 ml sampel disebarkan di permukaan media padat dengan menggunakan tangkai gelas steril. Kelebihannya koloni tersebar merata pada permukaan media, kontaminan mudah dibedakan.Kekurangannya harus dilakukan dengan hati-hati, hanya dapat menumbuhkan bakteri aerob (Harmita, 2008). 2. Apa kelebihan perhitungan mikroba dengan metode hitungan cawan dibanding metode enumerasi langsung? Murah, mudah dan praktis untuk dilakukan. Sederhana dan dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi bakteri dalam suatu sampel. Tidak memerlukan bantuan mikroskop untuk menghitung. Hanya sel mikroba hidup yang dapat dihitung (Dwidjoseputro, 2005). 3. Mengapa yang digunakan dalam aturan SPC hanya koloni yang berjumlah 30-300 saja? Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni adalah yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni. Karena jika lebih dari 300 maka koloni dapat dianggap saling bertumpuk yang dapat mempengaruhi keakuratan data, penyebab dari koloni lebih dari 300 adalah terlalu rendahnya pengenceran. Jika dibawah 30, data statistik mikroba yang dihasilkan terlalu rendah, penyebab dari koloni kurang dari 30 adalah terlalu tingginya pengenceran (Taniwaki, 2013). 4. Apakah yang dimaksud dengan ”TNTC atau TBUD” pada pengamatan hitungan cawan? Dan mengapa hal tersebut bisa terjadi? Jelaskan! Dalam bahasa Inggris, TNTC adalah singkatan dari dari “Too Numerous To Count” atau dalam Bahasa Indonesia menjadi TBUD yang berarti “Terlalu Banyak Untuk Dihitung”. Hal ini dapat terjadi karena faktor pengencerannya masih rendah sehingga konsentrasi bakteri di dalam suspensi masih banyak. Bisa juga karena penyebaran yang kurang merata sehingga membuat bakteri tumbuh secara bertumpuk dan susah dihitung. Hal ini dapat diatasi dengan membuat pengenceran yang lebih tinggi lagi dan lebih memperhatikan homogenisasi di setiap penginokulasian. Namun hal ini bisa juga terjadi karena adanya kontaminan yang masuk ke dalam media dan ikut berproses. Karena itu, para praktikan harus lebih memperhatikan penggunaan teknik aseptis di setiap penginokulasian (Harmita, 2008). 5. Berikut ini data hasil plating dari sampel kefir de carrota pada media MRSA. Hitung jumlah koloni berdasarkan metode SPC! Sampel Ke1 2 3 Jumlah koloni Pada Pengenceran 10-4 10-5 10-6 TBUD 305 89 TBUD 248 82 189 52 21 4 5 TBUD 18 TBUD 7 23 0 Hitung berapa jumlah koloni per mL nya berdasarkan aturan SPC. Tuliskan tahapan penghitungan anda! 1. Pengenceran yang diambil adalah pengenceran 10-6 karena pada pengenceran tersebut menghasilkan jumlah koloni kisaran 30-300. Jumlah koloni per ml = 8,9 x 107 CFU per ml 2. Karena pada dua pengenceran tersebut diperoleh jumlah koloni kisaran 30-300 maka menggunakan rumus. Apabila hasilnya kurang dari 2 maka diambil rata-rata. Apabila hasilnya lebih dari 2 maka diambil pengenceran terendah. Jadi, Jumlah koloni per ml = 2,48 x 107 CFU per ml = 2,5 x 107 CFU per ml 3. Karena pada dua pengenceran tersebut diperoleh jumlah koloni kisaran 30-300 maka menggunakan rumus. Apabila hasilnya kurang dari 2 maka diambil rata-rata. Apabila hasilnya lebih dari 2 maka diambil pengenceran terendah. Jadi, Jumlah koloni per ml = 1,89 x 106 CFU per ml = 1,9 x 106 CFU per ml 4. Karena jumlah koloni kurang dari kisaran 30 dan ada yang TBUD maka yang diambil adalah yang mendekati 30. Jumlah koloni per ml = 2,3 x 107 CFU per ml 5. Karena jumlah koloni kurang dari kisaran 30 maka yang diambil adalah yang mendekati 30. Jumlah koloni per ml = 1,8 x 105 CFU per ml (Harvey, 2007). 6. Mengapa pada analisis hitungan cawan satuan yang digunakan CFU/ml bukan sel per ml? Jelaskan alasan anda! Karena yang dihitung dalam analisis hitungan cawan merupakan koloni dari bakteri bukan tiap selnya. CFU sendiri merupakan singkatan dari Colony Forming Unit atau Unit Koloni yang terbentuk. Tidak mungkin dilakukan penghitungan jumlah sel dengan mata telanjang sehingga yang tampak dan dapat dihitung hanyalah jumlah koloninya saja (Setiawati, 2010). 7. Bagaimana preparasi sampel untuk menghitung jumlah koloni pada permukaan agar? Langkah pertama kita siapkan terlebih dahulu cotton swab yang steril yang telah dicelupkan pada pepton. Kemudian kita oleskan pada sampel di beberapa bagian berbeda. Setelah itu kita celupkan cotton swab yang telah dicelupkan dalam sampel pada larutan pepton 9ml, diulangi sebanyak 3 kali pengulangan. Setelah itu kita homogenisasi dengan vortex. Setelah itu, kita ambil 1 mL sampel dan langsung menginokulasikannya ke dalam cawan yang berisi media dengan metode spread plate dengan menggunakan spreader. Kemudian kita inkubasi selama 2 hari pada suhu 30-32°C lalu kita dapat langsung mengamati koloni yang tumbuh pada permukaan media (Garg, 2010). 8. Bagaimana preparasi sampel untuk menghitung jumlah koloni total/keseluruhan pada sampel makanan padat? Pertama sampel padat diambil secara aseptis sebanyak 5 gram dengan menggunakan alat bantu berupa pisau atau sendok steril, kemudian dimasukkan kedalam plastik steril dan ditambahkan 45 ml pepton, selanjutnya sampel dihancurkan dengan stomacher, lalu larutan pepton yang telah mengandung sampel diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan mikropipet yang diujungnya telah terpasang mikrotip 1 ml. Dihomogenisasi dengan menggunakan vortex. Dilakukan pengenceran kembali hingga ke tingkat yang diinginkan atau diperlukan. Diambil 1 ml untuk diinokulasikan pada media dengan metode pour atau 0,1 ml dengan metode spread. Diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C. Setelah diinkubasi, kemudian dikeluarkan dan dihitung jumlah koloni hidup yang tumbuh dan berkembang pada sampel makanan padat (Irianto, 2006). 9. Faktor-faktor apa saja yang dapat mempengaruhi hasil penghitungan koloni pada metode hitungan cawan, hingga diperoleh hasil TNTC/TBUD atau koloni tidak muncul? 1. Faktor Pengenceran Pengenceran sangat penting karena apabila sampel kita terlalu encer, maka koloni yang terbentuk hanya sedikit saja bahkan menghasilkan TFTC (Too Few To Count). Dan apabila sampel kita terlalu pekat, jumlah koloni yang dihasilkan bisa menjadi sangat banyak bahkan sampai tidak bisa dihitung atau menghasilkan TNTC/TBUD (Waluyo, 2005).. 2. Kontaminasi Kita harus lebih memperhatikan teknik aseptis dan menggunakannya pada setiap kali penginokulasian. Karena apabila ada kontaminan yang masuk, kontaminan tersebut dapat tumbuh bersama kultur yang ingin kita tumbuhkan. Dan apabila kontaminan yang ada terlalu banyak, mereka dapat merusak perhitungan kita karena koloni yang terbentuk jadi menghasilkan TNTC/TBUD (Waluyo, 2005). 3. Pemerataan Sampel Sampel yang kita inokulasikan harus merata pada setiap media. Karena apabila tidak, koloni yang tumbuh bisa bertumpuk-tumpuk dan akan menyulitkan kita dalam menghitung serta menyulitkan kita dalam mendapatkan data yang akurat. Koloni yang bertumpuk-tumpuk akan menyebabkan TNTC/TBUD juga karena jumlahnya yang terlalu banyak (Waluyo, 2005). 10. Perhatikan data plating produk susu berikut ini! Jumlah Koloni pada Pengenceran Petri 1 Petri 2 Petri 3 10-1 TNTC TNTC TNTC -2 10 630 645 591 -3 10 TNTC TNTC TNTC 10-4 5 5 8 Hitunglah total mikroorganisme pada sampel susu tersebut (dalam CFU/ml)! Jelaskan modifikasi prosedur yang dapat anda lakukan untuk memperoleh hitungan cawan yang akurat! Berdasarkan data hasil jumlah koloni yang ada, karena jumlah koloni tidak memenuhi persyaratan maka boleh dihitung dari keduanya. Rata-rata dari pengenceran 10-2 = 622 koloni Jumlah koloni per ml = 6,2 x 104 CFU/ml Rata-rata dari pengenceran 10-4 = 6 koloni Jumlah koloni per ml = 6 x 102 CFU/ml Jadi, modifikasi prosedur yang dapat dilakukan supaya hitungan cawa akurat adalah meninggikan tingkat pengenceran dan menanam semua pengenceran (Graman, 2005) 11. Mengapa pada metode hitungan cawan digunakan media agar? Mengapa dilakukan teknik pengenceran sebelum dilakukan metode plating? Digunakan media agar supaya mudah saat dihitung bakteri akan nampak jelas tanpa memerlukan bantuan mikroskop. Jika menggunakan media cair seperti broth atau pepton, penghitungan akan sangat sulit untuk dilakukan, selain itu jika digunakan media agar, bakteri yang ditumbuhkan dapat berupa aerob maupun anaerob. Dilakukan teknik pengenceran sebelum dilakukan metode plating untuk menghindari terjadinya data TNTC/TBUD karena apabila sampai terjadi maka tidak bisa memenuhi syarat nilai statistik sampel yang mewakili populasi. Koloni yang tumbuh cenderung bertumpuk-tumpuk dan menyebabkan kerancuan sehingga tidak dapat dihitung (Entis, 2005) 12. Mengapa suhu inkubasi yang digunakan pada kisaran suhu tertentu? Apa akibatnya jika suhu inkubasi dinaikkan atau diturunkan dari suhu semula? Karena suhu inkubasi tersebut sudah sangat sesuai dan dapat mendukung pertumbuhan mikroba dengan sangat baik. Suhu tersebut sangat disukai mikroba, oleh karena itu mereka jadi lebih cepat tumbuh dan berkembang biak. Apabila suhu tersebut dinaikkan, maka mikroba tersebut bisa mati atau terdenaturasi kecuali mikroba yang memang bersifat thermophilik. Dan apabila suhu tersebut diturunkan, mikroba tersebut juga akan mati karena tak tahan suhu dingin dan akan rusak karena enzimnya telah inaktif (Pleczar, 2006). E. Kesimpulan Prinsip dari metode hitungan cawan ini adalah menghitung jumlah koloni mikroba yang tumbuh dan membentuk suatu koloni pada media agar tertentu tanpa bantuan mikroskop. Dimana metode yang digunakan adalah metode spread plate dan pour plate. Sedangkan untuk perhitungan metode hitungan cawan ini dapat menggunakan aturan SPC, dimana jumlah koloni yang dihitung adalah antara 30-300 jumlah koloni. Apabila jumlah koloni lebih dari 300, maka jumlah koloni mikroba bisa ditulis dengan TNTC (Too Numerous to Count) karena dianggap terlalu banyak untuk dihitung, namun apabila diketahui nilainya maka dihitung yang paling mendekati 300. Apabila jumlah koloni kurang dari 30, maka yang diambil untuk perhitungan adalah jumlah koloni yang mendekati 30. Dari praktikum kali ini, kita mendapatkan hasil berupa jumlah koloni yang tumbuh pada suatu media yang didapatkan dari sampel tertentu. Pada sampel ikan mujaer,dengan metode spread plate pada media SSA koloni yang tumbuh sebesar 1,0x104 CFU/g. Sedangkan pada media NA sebanyak 3,5x106 CFU/g koloni tumbuh. Untuk media SSA selanjutnya dengan metode pour plate, didapatkan koloni dengan jumlah 1,0x104 CFU/g. Sedangkan pada media NA, didapatkan koloni sejumlah 2,3x106 CFU/mL. Selanjutnya pada sampel kubis dengan metode spread plate pada media MRSA, kita mendapatkan koloni sebanyak 5,3x106 CFU/g dan pada media NA sebanyak 1,0x104 CFU/g. Sedangkan pada metode pour plate dengan media MRSA, kita mendapatkan koloni sebanyak 8,0x102 CFU/g dan pada media NA sebanyak 8,0x102 CFU/g. Pada sampel bakso, dengan metode spread plate pada media VRBA, kita dapatkan jumlah koloni sebanyak 2,4x107 CFU/g dan pada media PCA, koloni nya berjumlah 2,0x106 CFU/g. Untuk metode pour plate pada media VRBA, kita dapatkan koloni sejumlah 1,9x107 CFU/g dan pada media PCA sebanyak 1,3x107 CFU/g. Saran Asisten praktikan dan praktikan adalah sama-sama mahasiswa yang masih belajar, dan praktikan lebih junior daripada asisten praktikan, jadi asisten praktikan sebaiknya membimbing dengan penuh sabar dan mengayomi kepada praktikan yang masih juniornya. Asisten praktikan sebaiknya juga mengenakan masker dan sarung tangan latex untuk memberikan contoh yang baik dan benar. Untuk jumlah dari tiap sampel sebaiknya dibuat lebih banyak lagi karena satu sampel dari satu lokasi tidak dapat mewakili populasi yang cukup luas, melainkan hanya mewakili dari tempat itu saja. DAFTAR PUSTAKA Harvey, Richard A. 2007. Microbiology. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins Leong, Yap Kok, Abdul Hamid Abdul Aziz, Mohd Salleh Mohd Yasin. 2005. Mikrobiologi Makmal. Kuala Lumpur : Universiti Kebangsaan Malaysia Rao, Sridar. 2008. Culture Media. http://www.microrao.com/micronotes/culture_media. pdf. Diakses pada tanggal 8 maret 2015 pada jam 20:16 Saragih, Chandra Immanuel. 2013. Ketahanan Susu Kuda Sumbawa Ditinjau dari Waktu Reduktase, Angka Katalase, Berat Jenis, dan Uji Kekentalan. Denpasar: Universitas Udayana Sumardjo, Damin. 2006. Pengantar Kimia Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran. Jakarta: EGC DAFTAR PUSTAKA TAMBAHAN Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan Entis, P. 2005. Food Microbiology the Laboratory. Washington: Food Processors Institute Garg, N. 2010. Laboratory Manual of Food Microbiology. New Delhi : LK International Publishing House Pvt. Ltd. Graman, P. S., Menegus, M. A. 2005. Microbiology Laboratory Tests. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins Harmita. 2008. Analisis Hayati. Jakarta: EGC Harvey, Richard A. 2007. Microbiology. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins Irianto, Koes. 2006. Mikrobiologi. Bandung: Yrama Widya Pleczar, M.J. 2006. Dasar Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI-Press. Setiawati, Mieke R. 2010. Teknik Aplikasi Konsorsium Bakteri Endofitik. Jakarta: Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Taniwaki, Marta Hirotomi. 2013. Microbiological Examination Methods of Food and Water. New York: CRC Press Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.
