Gardenia_aeromonas (877

877
Aplikasi deteksi Aeromonas hydrophila penghasil aerolysin ... (Lila Gardenia)
APLIKASI DETEKSI Aeromonas hydrophila PENGHASIL AEROLYSIN DENGAN
MENGGUNAKAN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Lila Gardenia, Isti Koesharyani, Hambali Supriyadi, dan Tatik Mufidah
Pusat Riset Perikanan Budidaya
Jl. Ragunan 20 Pasar Minggu, Jakarta Selatan 12540
E-mail: [email protected]
ABSTRAK
Meningkatnya kegiatan intensifikasi budidaya telah menimbulkan dampak negatif antara lain munculnya
berbagai kasus infeksi penyakit. Bakteri merupakan salah satu penyebab penyakit pada ikan. Infeksi bakteri
dapat menyebabkan kematian massal dan merusak mutu ikan yang terinfeksi sehingga sangat merugikan
pembudidaya. Tujuan penelitian ini adalah mengaplikasikan metode deteksi cepat dan tepat untuk
mendiagnosa penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri Aeromonas hydrophila penghasil aerolysin dengan
teknik PCR. Pada penelitian ini dilakukan uji PCR dengan primer universal 16S rDNA untuk mendeteksi
genom Aeromonas hydrophila dan primer spesifik AeroFd/AeroRs untuk identifikasi gen aerolysin dari genus
Aeromonas. Sampel bakteri diambil dari beberapa jenis ikan budidaya yang rentan terhadap infeksi A. hydrophila
(lele, gurame, dan patin) yang menunjukkan gejala terinfeksi bakteri tersebut. Uji awal berupa pengecatan
gram, tes katalase, dan oksidase dilakukan sebelum uji PCR. Hasil analisis PCR dengan menggunakan universal
primer menunjukkan 3 isolat merupakan bakteri A. hydrophila. Sedangkan dengan menggunakan primer
spesifik, hanya isolat AH-26 yang mengandung gen Aerolysin, sehingga AH-26 merupakan isolat patogen
yang menghasilkan toksin aerolysin. Dua isolat A. hydrophila lainnya tidak memiliki gen aerolysin, kemungkinan
merupakan strain yang tidak patogen.
KATA KUNCI:
Aeromonas hydrophila, uji PCR, aerolysin, dan primer spesifik
PENDAHULUAN
Peningkatan permintaan produk perikanan untuk kebutuhan domestik maupun ekspor saat ini
telah menempatkan sektor perikanan pada posisi yang penting. Potensi pengembangan budidaya
perikanan sangat besar yang menyebabkan intensifikasi semakin menjadi pilihan. Sayangnya,
intensifikasi budidaya tersebut sering menyebabkan menurunnya kondisi lingkungan yang pada
akhirnya menimbulkan masalah berupa timbulnya penyakit. Penyakit yang disebabkan oleh bakteri,
selain dapat menyebabkan kematian massal juga mengganggu kualitas ikan dengan menurunkan
mutu daging ikan yang terinfeksi sehingga tidak disukai oleh konsumen. Beberapa kasus wabah
penyakit akibat infeksi bakteri telah menyebabkan pembudidaya mengalami kerugian besar, oleh
karena itu, penanganan penyakit perlu mendapat perhatian serius.
Aeromonas hydrophila merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang yang banyak ditemukan
di lingkungan air tawar dan air payau. Aeromonas hydrophila dikenal sebagai bakteri oportunis
karena biasanya menimbulkan masalah pada saat ikan sedang mengalami stres. Pemeliharaan pada
padat tebar tinggi merupakan salah satu faktor yang menimbulkan stres pada ikan. Gejala yang
terlihat pada ikan yang terinfeksi bakteri ini bervariasi, tapi umumnya ditandai oleh adanya hemoragik
pada kulit, insang, rongga mulut, dan borok pada kulit. Tanda klinis yang sering dijumpai berupa
eksopthalmia, asites maupun pembengkakan limfa dan ginjal. Penyebaran dapat terjadi secara
horisontal lewal kontak langsung dengan air atau hati yang sakit (Irianto, 2005). Infeksi oleh bakteri
A. hydrophila terjadi melalui permukaan badan yang luka, saluran pencernaan makanan atau melalui
insang. Bakteri kemudian masuk dalam pembuluh darah dan menyebar pada organ dalam lain yang
menyebabkan pendarahan yang disertai haemorrhagic septicaemia (Kabata, 1985). Selanjutnya, bakteri
tersebut menyebar secara cepat dan dapat mengakibatkan kematian benih hingga 90%.
Baru-baru ini diketahui bakteri A. hydrophila dapat bersifat zoonosis. Penelitian membuktikan
bahwa beberapa strain A. hydrophila dapat menyebabkan kasus enteropathogenic, khususnya pada
anak-anak, orang tua, dan penderita immunocompromised (rusaknya sistem imun akibat infeksi
patogen). Beberapa gejala diare akibat A. hydrophila penyebab gastroenteritis berkaitan erat dengan
Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2010
878
diproduksinya enterotoksin oleh bakteri tersebut (Trower et al., 2000). A. hydrophila menghasilkan
berbagai toksin ekstraseluler salah satunya Aerolysin yang mungkin merupakan faktor virulen
(Bernheimer & Avigad, 1974). Mekanisme patogenitas A. hydrophila belum banyak diketahui, namun
sedikitnya telah ditemukan 6 toksin dari galur bakteri ini (Austin & Austin, 1987). Karena akteri ini
dapat memanfaatkan albumin, casein, fibrinogen, dan gelatine sebagai substrat protein maka dapat
disimpulkan galur bakteri ini bersifat proteolitik (Shotts et al., 1985), sehingga berpotensi besar
sebagai patogen ikan. Menurut Nieto & Ellis, 1991, sedikitnya ada 4-5 macam protease ekstraseluler
dari A. hydrophila.
Upaya penanggulangan penyakit yang disebabkan oleh bakteri A. hydrophila telah banyak dilakukan
baik antara lain dengan antibiotik maupun cara pencegahan dengan menggunakan vaksin. Diagnosa
cepat untuk deteksi awal penyakit ini perlu diterapkan agar dapat dilakukan tindakan pencegahan
secepat mungkin. Selama ini diagnosa penyebab penyakit ini umumnya dilakukan secara konvensional
yaitu melalui karakteristik biokimia. Namun diagnosa secara konvensional tersebut cukup kompleks,
membutuhkan waktu lama, dan sering membingungkan karena bakteri anggota genus Aeromonas
banyak yang memiliki karakter yang mirip antara satu dengan lainnya.
Untuk mempercepat proses pengendalian penyakit akibat infeksi bakteri ini maka metoda diagnosa
yang cepat, tepat, dan spesifik sangat dibutuhkan. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah
satu metode diagnosa yang dapat digunakan untuk mendeteksi patogen yang menginfeksi ikan
(Dorsch et al., 1994). Saat ini PCR juga telah dikembangkan untuk mendeteksi gen penyebab penyakit
pada Aeromonas sp. (Pollard et al ., 1990; Ù’zbas et al ., 2000). Tujuan penelitian ini adalah
mengaplikasikan metode deteksi cepat dan tepat dengan teknik PCR untuk mendiagnosa penyakit
yang disebabkan oleh infeksi bakteri patogen A. hydrophila penghasil toksin aerolysin.
BAHAN DAN METODE
Bakteri
Isolat bakteri yang digunakan pada penelitian ini merupakan koleksi lingkup Pusat Riset Perikanan
Budidaya, Departemen Kelautan dan Perikanan. Isolat AH-26 merupakan koleksi Balai Penelitian
Budidaya Air Tawar (BPBAT) Bogor, yang diisolasi dari ikan lele (Clarias sp.) asal Parung, Jawa Barat.
Isolat lainnya merupakan koleksi Pusat Riset Perikanan Budidaya yang diambil dari beberapa jenis
ikan yang rentan terinfeksi A. hydrophila asal Gunung Kidul, Jogjakarta. Isolat AK-L3 berasal dari ikan
lele (Clarias sp.), isolat AK-G1 berasal dari ikan gurami (Osphronemus gouramy) dan isolat AK-P3 berasal
dari ikan patin (Pangasius pangasius) dengan gejala klinis terinfeksi Aeromonas sp.
Kultur bakteri dimurnikan pada media TSA (Tripton Soy Agar-Difco) dengan menggunakan metode
gores dan kemudian ditumbuhkan pada suhu 28°C selama 24 jam. Masing-masing isolat bakteri
dipanen ke dalam mikrotube 1,5 mL berisi 750 μL ethanol 95%. Suspensi bakteri dalam alkohol
tersebut disimpan sebelum dilakukan ekstraksi DNA dengan menggunakan metode pemanasan.
Uji Awal
Sebelum dilakukan uji PCR, empat isolat tersebut dilakukan pengujian awal berupa pengecatan
gram, uji katalase dan uji oksidase.
Pengecatan Gram
Pengecatan gram dilakukan dengan cara mengambil sedikit isolat bakteri secara aseptik dengan
menggunakan ose dan dicampurkan pada 2 tetes akuades steril di atas kaca preparat, lalu dikeringkan
dengan menggunakan api bunsen. Pewarnaan dilakukan dengan cara meneteskan larutan kristal
violet selama 1 menit, dibilas lalu diteteskan larutan lugol selama 3 menit.
Setelah dibilas, larutan decolorized solution diteteskan selama kurang lebih 15 detik sambil digoyang
dan kemudian dibilas. Larutan safranin diteteskan dan dibiarkan menyerap selama 1 menit, dibilas
dan dikeringkan dengan menggunakan api Bunsen. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop
dengan pembesaran 1.000x. Bakteri yang terwarna merah keunguan menandakan termasuk golongan
gram positif dan yang terwarna merah muda termasuk golongan gram negatif.
879
Aplikasi deteksi Aeromonas hydrophila penghasil aerolysin ... (Lila Gardenia)
Uji Katalase
Tes dilakukan dengan cara meneteskan 2-3 tetes Hidrogen Peroksida di atas kaca objek, kemudian
dicampur dengan menggunakan ose, isolat bakteri dicampur dengan larutan tersebut sampai
homogen. Dilakukan pengamatan terbentuknya reaksi positif berupa munculnya gelembung udara
pada larutan. Bakteri aerob bereaksi positif terhadap uji ini, sedangkan bakteri anaerob tidak
menimbulkan reaksi.
Uji Oksidase
Tes ini dilakukan menggunakan oksidase test strip (Merck) dengan cara menggoreskan satu ose
bakteri pada kertas oksidase tersebut. Setelah didiamkan selama kurang lebih 60 detik, diamati
perubahan warna yang terjadi. Perubahan warna test strip menjadi biru menandakan reaksi positif
dan bakteri tersebut termasuk bakteri non-enterik. Sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna
maka reaksi dinyatakan negatif yang menandakan bakteri tersebut termasuk bakteri enterik.
Ekstraksi DNA Bakteri
Pelet bakteri diperoleh dengan sentrifugasi pada 12.000 xg selama 10 menit. Pelet diresuspensi
kembali dengan 400 μL RNAse free water dan dipanaskan pada suhu 98°C selama 10 menit sambil
sesekali divortex. Setelah itu, mikrotube dimasukkan ke dalam es selama 1-2 menit dan divortex
kembali. DNA bakteri diperoleh dengan sentrifugasi pada 8.000 xg selama 10 menit dan supernatan
berisi DNA dipindahkan sebanyak 300 μL ke dalam mikrotube baru dan disimpan pada suhu -20°C
sampai akan digunakan sebagai templat DNA.
Primer dan Amplifikasi DNA Aeromonas hydrophila
Urutan primer universal dan spesifik yang digunakan dalam penelitian ini beserta berat molekul
target yang diperoleh dari hasil amplifikasi PCR dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Urutan primer yang digunakan dalam uji PCR untuk deteksi bakteri A.
hydrophila
Primer
Universal
16S rDNA-1
16S rDNA-2
Spesifik
AeroFd
AeroRs
Posisi
Urutan nukleotida (5’-3’)
Berat molekul (bp)
451-473 5’-GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3’
685
1115-1135 5’-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3’ (Dorsch et al., 1994)
645-664
834-853
5’-CCAAGGGGTCTGTGGCGACA-3’
5’-TTTCACCGGTAACAGGATTG-3’
209
(Pollard et al., 1990)
Amplifikasi PCR dengan primer universal dilakukan dengan volume reaksi sebanyak 25 μL yang
berisi 12,5 μL mastermix (Fermentas); 8,5 μL RNAse free water; 1 μL masing-masing primer 16S rDNA
(10 pmol) dan 2 μL template DNA. Campuran reaksi tersebut dimasukkan ke dalam thermocycler
dengan program suhu sebagai berikut: tahap predenaturasi dilakukan pada 95°C selama 5 menit,
kemudian 30 kali siklus berlangsung dengan tahap denaturasi pada 94°C selama 1 menit, annealing
pada 56°C selama 1 menit, elongasi pada 72°C selama 1 menit dan diakhiri dengan final elongasi pada
72°C selama 10 menit. Sedangkan amplifikasi PCR dengan primer spesifik dilakukan dalam total
volume 25 μL yang berisi 12,5 μL mastermix (Fermentas); 8,5 μL RNAse free water; 1 μL masingmasing primer AeroRs/AeroFd (10 pmol) dan 2 μL template DNA. Campuran reaksi tersebut kemudian
dimasukkan ke dalam thermocycler dengan program suhu sebagai berikut: setelah tahap predenaturasi
pada 95°C selama 4 menit dilakukan 30 kali siklus denaturasi pada 95°C selama 30 detik, annealing
pada 54°C selama 45 detik, elongasi pada 72°C selama 30 detik dan diakhiri dengan final elongasi
pada 72°C selama 10 menit. Hasil amplifikasi kemudian disimpan pada suhu 4°C sebelum dilakukan
elektroforesis gel agarose.
880
Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2010
Visualisasi dan Dokumentasi
Hasil PCR dideteksi dengan mengelektroforesis masing-masing amplicon sebanyak 10 μL pada
1,5% gel agarose di dalam buffer 1x Tris-Acetate-EDTA (TAE buffer). Gel diwarnai dengan 0,5 μg/mL
ethidium bromide selama 15 menit dan dibaca pada UV-transilluminator kemudian didokumentasikan
dengan kamera polaroid.
HASIL DAN BAHASAN
Hasil uji awal dapat dilihat pada Tabel 2. Dari hasil tersebut, keempat isolat bakteri menunjukkan
adanya kemungkinan termasuk ke dalam genus Aeromonas sp.
Tabel 2. Hasil uji awal terhadap masing-masing isolat bakteri
Uji
Bentuk koloni
Gram
Katalase
Oksidase
Isolat
AH-26
AK-L3
AK-G1
AK-P3
Batang pendek
Negatif
Positif
Positif
Batang pendek
Negatif
Positif
Positif
Batang pendek
Negatif
Positif
Positif
Batang pendek
Negatif
Positif
Positif
Bakteri gram negatif adalah organisme yang tidak dapat menahan zat pewarna setelah dicuci
dengan alkohol 95% (Kabata, 1985). Dinding sel bakteri gram negatif mengandung lebih sedikit
peptidoglikan tetapi di luar lapisan peptidoglikan ada struktur membran kedua yang tersusun dari
protein, fosfolipida, dan lipopolisakarida (Volk & Wheeler, 1988). Uji oksidase bertujuan untuk
menentukan bakteri enterik atau non-enterik. Enzim sitokrom oksidase akan berubah menjadi bentuk
tidak aktif dengan mereduksi sitokrom c. Enzim ini akan menjadi bentuk aktifnya kembali jika terjadi
transfer elektron ke molekul oksigen. Keberadaan oksigen pada enzim oksidase akan mereduksi
substan-substan organik di antaranya substan yang terdapat pada oxidase test strip yang mengandung
Gambar 1. Tes PCR menggunakan primer universal untuk mendeteksi
Aeromonas hydrophila pada beberapa isolat bakteri. M.
Marker 100 bp (Fermentas), Lane 1. Isolat AH-26; Lane 2.
Isolat AK-L3; Lane 3. Isolat AK-G1; Lane 4. Isolat AK-P3
881
Aplikasi deteksi Aeromonas hydrophila penghasil aerolysin ... (Lila Gardenia)
N, N-dimetil-1,4,-fenilen diammonium diklorida dan 1-naftol. Reaksi tersebut akan menghasilkan
molekul indophenol blue yang mengakibatkan warna test strip akan berwarna biru. Ini merupakan
reaksi positif untuk bakteri non enterik jika terjadi perubahan warna. Sedangkan uji katalase digunakan
untuk mendeteksi adanya enzim katalase. Enzim ini terdapat pada sel-sel yang mempunyai
metabolisme aerobik. Bakteri anaerob tidak mempunyai enzim katalase. Reagen yang digunakan
sebagai pereaksi mengandung 3% larutan hidrogen peroksida. Enzim katalase akan bereaksi dengan
hidrogen peroksida yag bereaksi dengan hidrogen peroksida yang menghasilkan gas (oksigen). Bakeri
yang positif katalase ditandai terbentuknya gelembung udara pada kaca objek (David & Janet, 2001).
Diagnosa awal yang dilakukan pada penelitian ini yang hanya berdasarkan bentuk morfologi,
pewarnaan gram, oksidase, dan katalase tidak dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri
penyebab infeksi. Uji awal yang dapat digunakan untuk mengindikasikan adanya kemungkinan
penyebab infeksi oleh A. hydrophila antara lain berupa diperolehnya bakteri gram negatif, oksidase
positif, motil, dan oksidatif-fermentatif positif. Selain itu, untuk meningkatkan ketepatan diagnoasa
dapat digunakan media selektif seperti Shotts & Rimler serta media yang dikembangkan oleh Von
Graevenitz & Zinterhofe (Trust & Chipman, 1979).
Hasil uji PCR dengan menggunakan primer universal 16S rDNA menghasilkan amplikon dengan
berat molekul 685 bp pada 3 isolat yaitu AH-26, AK-L3 dan AK-G1. Dengan demikian ketiga isolat
tersebut merupakan bakteri A. hydrophila. Produk PCR pada 16S rDNA (685 bp) hanya diperoleh pada
reaksi yang mengandung genomic DNA A. hydrophila. Pita pada 685 bp tersebut terdeteksi ketika
genom dari Aeromonas spp. digunakan. Isolat AK-P3 tidak menghasilkan pita DNA pada berat molekul
tersebut (hasil negatif), yang berarti bakteri tersebut bukan A. hydrophila. Isolat AK-P3 perlu dilakukan
uji biokimiawi yang lebih lengkap sehingga jenis bakteri penyebab infeksi pada ikan patin dari
Gunung Kidul tersebut dapat diketahui.
AeroFd dan AeroRs merupakan pasangan primer spesifik yang hanya dapat mengamplifikasi bagian
gen penghasil aerolysin dari bakteri A. hydrophila (Pollard et al., 1990). Primer ini awalnya dirancang
untuk mencegah kesamaan region pada gen struktural antara gen aerolysin pada bakteri Aeromonas
sobria, gen hemolisyn A pada Escericia coli dan/atau gen α-toksin Staphylococcus aureus (Lior & Johnson,
1991). Pada uji PCR, primer spesifik ini mengamplifikasi pita DNA dengan berat molekul 209 bp.
Gambar 2. Tes PCR menggunakan spesifik universal untuk mendeteksi
Aeromonas hydrophila pada beberapa isolat bakteri. M. Marker
100 bp (Fermentas), Lane 1. Isolat AH-26; Lane 2. Isolat AKL3; Lane 3. Isolat AK-G1; Lane 4. Isolat AK-P3
Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2010
882
Hasil uji menunjukkan dari tiga isolat bakteri yang diduga termasuk genus Aeromonas, hanya isolat
AH-26 yang menghasilkan pita DNA pada berat molekul target (209 bp). Hal ini menunjukkan isolat
tersebut memiliki gen aero penghasil toksin aerolysin. Isolat lainnya tidak memiliki gen virulen
tersebut, walaupun isolat AK-L3 menghasilkan pita namun pada berat molekul yang tidak spesifik (±
400 bp). Hal ini menunjukkan ada kemungkinan isolat-isolat tersebut tidak patogen (non-pathogenic). Namun tidak menutup kemungkinan merupakan isolat yang patogen bila mengandung gen
virulen lain yang tidak terdeteksi dengan menggunakan primer spesifik AeroFd/AeroRs. Selain
aerolysin, haemolysin, enterotoxin, α-amilase, protease, DNAse, dan kemampuan heamogglutinasi
juga berperan dalam virulensi dari A. hydrophila.
Cara pencegahan penyakit yang disebabkan oleh bakteri A. hydrophila ini antara lain dengan
mengurangi faktor-faktor penyebab stres melalui penanganan yang baik, kepadatan yang memadai,
nutrisi, transportasi, dan kualitas air. Dengan cara pencegahan tersebut hampir dipastikan ikan akan
terhindar dari penyakit ini. Sanitasi dan filtrasi yang baik juga akan berpengaruh positif dalam
manajemen kesehatan ikan.
KESIMPULAN DAN SARAN
Dari hasil analisis PCR dapat diketahui bahwa isolat AH-26 merupakan bakteri Aeromonas hydrophila
yang patogen penghasil toksin aerolysin. Isolat AK-L3 dan AK-L1 merupakan bakteri Aeromonas
hydrophila tetapi tidak menghasilkan aerolysin. Sedangkan isolat AK-P3 merupakan bakteri lain di
luar genus Aeromonas. Primer Universal 16S rDNA digunakan untuk identifikasi bakteri Aeromonas
hydrophila, tetapi primer tersebut tidak dapat mendeteksi isolat bakteri A. hydophila patogen penghasil
aerolisin. Sedangkan primer spesifik AeroFd-AeroRs dapat digunakan sebagai marker gen virulen
khususnya A. hydrophila patogen penghasil aerolysin.
PCR sangat berguna sebagai alternatif metode identifikasi bakteri dengan karakterisasi biokimia
yang kompleks karena selain spesifik, juga cepat dan sangat sensitif. Primer universal sebaiknya
digunakan terlebih dahulu sebelum menggunakan primer spesifik agar diketahui kelompok isolat
yang merupakan A. hydrophila. Selanjutnya primer marker gen virulen yang lain seperti aerolysin dan
haemolysin dapat digunakan untuk identifikasi isolat A. hydrophila yang lebih lengkap.
UCAPAN TERIMA KASIH
Kami menyampaikan banyak terima kasih kepada Kepala Balai Riset Perikanan Budidaya Air TawarBogor (BRPBAT) beserta para peneliti dan staf Laboratorium Patologi-BRPBAT atas bantuannya
memberikan koleksi isolat bakteri Aeromonas hydrophila AH-26.
DAFTAR ACUAN
Austin, B. & Austin, D.A. 1987. Bacterial fish pathogens: Disease in farmed and wild fish. Ellis Horwood.
Holsted Press John Wiley dan Sons: New York. Chicaster, Brisbane, Toronto.
Bernheimer, A.W. & Avigad, L.S. 1974. Partial characterization of aerolysin, a lytic exotocin from
Aeromonas hydrophila. Infection and Immunity, 9: 1016-1021.
Dorsch, M., Asbolt, N.J., Cox, P.T., & Goodman, A.E. 1994. Rapid identification of Aeromonas species
using 16S rDNA targeted oligonucleotide primers: a molecular approach based on screening of
environmental isolates. J. of Applied Bacteriology, 77: 722-726.
Irianto. 2005. Patologi Ikan Teleostei. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
Kabata, Z. 1985. Parasites and diseases of fish cultured in tropics. Taylor and Francisco Ltd. London.
Lior, H. & Johnson, W.M. 1991. Application of the polymerase chain reaction (PCR) to detection of the
aerolysin gene in whole cell cultures of β−hemolytic Aeromonas hydrophila. Experientia, 47: 421424.
Nieto,T.P. & Ellis, A.E. 1991. Heterogenicity of extracellular proteases and produced by different isolates of Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria pathogenic for fish. J. Fish Dis., 14: 229-235.
Pollard, D.R., Johnson, W.M., Lior, H., Tyler, S.D., & Rozee, K.R. 1990. Detection of the aerolysin gene
in Aeromonas hydrophila by the polymerase chain reaction. J. of Clinical Microbiology, p. 2477-2481.
Shotts, E.B., Hsu, T.C., & Waltman, W.D. 1985. Extracellular Proteolytic activity of A. hydrophila com-
883
Aplikasi deteksi Aeromonas hydrophila penghasil aerolysin ... (Lila Gardenia)
plex. I., 20(1): 37-44.
Trust, T.J. & Chipman, D.C. 1979. Clinical involvement of Aeromonas hydrophila. CMA J., (120).
Trower, C.J., Abo, S., Majeed, K.N., & Von Itzstein, M. 2000. Bacterial pathogenicity: production of an
enterotoxin by a gastro-enteritis-associated Aeromonas strain. J. Med. Microbiol., 49: 121-126.
Ù’zbas, Z.Y., Lehner, A., & Wagner, M. 2000. Development of a multiplex and semi-nested PCR assay
for detection of Yersinia enterocolitica and Aeromonas hydrophila in raw milk. Food Microbiology, 17:
197-203.
Volk, W.A. & Wheller, M.F. 1988. Mikrobiologi Dasar. Alih Bahasa: Markham. Erlangga. Surabaya.