Karakteristik pertumbuhan bakteri asam laktat

HASIL DAN PEMBAHASAN
Bakteri asam laktat yang digunakan merupakan hasil isolasi dari susu sapi
segar dan produk olahannya. Bakteri asam laktat indigenous susu sapi segar dan
produk olahannya ini berpotensi untuk menjadi kandidat bakteri probiotik, dengan
syarat tahan pada berbagai kondisi dalam saluran pencernaan.
Konfirmasi Kultur Starter Indigenous Susu Sapi Segar dan Bakteri Patogen Uji
Bakteri asam laktat dan bakteri patogen yang diujikan harus terbebas dari
kontaminasi bakteri lain. Uji konfirmasi dilakukan dengan pewarnaan Gram dan uji
katalase untuk melihat morfologi BAL dan bakteri patogen uji yang seragam,
homogen dan murni.
Pewarnaan Gram dilakukan untuk menggolongkan jenis
bakteri Gram positif atau negatif. Uji katalase dilakukan untuk mengetahui BAL dan
bakteri patogen uji termasuk sifat katalase negatif atau positif. Karakteristik BAL
dan bakteri patogen uji melalui uji konfirmasi dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Karakteristik BAL Indigenous Susu Sapi Segar dan Bakteri Patogen Uji
Bakteri
Pewarnaan
Gram
Positif
Morfologi Bentuk dan
Susunan
Bulat rantai
Sifat
Katalase
Negatif
L. bulgaricus S-01*
Positif
Batang panjang
Negatif
B. longum Y-01 *
Positif
Batang pendek
Negatif
L. acidophilus Y-01 *
Positif
Batang
Negatif
S. aureus ATCC 25923**
Positif
Bulat
Positif
E. coli ATCC 25922**
Negatif
Batang
Positif
S. Typhimurium ATCC 14028
Negatif
Batang
Positif
S. thermophilus S-01*
Keterangan : * sesuai dengan Wardani (2009)
** sesuai dengan Ambarwati dan Gama (2009)
Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengetahui bakteri tersebut termasuk
Gram negatif atau Gram positif.
Perbedaan ini dilihat berdasarkan komposisi
dinding sel dan sifat pewarnaannya. Selain itu, juga berbeda dalam sifat sensitifitasnya terhadap kerusakan mekanis atau fisis, terhadap enzim, desinfektan dan
antibiotik (Hadioetomo, 1993). S. thermophilus S-01, L. bulgaricus S-01, B. longum
Y-01, L. acidophilus Y-01 dan S. aureus ATCC 25923 merupakan bakteri Gram
23
positif, sedangkan E. coli ATCC 25922 dan S. Typhimurium ATCC 14028 adalah
bakteri Gram negatif. Hasil pewarnaan menunjukkan bakteri-bakteri yang tergolong
Gram positif tersebut terlihat berwarna biru (menyerap pewarna kristal violet),
sedangkan bakteri-bakteri Gram negatif terlihat berwarna merah, karena lebih
menyerap pewarna safranin.
Menurut Hadioetomo (1993), bakteri Gram negatif bersifat lebih konsisten
terhadap reaksi pewarnaan, tetapi bakteri Gram positif sering berubah sifat
pewarnaannya, sehingga bakteri Gram positif dapat menunjukkan reaksi Gram
variable. Kultur bakteri yang biasa digunakan dalam pewarnaan Gram adalah kultur
berumur 24 jam, jika kultur bakteri terlalu tua, maka bakteri tersebut akan kehilangan
kemampuan untuk menyerap kristal violet dan lebih menyerap pewarna safranin.
Perubahan ini dapat disebabkan juga oleh perubahan kondisi lingkungan dan
modifikasi teknik pewarnaan.
Pewarnaan awal bakteri adalah dengan zat warna basa kristal violet, jika
kelebihan warna, maka dicuci dengan air, kemudian diberi larutan yodium yang akan
membentuk suatu kompleks antara kristal violet dan iodium. Pencucian dengan
alkohol dimaksudkan untuk mencuci kompleks tersebut, sehingga kompleks tersebut
keluar dari dinding sel bakteri Gram negatif, sehingga saat diberi pewarna safranin,
dinding sel Gram negatif akan menyerap safranin dan menjadi berwarna merah.
Gram positif tidak ada kompleks yang keluar karena lapisan peptidoglikan pada
dinding selnya lebih tebal dan menyebabkan Gram positif tidak menyerap warna
safranin dan tetap berwarna biru seperti Kristal violet (Hadioetomo, 1993).
Mekanisme pewarnaan Gram memang didasarkan pada struktur dan
komposisi dinding sel bakteri. Bakteri Gram negatif mengandung lipid, lemak atau
substansi seperti lemak dalam persentase tinggi daripada yang dikandung dari Gram
positif. Dinding bakteri Gram negatif juga lebih tipis. Alkohol dalam pewarnaan
menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya permeabilitas
dinding sel Gram negatif. Pewarna Kristal violet dan iodium yang sudah masuk
dalam dinding pun dapat diekstraksi. Gram positif dengan kandungan lemak lebih
rendah, jika diberi alkohol justru membuat pori-pori mengecil dan permeabilitas
berkurang, sehingga Kristal violet dan iodium tidak dapat terekstraksi (Pelczar dan
Chan, 2007).
24
Pewarnaan Gram yang dilakukan terhadap keempat bakteri asam laktat
menunjukkan hasil bentuk bakteri B. longum Y-01, L. acidophilus Y-01 dan L.
bulgaricus S-01 adalah batang, sedangkan S. thermophilus S-01 berbentuk bulat
seperti rantai.
Seperti yang dikemukakan Tamime dan Robinson (2008),
S.thermophilus memang berbentuk batang yang membentuk susunan seperti rantai
dan L. bulgaricus berbentuk batang panjang. Bentuk BAL hasil ewarnaan Gram
dapat dilihat pada Gambar 3.
a). Streptococcus thermophilus
b). Lactobacillus bulgaricus
c). Bifidobacterium longum
d). Lactobacillus acidophilus
Gambar 3. Bentuk Bakteri Asam Laktat Indigenous Susu Sapi Segar Hasil
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram bakteri patogen pada Gambar 4, menunjukkan bentuk
masing-masing bakteri patogen setelah dilakukan pewarnaan Gram dan sesuai
dengan Hadioetomo (1993).
E. coli berbentuk batang lurus.
S. Typhimurium
berbentuk batang, sedangkan S. aureus berbentuk kokus membentuk anggur.
Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri yang
diuji. Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat memecah H2O2
menjadi H2O dan O2. Enzim katalase diduga penting untuk pertumbuhan aerobik
25
karena H2O2 bersifat racun terhadap sel mikroba. Beberapa bakteri yang termasuk
katalase negatif adalah Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus dan Clostridium.
Escherichia coli
Salmonella Typhimurium
Stapylococcus aureus
Gambar 4. Bentuk Bakteri Patogen Hasil Pewarnaan Gram
Bakteri katalase positif seperti S. aureus bisa menghasilkan gelembunggelembung oksigen karena adanya pemecahan hidrogen peroksida (H2O2) oleh enzim
katalase yang dihasilkan oleh bakteri itu sendiri. Komponen H2O2 ini merupakan
salah satu hasil respirasi aerobik bakteri, misalnya S. aureus, dimana hasil respirasi
tersebut justru dapat menghambat pertumbuhan bakteri karena bersifat toksik bagi
bakteri itu sendiri. Oleh karena itu, komponen ini harus dipecah agar tidak bersifat
toksik lagi. Bakteri katalase negatif tidak menghasilkan gelembung-gelembung. Hal
ini berarti H2O2 yang diberikan tidak dipecah oleh bakteri katalase negatif, sehingga
tidak menghasilkan oksigen. Bakteri katalase negatif tidak memiliki enzim katalase
yang menguraikan H2O2.
Ketahanan Kultur Starter BAL Indigenous Susu Sapi Segar pada pH
Berbeda
Daya tahan hidup bakteri asam laktat dalam saluran pencernaan merupakan
syarat mikroorganisme untuk dapat memberikan manfaat kesehatan setelah
dikonsumsi. Stress yang pertama terjadi pada sel bakteri yang ada dalam saluran
pencernaan adalah pada kondisi asam lambung. Chou dan Weimer (1999), waktu
yang diperlukan mulai dari bakteri masuk sampai keluar lambung sekitar 90 menit.
Jadi bakteri asam laktat yang diseleksi untuk digunakan sebagai probiotik harus
mampu bertahan dalam keadaan asam lambung (pH 2 dan 2,5) selama sedikitnya 90
menit. Ketahanan BAL pada pH berbeda pada penelitian ini dilakukan selama 180
menit atau 2 kali lebih lama dari waktu normal makanan masuk lambung sampai
keluar lambung, untuk memastikan ketahanan BAL pada kondisi pH yang berbeda.
26
Pengaturan pH media pertumbuhan BAL untuk menyamakan dengan kondisi
dalam lambung (2, 2,5 dan 3,2) dan usus halus (7,2) adalah dengan menambahkan
HCl dan NaOH. HCl digunakan untuk menurunkan pH media hingga mencapai
kondisi pH yang diinginkan.
Alasan penggunaan HCl adalah karena HCl
mempunyai karakteristik yang hampir sama dengan asam yang dihasilkan di
lambung. HCl adalah asam kuat yang mudah terdisosiasi menghasilkan proton, yang
menyebabkan penurunan pH medium di luar sel atau pH ekstraseluler.
NaOH
digunakan untuk menaikkan pH, hingga mencapai kondisi pH 7,2, karena merupakan
basa kuat, mengandung Na (garam) yang sama dengan karakteristik garam empedu
yang disekresikan di dalam duodenum. Jumlah populasi BAL sebelum dan sesudah
inkubasi dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Jumlah Populasi BAL Indigenous Susu Sapi Segar pada pH Berbeda
No Lama
.
inkubasi
1.
P0 menit
P180 menit
(P180- P0)
2.
P0 menit
P180 menit
(P180- P0)
3.
P0 menit
P180 menit
(P180- P0)
4.
P0 menit
P180 menit
(P180- P0)
S. thermophilus
S-01
Populasi BAL (log10 cfu/ml)
L bulgaricus B. longum
S-01
Y-01
L. acidophilus
Y-01
---------------------------pH 2,0 ± 0,1------------------------------7,83 ± 0,44
7,15 ± 0,30
7,06 ± 0,12
7,60 ± 0,22
ND
7,31 ± 0,3
7,15 ± 0,13
7,42 ± 0,31
-7,83 ±0,44
0,16
±
0,11
0,09 ± 0,06
-0,18±0,13
--------------------------pH 2,5 ± 0,1 ----------------------------6,89 ± 0,87
7,69 ± 0,13
7,36 ± 0,09 b
7,25 ± 0,02
a
ND
6,50 ± 0,73
7,62 ± 0,06
7,52 ± 0,12
-6,89 ± 0,87
-1,19 ± 0,84
0,26 ± 0,18
0,29 ± 0,21
-----------------------------pH 3,2 ± 0,1 ----------------------------------8,12 a ± 0,71 7,87 ± 0,19
7,50 ± 0,33
7,12 b ± 0,03
6,09 b ± 0,71 7,43 ± 0,52
7,92 ± 0,29
7,43 a ± 0,08
-2,03 ± 1,43 -0,45 ± 0,31
0,42 ± 0,30
0,31 ± 0,22
--------------------------- --pH 7,2 ± 0,1----------------------------------6,90 ± 0,09
8,12 ± 0,14
7,01 b ± 0,17
7,45 b ± 0,08
7,32 ± 0,30
7,28 ± 0,40
7,45 a ±0,15
7,81 a ± 0,14
0,42 ± 0,30
-0,84 ± 0,60
0,44 ± 0,31
0,36 ± 0,25
Keterangan : * apabila hasilnya (-) menunjukan adanya kematian;
** huruf superskript (a dan b) yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan
berbeda nyata (P<0,05)
ND = not detected (tidak terdeteksi adanya pertumbuhan)
Ketahanan bakteri asam laktat indigenous susu sapi segar dan produk
olahannya yang akan dijadikan sebagai bakteri probiotik harus tahan pada kondisi
27
asam dalam saluran pencernaan, salah satunya adalah kondisi di lambung yang
dalam keadaan kosong mempunyai pH sangat asam, sekitar 1–2,5. Hasil sekresi
lambung yang dikenal dengan getah lambung merupakan cairan jernih berwarna
kuning pucat yang mengandung HCL 0,2–0,5% dan asam lambung dengan pH 3,2
disekresikan di dalam lambung (Mitsuoka, 1990). Menurut Jacobsen et al. (1999),
dalam saluran pencernaan manusia, pH asam lambung yaitu sekitar 2,5, sedangkan
pengujian ketahanan BAL pada pH 7,2 diujikan karena garam empedu disekresikan
di dalam duodenum yang mempunyai kondisi pH netral sekitar 6,9-7,2.
Hasil pada tabel 3, menunjukkan S. thermophilus S-01 pada pH 2 dan 2,5
tidak dapat bertahan, ini dibuktikan dengan tidak adanya pertumbuhan yang
terdeteksi setelah akhir perlakuan.
S. thermophilus pada pH 3,2 sudah mulai
bertahan, walaupun masih mengalami penurunan populasi sekitar 2,03 log10 cfu/ml,
sedangkan pada pH 7,2 S. thermophilus dapat bertahan, bahkan mengalami kenaikan
populasi sekitar 0,42 log10 cfu/ml. Hasil analisis ragam menunjukkan S.thermophilus
S-01 pada kondisi pH 3,2 sebelum dan sesudah inkubasi berpengaruh nyata (P<0,05).
Walaupun S. thermophilus S-01 mengalami penurunan, namun populasi akhir setelah
diinkubasi 3 jam masih pada populasi 6,09 log10 cfu/ml. Jika dibandingkan dengan
kondisi pH 2 dan 2,5, maka S. thermophilus S-01 lebih tahan pada kondisi 3,2 dan
7,2. Pada kondisi pH 3,2, S. thermophilus S-01 mampu mempertahankan pH
intraseluler sitoplasma, sehingga pH sitoplasma lebih basa dibanding dengan pH
ekstraseluler.
Membran sel S. thermophilus S-01 juga lebih tahan terhadap
kebocoran pada pH 3,2. Ketiga BAL yang lain mampu bertahan dalam semua
kondisi pH, terutama B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01, bahkan mengalami
kenaikan populasi. L. bulgaricus S-01 juga mampu bertahan dalam semua kondisi
pH, walaupun mengalami penurunan populasi, mulai dari 0,18–0,8 log10 cfu/ml.
Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa kondisi pH 7,2 berpengaruh nyata pada
populasi awal dan akhir setelah inkubasi 3 jam bakteri asam laktat B. longum Y-01
dan L. acidophilus Y-01.
Tiap galur mempunyai ketahanan yang berbeda terhadap asam atau pH
rendah, contohnya Lactobacillus lebih toleran terhadap pH rendah dibandingkan
Lactococci dan Streptococci (Farida, 2006). Bifidobacteria juga dapat bertahan
dalam keadaan pH rendah, yaitu pH 2 (Zinedine dan Faid, 2007). Ketahanan yang
28
tinggi dari Bifidobacteria sangat penting, karena mikroorganisme ini digunakan
dalam formulasi atau ditambahkan dalam makanan dan harus tahan terhadap
keasaman, terutama selama transit dalam lambung.
Toleransi terhadap asam pada bakteri asam laktat tergantung pada pH H+ATPase dan komposisi membran sitoplasma, yang sangat dipengaruhi oleh jenis
bakteri, media pertumbuhan dan kondisi inkubasi (Oh et al., 2000). Saat memasuki
saluran pencernaan dengan kondisi pH sangat asam, bakteri dapat mengalami stress.
Stress yang dialami adalah karena pH intraseluler bakteri berbeda dengan pH
ekstraseluler, sehingga bakteri asam laktat harus melakukan metabolisme agar dapat
menyesuaikan kondisi intraseluler dengan ekstraselulernya. Menurut Siegumfeldt et
al. (2000), pada bakteri asam laktat terjadi perubahan dinamis pH intraseluler seiring
dengan terjadinya penurunan pH ekstraseluler sehingga tidak terjadi gradien proton
yang besar.
Toleransi bakteri asam laktat yang cukup tinggi terhadap asam
disebabkan oleh kemampuannya untuk mempertahankan pH sitoplasma lebih basa
daripada pH ekstraseluler. Bila sel bakteri terpapar pada kondisi yang sangat asam,
maka membran sel dapat mengalami kerusakan dan berakibat hilangnya komponen
intraseluler. Biasanya kerusakan ini menyebabkan kematian pada sel. Bakteri yang
toleran terhadap asam, membran selnya lebih tahan terhadap kebocoran akibat pH
rendah dibandingkan dengan yang tidak tahan.
Secara in vitro ketahanan terhadap pH rendah tergantung pada tipe buffer dan
tipe makanan yang digunakan. Menurut Hardiningsih et al. (2005), ketahanan
fisiologis dari setiap bakteri berbeda-beda. Perbedaan ketahanan membran sel bakteri
terhadap kerusakan akibat terjadinya penurunan pH ekstraseluler menyebabkan
keragaman ketahanan sel pada pH rendah.
Jacobsen et al. (1999) melakukan pengujian ketahanan 47 isolat bakteri asam
laktat dari berbagai sumber pada pH 2,5. Sebanyak 47 isolat tersebut hanya 29 isolat
yang mampu bertahan pada pH 2,5 dan tidak ada satupun yang mampu tumbuh
setelah inkubasi empat jam.
Kondisi pH 2,5 bagi beberapa bakteri asam laktat
memang sangat asam, sehingga banyak yang tidak dapat mempertahankan kondisi
basa intraseluler dan terjadi kerusakan pada membran sel bakteri. Berdasarkan hasil
ini, S. thermophilus S-01 dan L. bulgaricus S-01 diduga mengalami kerusakan
membran sel.
29
BAL mempunyai dinding sel yang tebal dengan lipid yang tipis sekitar 1-4%.
Menurut (Fardiaz, 1989), bakteri Gram positif, 90% dari dinding selnya terdiri dari
lapisan peptidoglikan, sedangkan lapisan tipis lainnya adalah asam teikoat. Asam
teikoat mengandung unit-unit gliserol atau ribitol yang terikat satu sama lain oleh
ester fosfat dan biasanya mengandung gula lain dan D-alanin. Peptidoglikan ini
terdiri dari turunan gula yaitu N-asetilglukosamin dan N-asetilmuramat serta
beberapa asam amino yaitu L-alanin, D-alanin, asam D-glutamat dan asam
diaminopimelat (ADP). Peptidoglikan yang tebal dan ikatan rantai asam teikoat
inilah yang dapat mempertahankan bentuk dinding sel dari kondisi asam
ekstraseluler. Kondisi ektraseluler yang asam memang dapat menyebabkan dinding
sel BAL menjadi lisis.
Namun, dinding sel BAL ini dapat mempertahankan
bentuknya, sehingga bagian dalam sel masih dapat terlindungi. Membran sel pun
dapat mengangkut nutrien dan garam yang dibutuhkan untuk melakukan
metabolisme dan tidak permeabel terhadap senyawa yang tidak dibutuhkan. Lapisan
lipid yang tipis membuat pori-pori dinding menjadi mengecil, sehingga permeabilitas
sel berkurang dan tidak terjadi ekstraksi komponen intraseluler.
Asam dapat
merusak lapisan lipid yang ada pada membran sel, namun lapisan lipid ini
mengandung protein khusus. Beberapa dari protein membran merupakan enzim,
sementara yang lainnya dapat mengikat nutrien dan mengangkutnya ke dalam sel.
Menurut Chou dan Weimer (1999), strain L. acidophilus pada pH sekitar 3,5
hanya tahan jangka pendek, terlihat dari pertumbuhannya yang sedikit melambat
setelah inkubasi 90 menit. Tidak seperti bakteri netrofilik (yang dapat tumbuh pada
kondisi pH mendekati netral) yang menjaga pH intraselulernya mendekati netral,
pada bakteri asam laktat terjadi perubahan dinamis pH intraseluler seiring dengan
perubahan pH lingkungannya (Siegumfeldt et al., 2000). Ini membuktikan, semua
bakteri yang diisolasi memang mempunyai karakteristik yang berbeda dan
metabolisme yang berbeda, bakteri-bakteri ini bersifat strain dependent.
Pertumbuhan optimal L. bulgaricus adalah pada kondisi asam, pH sekitar
5,2–5,8 dan akan terhenti pada pH sekitar 3,8. S. thermophilus S-01 tumbuh optimal
pada pH sekitar 6,5 dan akan terhenti pada pH 4,2–4,4. Pada pembuatan yogurt
digunakan campuran S. thermophilus dan L. bulgaricus. S. thermophilus akan
tumbuh lebih cepat pada awal masa inkubasi. S. thermophilus menghasilkan asam
30
folat, asam laktat piruvat dan asam format untuk menstimulir pertumbuhan
L.bulgaricus, sehingga proses fermentasi lebih cepat. Pada akhir proses fermentasi,
pertumbuhan S. thermophilus mulai berkurang seiring dengan meningkatnya
L.bulgaricus (Surono, 2004; Silva et al., 2005).
Oh et al. (2000) menyatakan bahwa dalam proses fermentasi yogurt, terbukti
L. bulgaricus lebih optimal tumbuh pada kondisi asam, sedangkan S. thermophilus
lebih optimal tumbuh pada pH mendekati netral (6,5). B. longum dan L. acidophilus
adalah bakteri yang sering digunakan sebagai bakteri probiotik dalam produk susu,
karena pada dasarnya kedua spesies ini dominan dalam saluran pencernaan manusia.
Bahkan, kedua spesies ini terdapat secara alami dalam usus manusia.
Perubahan populasi BAL indigenous susu sapi segar selama pengamatan
180 menit pada kondisi pH berbeda dapat dilihat pada Gambar 6. S. thermophilus S01 pada kondisi 2, 2,5 dan 3,2 mengalami penurunan populasi setiap pengamatan,
terutama setelah 60 menit inkubasi, terjadi penurunan populasi hingga akhir
perlakuan. Sedangkan pada kondisi pH 7,2, terlihat grafik yang belum stabil pada 60
menit pertama, namun setelahnya grafik terlihat statis, yang menunjukkan ketahanan
bakteri yang baik.
L. bulgaricus S-01 pada kondisi pH rendah 2 dan 2,5
menunjukkan pergerakan yang tidak stabil, sedangkan pada kondisi pH 3,2 dan 7,2,
grafik terlihat statis, yang menunjukkan L. bulgaricus S-01 lebih mampu bertahan
pada pH 3,2 dan 7,2.
Perubahan populasi S. thermophilus S-01 pada pH 3,2 lebih tahan
dibandingkan pada pH 2, 2,5 dan 7,2. Walaupun mengalami penurunan populasi,
namun S. thermophilus S-01 masih dapat bertahan pada kisaran populasi 7-8 log10
cfu/ml. Sedangkan L. bulgaricus S-01 relatif stabil, bahkan mengalami peningkatan
populasi pada 60 menit pertama pada semua kondisi pH dan mulai mengalami
penurunan populasi setelah 90 menit. BAL yang diseleksi untuk menjadi bakteri
probiotik, setidaknya harus mampu bertahan pada kondisi pH rendah sekitar 90
menit.
B. longum Y-01 pada kondisi pH 2, menunjukkan grafik yang statis,
sedangkan pada pH 2,5, 3,2 dan 7,2 terlihat adanya kenaikan populasi setelah ±2 jam
inkubasi. Perubahan populasi BAL selama inkubasi 180 menit dapat dilihat pada
Gambar 5.
31
Keterangan : pH 2.0 ( ), pH 2.5 ( ), pH 3.2 ( ), pH 7.2 ( )
Gambar 5. Perubahan Populasi Kultur Starter BAL a). S. thermophilus S-01, b).
L.bulgaricus S-01, c). B. longum Y-01, d). L. acidophilus Y-01 pada pH
berbeda
32
Grafik L. acidophilus Y-01 pada pH 2, 2,5 dan 3,2 pada 90 menit pertama terlihat
masih labil, namun setelah inkubasi 90 menit, grafik menunjukkan kenaikan
populasi, sedangkan pada kondisi pH 7,2 L. acidophilus Y-01 lebih mampu bertahan
sehingga grafik menunjukkan kenaikan yang konsisten.
Waktu normal yang diperlukan makanan mulai dari masuk hingga keluar
lambung adalah sekitar 90 menit, sedangkan waktu yang digunakan dalam penelitian
ini adalah 180 menit, atau 2 kali dari waktu minimal yang diperlukan untuk
menyeleksi BAL menjadi bakteri probiotik. Tujuannya adalah untuk memastikan
BAL benar-benar mampu bertahan pada pH 2, 2,5, 3,2 dan 7,2.
Ketahanan Kultur Starter BAL Indigenous Susu Sapi Segar pada Garam
Empedu
Bakteri asam laktat sebagai kultur probiotik harus mampu melewati kondisi
saluran pencernaan yang menekan, agar dapat bertahan dan tumbuh. Salah satunya
adalah pada saat bakteri memasuki bagian atau usus di mana empedu disekresikan di
dalam usus. Populasi BAL indigenous susu sapi segar pada garam empedu sebelum
dan sesudah inkubasi selama 24 jam disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4. Jumlah Populasi BAL Indigenous Susu Sapi Segar pada Garam Empedu
1.
S. thermophilus S-01
Populasi BAL (Log CFU/ml)
P0 jam
P24 jam
(P24 - P0)*
7,91 ± 0,19
ND
-7,91 ± 0,19
2.
L. bulgaricus S-01
8,08 a ± 0,10
5,84 b ± 0,054
-2,25 ± 1,50
3.
B. longum Y-01
8,41 b ± 0,03
8,51 a ± 0,01
0,10 ± 0,07
4.
L. acidophilus Y-01
7,54 b ± 0,01
7,78 a ± 0,07
0,24 ± 0,17
No
Kultur bakteri
Keterangan : * apabila hasilnya (-) menunjukan adanya kematian;
** huruf superskript (a dan b) yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda
nyata (P<0,05)
ND = not detected (tidak terdeteksi adanya pertumbuhan)
Perlakuan secara in vitro, dimana media dikondisikan seperti di dalam saluran
usus, yaitu dengan menambahkan oxgall sebanyak 0,3%. Penambahan 0,3% oxgall
merupakan konsentrasi kritis dan cukup tinggi untuk menseleksi galur resisten.
Peningkatan konsentrasi garam empedu dapat menyebabkan penurunan jumlah
koloni bakteri asam laktat yang lebih besar (Farida, 2006).
33
Populasi sebelum perlakuan dan setelah perlakuan pada setiap bakteri asam
laktat indigenous susu sapi segar sangat berbeda (P<0,01). Keragaman toleransi
bakteri asam laktat terhadap garam empedu tidak berhubungan dengan perbedaan
spesies, tetapi tergantung dari masing-masing galur atau bersifat strain dependent.
Galur yang berbeda mempunyai mekanisme yang berbeda terhadap garam empedu.
Galur bakteri asam laktat yang sama serta diisolasi dari sumber yang sama pun,
mempunyai keragaman pada toleransi terhadap garam empedu (Chou dan Weimer,
1999). Menurut Sanders (2000), Lactobacillus dan Bifidobacterium secara umum
lebih resisten terhadap garam empedu dibandingkan dengan genus Streptococcus dan
genus lainnya, terutama bakteri asam laktat yang digunakan sebagai kultur starter
yogurt. Toleransi terhadap garam empedu ini disebabkan oleh peranan polisakarida
sebagai salah satu komponen penyusun dinding sel bakteri Gram positif. Toleransi
terhadap garam empedu yang rendah pada Streptococcus dibuktikan dengan hasil
populasi akhir S. thermophilus S-01 setelah mendapat perlakuan garam empedu,
bakteri tidak tahan garam empedu sehingga pada saat akhir perlakuan, bakteri
tersebut mati dan tidak terhitung populasinya.
Farida (2006) menambahkan, sel yang mati disebabkan karena peningkatan
aktivitas enzim β-galactosidase terhadap garam empedu, enzim β-galactosidase pada
bakteri asam laktat digunakan untuk menghasilkan asam laktat dari laktosa (Surono,
2004). Peningkatan aktivitas enzim ini adalah upaya bakteri untuk melakukan
adaptasi terhadap kondisi ekstraseluler, sehingga kecepatan difusi molekul nutrien
pun mengalami peningkatan dan membatasi sel untuk mengontrol metabolismenya
Peningkatan permeabilitas sel ini mengakibatkan materi intraseluler, seperti
sitoplasma dan ribosom terekstraksi dan sel mengalami lisis. Padahal sitoplasma
berfungsi sebagai tempat berlangsungnya hanpir semua reaksi enzimatis dari
metabolisme sel. Dalam sitoplasma, sel menggunakan energi kimia untuk
membangun dan mempertahankan strukturnya serta melakukan pergerakan sel.
Ribosom berfungsi mensintesa protein. Jika materi intraseluler ini, maka bakteri
tidak bisa melakukan metabolisme, sehingga tidak dapat tumbuh dan bahkan mati
(Lehninger, 2004).
Perubahan populasi BAL setiap 60 menit selama pengamatan 24 jam dapat
dilihat pada Gambar 6.
34
Keterangan : kontrol ( ), garam empedu ( )
Gambar 6.
Perubahan Populasi Kultur Starter a). S. thermophilus S-01, b).
L.bulgaricus S-01, c). B. longum Y-01, d). L. acidophilus Y-01 pada
Garam Empedu
35
Grafik di atas merupakan populasi BAL yang dihitung berdasarkan
persamaan hubungan antara nilai absorbansi dan hasil pemupukan. Nilai optical
density yang didapat merupakan populasi bakteri hidup dan mati yang ditangkap oleh
spektrum cahaya dalam spektrofotometer, namun dilakukan juga pemupukan, yang
hasilnya merupakan populasi bakteri hidup
Pertumbuhan S. thermophilus S-01 yang diberi perlakuan garam empedu dan
kontrol dapat dilihat pada grafik pertama. Terlihat pada waktu pengamatan awal,
populasi S. thermophilus S-01 masih dapat menyamai kontrol dan terlihat statis.
Terlihat dari kisaran populasi yang walaupun naik dan turun, namun masih pada
kisaran 107-108 cfu/ml.
Populasi L. bulgaricus S-01 dengan penambahan garam empedu dapat
dikatakan stabil, seiring dengan pertumbuhan L. bulgaricus S-01 kontrol. Populasi
L. bulgaricus S-01 ditambah garam empedu mulai mengalami kenaikan setelah 15
jam inkubasi. Dapat dikatakan, L. bulgaricus S-01 sudah mulai beradaptasi dengan
kondisi garam empedu. Dari grafik tersebut menunjukkan bahwa L. bulgaricus S-01
dapat bertahan pada kondisi garam empedu, walaupun mengalami penurunan
populasi.
Pertumbuhan bakteri B. longum Y-01 pada perlakuan garam empedu dan
yang tidak ditambahkan garam empedu (kontrol). Populasi yang didapat antara
kontrol dan perlakuan menunjukkan hasil yang tidak jauh berbeda. Terlihat pada
kurva, bahwa populasi B. longum Y-01 pada garam empedu dapat bertahan, bahkan
hampir menyamai populasi kontrol. Ini menunjukkan, bahwa B. longum Y-01 dapat
bertahan pada lingkungan garam empedu.
Adaptasi Bifidobacteria untuk garam
empedu, biasanya dengan konsentrasi dibawah 5 mM, ini merupakan hal yang
penting dalam kolonisasi saluran pencernaan (Ruiz et al., 2009).
Karena itu,
ketahanan B. longum dalam usus akan mempengaruhi populasi B. longum dalam
kolon.
Pertumbuhan L. acidophilus Y-01 yang diberi perlakuan garam empedu dan
kontrol.
Perubahan populasi L. acidophilus Y-01 dengan penambahan garam
empedu lebih stabil dibandingkan kontrol.
L. acidophilus Y-01 bertahan dalam
kondisi saluran pencernaan yaitu usus, di mana garam empedu tersebut disekresikan.
36
Menurut Sanders (2000), Lactobacillus dan Bifidobacterium secara umum
lebih resisten terhadap garam empedu dibandingkan dengan genus Streptococcus dan
genus lainnya, terutama bakteri asam laktat yang digunakan sebagai kultur starter
yogurt. Namun secara keseluruhan, keempat bakteri asam laktat indigenous susu
sapi segar ini masih dapat hidup pada kondisi garam empedu. Jacobsen et al. (1990),
semua mikroba yang berhasil hidup setelah ditumbuhkan dalam MRSA yang
ditambah 0,3% oxgall, dinyatakan bersifat tahan terhadap garam empedu.
Ketahanan Kultur Starter BAL Indigenous Susu Sapi Segar pada Antibiotik
Berbeda
Syarat bakteri asam laktat dikatakan sebagai bakteri probiotik adalah dapat
tahan terhadap antibiotik.
Antibiotik digunakan dalam dunia kedokteran untuk
pengobatan suatu penyakit yang disebabkan bakteri. Terapi obat dengan antibiotik
biasa dilakukan pada orang dewasa atau usia lanjut yang mengalami gangguan atau
penyakit yang bervariasi. Semakin bertambahnya usia, bakteri baik yang tumbuh
secara alami dalam saluran pencernaan pun mengalami penurunan populasi. Karena
itu diperlukan pangan yang mengandung bakteri baik agar mikroflora dalam usus
antara bakteri menguntungkan dan patogen tetap seimbang.
Populasi BAL indigenous susu sapi segar terhadap amoksisilin sebelum dan
sesudah inkubasi 24 jam disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5. Jumlah Populasi BAL Indigenous Susu Sapi Segar pada Amoksisilin
1.
S. thermophilus S-01
Populasi BAL (Log10 cfu/ml)
P0 jam
P24 jam
(P24 - P0)*
7,78 ± 0,92
5,49 ± 0,35
-2,32 ± 1,64
2.
L. bulgaricus S-01
7,72 ± 0,05
6,23 ± 0,66
-1,49 ± 1,05
3.
B. longum Y-01
7,65 ± 0,13
7,82 ± 0,10
0,17 ± 0,12
4.
L. acidophilus Y-01
7,82 ± 0,79
8,20 ± 0,37
0,38 ± 0,27
No
Kultur bakteri
Keterangan : * apabila hasilnya (-) menunjukan adanya kematian;
** huruf superskript yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata
(P<0,05)
Antibiotik yang sering digunakan dalam dunia kedokteran untuk mengobati
berbagai macam penyakit adalah amoksisilin dan kloramfenikol.
Penggunaan
antibiotik ini adalah karena keduanya mempunyai spektrum luas terhadap aktivitas
37
bakteri Gram positif dan Gram negatif.
Namun, cara kerja amoksisilin dan
kloramfenikol terhadap bakteri-bakteri tersebut berbeda.
Tabel 5 menunjukkan hasil bahwa keempat bakteri tersebut dapat tahan
terhadap amoksisilin.
Hasil pada Tabel 5 menunjukkan B. longum Y-01 dan
L.acidophilus Y-01 mengalami kenaikan populasi, sedangkan S. thermophilus S-01
dan L. bulgaricus S-01 mengalami penurunan populasi setelah diinkubasi selama 24
jam. S. thermophilus S-01 mengalami penurunan populasi sekitar 2,3 log10 cfu/ml,
sedangkan L. bulgaricus S-01 mengalami penurunan populasi sekitar 1,4 log10
cfu/ml. Hasil ini menunjukkan ketahanan B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01
lebih baik dibandingkan dengan S. thermophilus S-01 dan L. bulgaricus S-01.
Formulasi amoksisilin adalah mengandung antibiotik semisintetik, analog
ampisilin, dengan spektrum yang luas dari aktivitas bakterisidal terhadap
mikroorganisme Gram negatif dan Gram positif. Alcamo (1984) juga menyatakan
bahwa amoksisilin bekerja pada spektrum luas, terutama dalam menghambat bakteri
Gram positif. Kline (2009), mengatakan untuk mengurangi perkembangan bakteri
resisten terhadap obat dan menjaga efektivitas amoksisilin dan obat antibakterial lain,
amoksisilin harus digunakan hanya untuk mengobati atau mencegah infeksi yang
terbukti atau diduga disebabkan oleh bakteri.
Penurunan populasi ini disebabkan karena amoksisilin dapat menghambat
biosintesis mukopeptida dinding sel dan menghambat komponen peptidoglikan pada
dinding sel. Lapisan peptidoglikan terdiri dari unit-unit glikan tetrapeptida yang
membentuk suatu polimer, yaitu mukopeptida. Peptidoglikan ini terdiri dari turunan
gula yaitu N-asetilglukosamin dan N-asetilmuramat serta beberapa asam amino yaitu
L-alanin,
D-alanin,
asam
D-glutamat
dan
asam
diaminopimelat
(ADP).
Peptidoglikan yang tebal dan ikatan rantai asam teikoat inilah yang dapat
mempertahankan bentuk dinding sel dari kondisi asam ekstraseluler (Fardiaz, 1989).
Lapisan peptidoglikan juga berperan penting dalam menstabilkan sel bakteri. Jika
lapisan peptidoglikan rusak, maka pori-pori pada dinding sel membesar, bentuk sel
tidak kaku, tidak tahan terhadap kondisi ekstraseluler yang ekstrim, sehingga terjadi
permeabilitas sel dan materi intraseluler keluar. Sitoplasma dan ribosom yang keluar
mengakibatkan sel tidak dapat melakukan metabolisme dan sintesis protein, dinding
sel menjadi rusak dan tidak dapat melindungi materi dalam sel. Amoksisilin aktif
38
pada beberapa strain mikroorganisme tertentu seperti mikroorganisme Gram positif
dan negatif yang bersifat aerobik (Kline, 2009).
Cara kerja amoksisilin mirip dengan ampisilin dalam menghambat aksi
bakterisidal terhadap organisme yang rentan selama pembelahan masih aktif.
Amoksisilin bersifat bakterisidal, yaitu membunuh bakteri secara langsung, dengan
menghambat pembentukan lapisan khusus di seluruh bagian tubuh bakteri. Lapisan
ini berperan penting dalam melindungi bakteri dari kondisi lingkungan dan agar
tubuh bakteri tidak tercerai –berai (Schunack et al., 1990).
Populasi BAL indigenous susu sapi segar terhadap kloramfenikol sebelum
dan sesudah inkubasi 24 jam dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6. Jumlah Populasi BAL Indigenous Susu Sapi Segar pada Kloramfenikol
1.
S. thermophilus S-01
Populasi BAL (Log10 cfu/ml)
P0 jam
P24 jam
(P24 - P0)*
7,70 ± 0,03
8,27 ± 0,42
0,58 ± 0,41
2.
L. bulgaricus S-01
7,29A ± 0,02
8,04B ±0,08
0,76 ± 0,54
3.
B. longum Y-01
7,92A ± 0,03
8,12B ±0,03
0,20 ± 0,14
4.
L. acidophilus Y-01
7,73a ± 0,05
8,23b ± 0,11
0,50 ± 0,35
No
Kultur bakteri
Keterangan : * apabila hasilnya (-) menunjukan adanya kematian;
** huruf superskript (a dan b) yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda
nyata (P<0,05)
*** huruf superskript (A dan B) yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan
berbeda sangat nyata (P<0,01)
Selain diujikan pada amoksisilin, bakteri asam laktat indigenous susu sapi
segar juga diujikan pada antibiotik kloramfenikol. Kloramfenikol memiliki spektrum
yang luas terhadap aktivitas bakteri Gram positif dan negatif. Namun, di Amerika
serikat, kloramfenikol dilarang penggunaannya pada hewan yang akan dikonsumsi
(USDA, 2003). Penggunaan berlebihan kloramfenikol dapat menyebabkan karsinogen pada manusia dan bersifat bakterisidal pada bakteri. Namun, kloramfenikol
memang sangat efektif menghambat Gram positif, Gram negatif, riketsia dan fungi.
Bahkan kloramfenikol tetap dipertahankan karena penting dalam pengobatan
berbagai penyakit.
Semua bakteri asam laktat mampu bertahan dalam media yang ditambahkan
kloramfenikol (Tabel 6), bahkan mengalami kenaikan populasi dari awal pengujian
39
sampai masa inkubasi 24 jam. Antibiotik ini juga berpengaruh secara nyata terhadap
populasi awal dan akhir BAL L. acidophilus Y-01 (P>0,05) dan berpengaruh sangat
nyata (P<0,01) pada BAL L. bulgaricus S-01 dan B. longum Y-01. Kenaikan
populasi semua BAL mulai dari 0,2–0,7 log10 cfu/ml.
Cara kerja kloramfenikol bersifat
bakteriostatik,
yaitu menghambat
pertumbuhan bakteri. Kerja kloramfenikol dengan menghambat sintesis protein pada
bakteri dengan mengikat subunit pada ribosom dan menahan beberapa enzim yang
dihasilkan dalam sintesis protein.
Ribosom berfungsi untuk sintesis protein.
Penyusun utama bakteri adalah protein, yaitu sekitar 15% berat sel. Jika sintesis
protein terhambat, maka protein tidak dihasilkan untuk menyusun lapisan tubuh dan
membentuk ikatan peptida pada bakteri. Asam amino dari protein dibutuhkan untuk
membentuk lapisan peptidoglikan yang kaku untuk mempertahankan bentuk sel.
Ribosom pada sel mitokondria mamalia juga berpengaruh terhadap jaringan
perkembangbiakan, misalnya sistem hematopoietik sebagai toksisitas kloramfenikol
(USDA, 2003).
Sebagian besar bakteri asam laktat lebih sensitif terhadap antibiotik jenis
kloramfenikol dibandingkan dengan amoksisilin, terlihat dari jumlah kematian dan
penurunan populasi (Firmansyah, 2009). Tetapi bakteri asam laktat S.thermophilus
S-01, L. bulgaricus S-01, B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01 menunjukkan
lebih resisten pada antibiotik kloramfenikol. Perbedaan yang terjadi pada masingmasing antibiotik disebabkan antibiotik mempunyai cara kerja yang berbeda-beda.
Galur yang berbeda pada tiap bakteri asam laktat mempunyai mekanisme yang
berbeda terhadap berbagai perlakuan yang diberikan. Galur bakteri asam laktat yang
sama serta diisolasi dari sumber yang sama pun, mempunyai keragaman toleransi
terhadap kondisi lingkungan yang dapat menyebabkan stress (Chou dan Weimer,
1999).
Perubahan populasi antara kontrol, amoksisilin dan kloramfenikol setiap satu
jam selama pengamatan 24 jam dapat dilihat pada Gambar 7.
Keempat grafik
menunjukkan ketahanan bakteri terhadap kloramfenikol lebih baik dibandingkan
pada amoksisilin. Beberapa jam pada awal perlakuan populasi amoksisilin hampir
sama dengan kloramfenikol, bahkan pada L. bulgaricus S-01 nilai absorbansi
amoksisilin lebih tinggi dibandingkan dengan kloramfenikol.
40
Keterangan : kontrol ( ), amoksisilin ( ), kloramfenikol ( )
Gambar 7. Grafik Kurva Pertumbuhan Kultur Starter a). S. thermophilus S-01, b).
L. bulgaricus S-01, c). B. longum Y-01, d). L. acidophilus Y-01 pada
Amoksisilin dan Kloramfenikol
41
Cara kerja kloramfenikol dan amoksisilin terhadap masing-masing bakteri
asam laktat berbeda-beda. Firmansyah (2009), melakukan penelitian bakteri asam
laktat yang diujikan dalam antibiotik kloramfenikol dan amoksisilin, dan hasilnya
adalah bakteri asam laktat lebih tahan tumbuh pada amoksisilin dibandingkan pada
kloramfenikol. Ini menunjukkan mekanisme bakteri asam laktat terhadap perlakuan
yang diberikan berbeda, setiap galur mempunyai mekanisme berbeda dalam
memberikan reaksi terhadap penghambatan yang dilakukan oleh antibiotik (Chou
dan Weimer, 1999).
Kontrol (tidak ditambahkan antibiotik) pada setiap jamnya terjadi kenaikan
populasi. Hasil ini membuktikan bahwa antibiotik dapat menghambat pertumbuhan
bakteri asam laktat.
Antibiotik merupakan senyawa antibakteri alami yang
dihasilkan oleh beberapa mikroorganisme untuk menghambat mikroorganisme lain.
Antibiotik sintesis juga sudah banyak digunakan dalam dunia kedokteran, terutama
dalam pengobatan penyakit karena bakteri. Antibiotik memang digunakan untuk
membidik bakteri Gram negatif atau Gram positif serta melakukan penghambatan
terhadap proses biokimia bakteri, terutama dalam proses infeksi oleh bakteri (Pelczar
dan Chan, 2008).
Aktivitas Antimikroba Bakteri Asam Laktat Indigenous Susu Sapi Segar
terhadap Bakteri Patogen
Salah satu karakteristik suatu bakteri asam laktat dapat dikategorikan sebagai
probiotik adalah memiliki aktivitas antimikroba terhadap bakteri patogen. Sifat
antimikroba adalah suatu kemampuan antagonistik suatu senyawa kimia untuk
menghambat
pertumbuhan
mikroba
yang
tidak
diinginkan.
Kemampuan
penghambatan ini disebabkan oleh produksi senyawa antimikroba berupa asam laktat
dan metabolit lain seperti bakteriosin, hidrogen peroksida dan asam lemak rantai
pendek (Drago et al., 1997). Mekanisme penghambatan pertumbuhan mikroba oleh
senyawa antimikroba bakteri asam laktat antara lain (1) perusakan dinding sel
sehingga mengakibatkan lisis atau menghambat pembentukan dinding sel yang
sedang tumbuh, (2) mengubah permeabilitas membran sitoplasma sehingga terjadi
kebocoran nutrien dalam sel dan (3) merusak sistem metabolisme dengan cara
menghambat kerja enzim intraseluler (Widiasih, 2008).
42
Penggunaan S. Typhimurium, E. coli, dan S. aureus
ini adalah karena
patogen tersebut sering menyerang manusia dan menjadi penyebab penyakit.
S.Typhimurium merupakan patogen penyebab tipus, gangguan perut dan infeksi pada
usus. E. coli merupakan bakteri alami dalam saluran pencernaan manusia, dengan
jumlah terbatas. Jika jumlahnya melebihi batas dan lebih besar dibandingkan dengan
bakteri probiotik, maka E. coli dapat menghasilkan keton yang merupakan racun bagi
manusia.
Keton kemudian mengikis permukaan usus dan menyebabkan diare,
bahkan diare berdarah. S. aureus terdapat secara alami pada sel pernafasan dan kulit.
S. aureus merupakan penyebab keracunan makanan, yang mengakibatkan penderita
mengalami diare, muntah dan kejang (Todar, 2008; Drago et al., 1997)
Aktivitas antagonistik BAL terhadap S. Typhimurium ATCC 14028 dapat
dilihat pada Tabel 7. Bakteri asam laktat yang berbeda dari indigenous susu sapi
segar tidak mempengaruhi besarnya diameter zona hambat yang dihasilkan masingmasing bakteri asam laktat
S.Typhimurium (P>0,05).
yang dikonfrontasikan pada bakteri patogen
Tiap bakteri asam laktat indigenous susu sapi segar
menghasilkan zona bening di sekitar lubang dan menunjukkan adanya aktivitas
antimikroba pada bakteri asam laktat yang diujikan terhadap S. Typhimurium.
Tabel 7. Aktivitas Antagonistik BAL Indigenous Susu Sapi Segar terhadap S.
Typhimurium ATCC 14028
No
1.
2.
3.
4.
Kultur Bakteri
Diameter penghambatan (mm)
S. thermophilus S-01
15,0 ± 0,4
L. bulgaricus S-01
11,0 ± 0,7
B. longum Y-01
13,1 ± 0,2
L. acidophilus Y-01
15,4 ± 0,3
Keterangan : besarnya diameter lubang 7 mm
Besarnya zona hambat S. thermophilus S-01, L. bulgaricus S-01, B. longum
Y-01 dan L. acidophilus Y-01 berbeda-beda. L. bulgaricus S-01 menghasilkan zona
hambat yang paling kecil dibanding dengan S. thermophilus S-01, B. longum Y-01
dan L. acidophilus Y-01. Ini menunjukkan S. Typhimurium lebih sensitif terhadap
produksi antimikroba S. thermophilus S-01, B. longum Y-01 dan L. acidophilus Y01.
43
Antimikroba bakteri asam laktat yang diisolasi dari produk susu seperti
yogurt dan yogurt probiotik mempunyai aktivitas antimikroba.
Chuayana et al.
(2003), menyatakan bakteri yang diisolasi dari produk yogurt mengandung bakteri
asam laktat Streptococcus spp., Lactobacillus spp. dan Bifidobacterium spp. dan
menghasilkan zona hambat terhadap semua patogen, termasuk S. Typhimurium.
S. Typhimurium mampu dihambat oleh asam propionat, asam asetat dan asam
laktat. Senyawa metabolit yang paling penting dalam menginaktivasi Salmonella
adalah asam laktat (Ray, 2004). Ini dikarenakan S. Typhimurium tumbuh pada pH
netral 6,6–8,2. Kondisi pH >9,2 dan <4,0 akan menyebabkan kematian bakteri ini.
Keempat bakteri ini adalah bakteri asam laktat, dan menghasilkan molekul organik
sebagai adanya aktivitas antimikroba. S. thermophilus memproduksi asam laktat
dalam bentuk L(+), asetildehida dan diasetil dari laktosa, sedangkan L. bulgaricus
menghasilkan asam laktat D(-), asetaldehida dan hidrogen peroksida. L. acidophilus
dan L. bulgaricus memproduksi bakteriosin dengan tingkat kesensitifan yang
bervariasi (Nowroozi et al., 2004). Menurut Surono (2004), dibandingkan dengan
asam laktat D(-), asam laktat L(+) memberikan penghambatan yang lebih kuat
terhadap bakteri yang tidak diinginkan. Ini dapat dibuktikan dengan diameter yang
dihasilkan S. thermophilus S-01 lebih besar dibandingkan dengan L. bulgaricus S-01.
Surono (2004) menambahkan, efek antimikroba merupakan akibat dari
penurunan pH dan bentuk asam organik yang tidak terdisosiasi. Asam tidak
terdisosiasi ini dapat menembus dinding sel bakteri Gram negatif yang memiliki
kandungan lipid tinggi, yaitu 11-22%. Kondisi asam ekstraseluler mengakibatkan
pori-pori dinding sel bakteri Gram negatif membesar dan terjadi permeabilitas sel,
sehingga materi intraseluler banyak keluar. Kondisi pH ekstraseluler yang rendah
mengakibatkan asidifikasi sel sitoplasma dan asam yang tidak terdisosiasi menjadi
lipofilik sehingga dapat berdifusi ke dalam membran.
Keadaan ini yang akan
mengganggu sistem transport substrat dalam sel, sehingga tidak ada pasokan nutrien
untuk proses metabolisme sel.
Senyawa antimikroba yang dihasilkan BAL selain asam organik adalah
bakteriosin dan hidrogen peroksida (H2O2).
Target utama bakteriosin yang
diproduksi adalah membran sitoplasma, karena bakteriosin memulai reaksi-reaksi
yang mengubah permeabilitas membran sehingga mengganggu transpor membran
44
atau menghilangkan tenaga gerak proton yang menghasilkan terhambatnya produksi
energi dan biosintesis protein atau asam nukleat (Nissen-Meyer et al., 1992).
Hidrogen peroksida merupakan hasil aerobik bakteri, bekerja menghambat
pertumbuhan bakteri karena bersifat toksik bagi bakteri yang tidak tahan.
Uji
katalase menunjukkan S. Typhimurium ATCC 14028 termasuk dalam katalase
positif, yaitu bakteri ini mempunyai enzim katalase untuk memecah H2O2 menjadi
H2 dan O2, sehingga bakteri ini mampu bertahan terhadap hidrogen peroksida yang
dihasilkan BAL (Hadioetomo, 1993).
Diameter zona bening yang terbentuk sebagai aktivitas antagonistik BAL
terhadap E.coli ATCC 25922 dapat dilihat pada Tabel 8.
Tabel 8. Aktivitas Antagonistik BAL Indigenous Susu Sapi Segar terhadap E. coli
ATCC 25922
No
Kultur Bakteri
Diameter penghambatan (mm)
1.
S. thermophilus S-01
15,6 ± 0,7
2.
L. bulgaricus S-01
11,0 ± 0,1
3.
B. longum Y-01
4.
L. acidophilus Y-01
14,7 ± 0,4
15,1 ± 0,4
Keterangan : Besarnya diameter lubang 7 mm
Besarnya diameter zona hambat terhadap bakteri patogen E. coli tidak
dipengaruhi oleh bakteri asam laktat indigenous susu sapi segar yang berbeda
(P>0,05). Diameter zona bening terlihat di sekitar sumur, dan menunjukkan adanya
aktivitas antimikroba yang dihasilkan setiap bakteri asam laktat. Berdasarkan Tabel
8 zona hambat L. bulgaricus S-01 lebih kecil dibandingkan S. thermophilus S-01, B.
longum Y-01 dan L. acidophilus Y-01. Ini menunjukkan E. coli kurang sensitif
terhadap aktivitas antimikroba yang dihasilkan L. bulgaricus S-01. Namun, menurut
Nuryani (2006), E. coli merupakan bakteri Gram negatif yang paling sensitif
terhadap aktivitas antimikroba bakteri asam laktat yogurt, dengan rataan diameter
zona hambat 8,05±0,18 (diameter sumur 5 mm), jika dibandingkan dengan
S.Typhimurium dan Pseudomonas sp.
Dibandingkan dengan penelitian yang
dilakukan Nuryani (2006), diameter penghambatan zona bening BAL hasil isolasi
susu sapi segar ini lebih besar, ini dikarenakan filtrat bebas sel yang dikonsentrasikan
45
hingga 5 kali dari volume awal, sehingga senyawa antimikroba yang dihasilkan lebih
maksimal.
E. coli tumbuh optimum pada pH 7,0-7,5, dengan pH minimum 4 dan pH
maksimum 8,5. Asam laktat yang tak terdisosiasi dapat menghambat pertumbuhan
E. coli (Cotter and Hill, 2003). Asam-asam lipofilik seperti asam laktat dan asetat
dalam bentuk tidak terdisosiasi dapat menembus sel antimikroba dan pada pH
intraseluler yang lebih tinggi, berdisosiasi menghasilkan ion-ion hidrogen dan
mengganggu fungsi metabolik essensial seperti translokasi substrat dan fosforilaso
oksidatif, dengan demikian mereduksi pH intraseluler (Naidu dan Clemens, 2000).
Bakteri asam laktat yang dikonfrontasikan menghasilkan asam, sehingga bakteri
patogen disekitar sumur menjadi terhambat pertumbuhannya.
S. thermophilus, L. bulgaricus, B. longum dan L. acidophilus digunakan
dalam memfermentasi yogurt probiotik, yang menghasilkan metabolit antimikroba
yaitu asam asetat dan asam laktat.
antimikroba tersebut.
E. coli sangat sensitif terhadap metabolit
Keempat bakteri ini adalah bakteri asam laktat dan
menghasilkan molekul organik sebagai adanya aktivitas antimikroba. S.thermophilus
memproduksi asam laktat dalam bentuk L(+), asetildehida dan diasetil dari laktosa,
sedangkan L. bulgaricus menghasilkan asam laktat D(-), asetaldehida dan hidrogen
peroksida (Nowroozi et al., 2004)
Bakteri Gram negatif lebih sensitif terhadap metabolit antimikroba
dibandingkan dengan bakteri Gram positif. Asam laktat yang dihasilkan dapat
melemahkan permeabilitas bakteri Gram negatif dengan merusak membran luar
bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif tidak mempunyai mekanisme pompa
proton yang mampu menyeimbangkan pH di dalam sel dan substrat antimikroba lain
tidak dapat berpenetrasi ke dalam membran sitoplasma (Cotter dan Hill, 2003).
Kerusakan yang terjadi pada membran luar bakteri, terjadi karena bakteri Gram
negatif seperti E. coli ini mempunyai lapisan dinding sel yang tipis dan lipid yang
tebal mencapai 11-22%.
Keadaan asam ekstraseluler membuat pori-pori sel
membesar, terjadi peningkatan permeabilitas sel, sehingga materi yang tidak
dibutuhkan untuk metabolisme masuk ke dalam sel, sedangkan materi intraseluler sel
banyak yang keluar. Materi intraseluler seperti sitoplasma dan ribosom tidak dapat
melakukan fungsinya untuk mengangkut nutrien dan mensintesis protein.
46
Selain sensitif terhadap asam organik, bakteri patogen juga dapat dihambat
dengan bakteriosin dan hidrogen peroksida.
Uji katalase yang dilakukan
menunjukkan bahwa E. coli ATCC 25922 ini termasuk dalam katalase positif.
Bakteri E. coli mempunyai enzim katalase untuk memecah H2O2 menjadi H2 dan O2,
karena H2O2 ini dapat menjadi toksik bagi bakteri E. coli itu (Hadioetomo, 1993).
Diameter penghambatan yang merupakan aktivitas antagonistik BAL
terhadap S.aureus ATCC 25923disajikan pada Tabel 9.
Tabel 9. Aktivitas Antagonistik BAL Indigenous Susu Sapi Segar terhadap S. aureus
ATCC 25923
No
Kultur Bakteri
Diameter penghambatan (mm)
1.
S. thermophilus S-01
14,6 ± 0,4
2.
L. bulgaricus S-01
12,8 ± 0,3
3.
B. longum Y-01
13,8 ± 0,5
4.
L. acidophilus Y-01
11,8 ± 0,1
Keterangan : Besarnya diameter lubang 7 mm
Perbedaan jenis bakteri asam laktat tidak mempengaruhi besarnya diameter
zona hambat terhadap bakteri patogen S. aureus.
Zona hambat yang terbentuk
menunjukkan adanya aktivitas antimikroba dalam menghambat bakteri S. aureus.
Bakteri probiotik mampu menghambat bakteri Gram positif dan negatif, termasuk S.
aureus (Nowroozi et al., 2004). S. aureus tumbuh pada pH 4,0–8,0, produksi asam
laktat akan menurunkan pH disekitar S. aureus, dan pada kondisi pH rendah,
pertumbuhan bakteri ini terhambat. Selain itu, S. aureus sensitif terhadap metabolit
antimikroba yang dihasilkan bakteri asam laktat, antara lain asam asetat dan asam
laktat. Asam-asam organik yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat yang mengakibatkan akumulasi produk akhir asam dan turunnya pH yang menyebabkan
penghambatan yang luas terhadap bakteri Gram positif dan negatif.
L. plantarum, L. bulgaricus, L. acidophilus dan L. casei yang dapat
memproduksi senyawa antimikroba dibandingkan 28 jenis Lactobacilli lainnya yang
dikonfrontasikan terhadap bakteri patogen. Sensitifitas masing-masing bakteri juga
sangat bervariasi (Nowroozi et al., 2004). Senyawa antimikroba yang dihasilkan
L.bulgaricus adalah bakteriosin, yang mempunyai aktivitas antimikroba terhadap
47
beberapa penyebab pembusukan makanan dan bakteri patogen antara lain L.
monocytogenes, Y. enterocolitica, S. aureus, B. subtilis dan S. Typhimurium.
Semakin luas zona bening yang terlihat, maka makin sensitif bakteri patogen
yang diujikan. S. aureus adalah bakteri Gram positif yang paling sensitif terhadap
antimikroba bakteri asam laktat yogurt, jika dibandingkan dengan Bacillus cereus.
Rataan diameter zona hambat Gram positif adalah 6,81±0,11 (diameter sumur 5 mm)
(Nuryani, 2006).
Struktur dinding sel bakteri Gram positif memiliki satu lapisan
tebal peptidoglikan, sedangkan Gram negatif relatif lebih kompleks dengan tiga
lapisan berupa lipoprotein (lapisan luar), lipolisakarida (lapisan tengah) dan
peptidoglikan (lapisan dalam).
Kandungan lipid pada dinding sel Gram positif
hanya sekitar 1-4%, lebih tipis dibandingkan dengan kandungan lipid Gram negatif.
Perbedaan lapisan ini mempengaruhi penghambatan terhadap bakteri asam laktat
yang diujikan.
Menurut Nowroozi et al. (2004), L. acidophilus dan L. bulgaricus
memproduksi bakteriosin dan mempunyai tingkat kesensitifan yang sangat
bervariasi.
Maksimum aktivitas antimikroba adalah pada akhir fase pertumbuhan
log dan awal fase statis (Nowroozi et al., 2004; Oh et al., 2000).
Zona hambat yang dihasilkan BAL terhadap ketiga bakteri secara
keseluruhan menunjukkan bahwa senyawa antimikroba yang dihasilkan memang
dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Beberapa senyawa antimikroba
memang dihasilkan oleh BAL, namun dalam penelitian ini diduga asam organiklah
yang berperan besar dalam menghambat pertumbuhan patogen. Ini dikarenakan
filtrat bebas sel terkonsentrasi yang digunakan mempunyai pH sekitar 4,0-4,2.
Tetapi, tidak menutup kemungkinan bahwa zona hambat yang terbentuk juga
disebabkan oleh hidrogen peroksida, bakteriosin atau senyawa antimikroba lainnya.
Diameter penghambatan yang terbentuk pada bakteri asam laktat yang biasa
digunakan untuk pembuatan yogurt, yaitu S. thermophilus dan L. bulgaricus,
mempunyai besar penghambatan yang berbeda.
Diameter penghambatan
S.thermophilus terhadap ketiga bakteri patogen, lebih besar daripada L. bulgaricus.
Ini terkait dengan jenis asam laktat yang dihasilkan kedua bakteri ini. S.thermophilus
menghasilkan asam laktat L(+), sedangkan L. bulgaricus menghasilkan asam laktat
D(-).
Menurut Surono (2004), asam laktat L(+) mempunyai kemampuan
menghambat yang lebih kuat terhadap bakteri-bakteri yang tidak diinginkan,
48
dibanding dengan asam laktat D(-). Asam laktat (+) maksimal dihasilkan pada awal
fase pertumbuhan, sedangkan asam laktat D(-) dihasilkan pada akhir fase
pertumbuhan. Dalam pangan, asam laktat L(+) lebih cepat dimetabolit dan lebih
mudah diserap tubuh.
Hasil rekapitulasi karakteristik BAL untuk menjadi kandidat bakteri probiotik
melalui pengujian pada kondisi saluran pencernaan, khususnya pada kondisi
lambung dan usus secara in vitro, disajikan dalam Tabel 10.
Tabel 10. Rekapitulasi Karakteristik BAL Indigenous Susu Sapi Segar sebagai
Kandidat Bakteri Probiotik
Kultur starter
S. thermopilus
pH
2
2,5
-
-
S-01
L. bulgaricus
S-01
B. longum
Y-01
Garam
7,2
empedu
+
+
-
(75%)
(106%)
3,2
Y-01
Amoksisilin
Antimikroba
Kloramfenikol
+
+
(71%)
(107%)
+
+
+
+
+
+
+
(97%)
(84%)
(94%)
(89%)
(72%)
(81%)
(110%)
+
+
+
+
+
+
+
(106%)
(101%)
(102%)
(103%)
+
+
+
+
(105%)
(103%)
(105%)
(106%)
(102%) (103%) (106%)
L. acidophilus
Antibiotik
+
+
+
(101%) (103%) (104%)
+
+
+
+
Keterangan : (-) : BAL tidak tahan dan tidak terdapat pertumbuhan
(+) : BAL mampu bertahan ditunjukkan oleh (%) bakteri hidup
Hasil rekapitulasi menunjukkan S. thermophilus tidak tahan pada kondisi pH
2 dan 2,5 serta garam empedu. Ini berarti S. thermophilus tidak tahan di dalam
lambung dan usus halus (duodenum).
Padahal, salah satu syarat BAL menjadi
kandidat bakteri probiotik adalah tahan pada kondisi asam dalam lambung dan tahan
garam empedu.
probiotik.
Karena itu, S. thermophilus bukan sebagai kandidat bakteri
Ketiga BAL lain, yaitu L. bulgaricus S-01, B. longum Y-01 dan
L.acidophilus Y-01 dapat dikatakan sebagai kandidat bakteri probiotik karena
kemampuannya bertahan pada semua kondisi pH, garam empedu, antibiotik dan
mampu menghasilkan senyawa antimikroba dalam menghambat bakteri patogen.
Kemampuan BAL bertahan atau tidak dalam kondisi pH yang berbeda, garam
empedu dan antibiotik, dipengaruhi oleh lapisan dinding sel masing-masing bakteri.
Lapisan dinding sel bakteri Gram positif lebih tebal dibanding Gram negatif, namun
49
mempunyai lapisan lipid yang lebih tipis sekitar 1-4%. Dinding sel Gram positif
terdiri dari 90% peptidoglikan dan 10% asam teikoat. Lapisan lipid yang tipis
menyebabkan pori-pori sel menjadi mengecil saat asam, garam dan antibiotik
melakukan penghambatan terhadap BAL. Hal ini menghambat terjadinya
permeabilitas sel yang berlebihan dan tidak terjadi ekstraksi materi intraseluler sel.
Lapisan dinding sel inilah yang menyebabkan BAL mampu bertahan dalam kondisi
ektraseluler yang berbeda dengan intraseluler.
Selain itu, dibandingkan dengan
Gram negatif, bakteri Gram positif juga mempunyai kemampuan mempertahankan
pH sitoplasma lebih basa daripada pH ekstraseluler.
Setiap galur bakteri mempunyai ketahanan yang berbeda terhadap asam atau
pH rendah, contohnya Lactobacillus lebih toleran terhadap pH rendah dibandingkan
Lactococci dan Streptococci.
Dibandingkan dengan Streptococci, galur Lacto-
bacillus dan Bifidobacteria memang lebih toleran pada kondisi asam dan garam
empedu (Farida, 2006; Zinedine dan Faid, 2007). L. bulgaricus S-01 lebih optimal
tumbuh pada kondisi asam, sedangkan S. thermophilus S-01 lebih optimal tumbuh
pada kondisi pH mendekati normal (Oh et al., 2000).
50