View/Open - Repository | UNHAS

Deteksi Gen Phytoene Synthase 1 (PSY1) pada daun jagung kuning lokal
Sulawesi Selatan
JUHRIAH
Jurusan Biologi FMIPA Unhas
Jl. Perintis kemerdekaan Km 10. Makassar
[email protected]
ABSTRAK
Penelitian tentang Deteksi Gen Phytoene Synthase 1 (PSY1) pada daun jagung kuning lokal
Sulawesi Selatan, Ada 2 masalah dunia yang membutuhkan penanganan serius yaitu
peningkatan jumlah penduduk dunia dan defisiensi vitamin dan mineral, khususnya vitamin
A. Menurut perkiraan di akhir tahun 2050, populasi dunia akan mengalami peningkatan dua
kali lipat yaitu mendekati 12 milyar. Sebanyak 50 juta penduduk dunia saat ini mengalami
defisiensi vitamin A yang berakibat pada gangguan penglihatan, serta meningkatkan angka
kematian anak dan wanita hamil (WHO, 2010). Sekitar 250.000 sampai 500.000 anak-anak
kurang gizi di negara berkembang menjadi buta setiap tahun akibat kekurangan vitamin A,
dengan prevalensi tertinggi di Asia Tenggara dan Afrika ( Wikipedia, 2010). Jagung dapat
menjadi salah satu solusi karena produktivitasnya yang tinggi dan bijinya dapat mengandung
karoten (provitamin A) dengan kadar bervariasi. Phytoene synthase ( PSy1) berperan dalam
karotenoid endosperm biji jagung. (Gallagher et al, 2004) dapat dideteksi pada daun. Metode
yang digunakan adalah ekstraksi RNA (Kit produk Geneaid). RT-PCR (Hot Start Maxima)
dan elektroforesisi dengan gel agarose. Primer PSY1(GenBank ZMU32636). Hasilnya
diperoleh pita pada posis sekitar 1000 bp yang berdasarkan hasil sequencing matching 99%
dengan PSY1 jagung kultivar A619 (no aksesi FJ971249) genbank.
Kata kunci . Phytoene Synthase 1 (PSY1), karotenoid, jagung. RT-PCR.
Latar Belakang
Penduduk dunia mengalami peningkatan populasi sangat cepat. Menurut perkiraan, di
akhir tahun 2050, populasi dunia akan mengalami peningkatan dua kali lipat yaitu mendekati
12 milyar yang berarti membutuhkan produk bahan pangan dua kali lebih banyak dari saat
ini. Selain permasalahan pemenuhan kebutuhan pangan, defisiensi vitamin dan mineral,
khususnya vitamin A, juga merupakan permasalahan dunia yang sangat serius. Sebanyak 50
juta penduduk dunia saat ini mengalami defisiensi vitamin A yang berakibat pada gangguan
penglihatan, serta meningkatkan angka kematian anak dan wanita hamil (WHO, 2010).
Sekitar 250.000 sampai 500.000 anak-anak kurang gizi di negara berkembang menjadi buta
setiap tahun akibat kekurangan vitamin A, dengan prevalensi tertinggi di Asia Tenggara dan
Afrika, kira-kira setengahnya meninggal dan lainnya menjadi buta dalam waktu satu tahun
( Wikipedia, 2010). Pada Sidang Khusus PBB tentang Anak-anak tahun 2002 menetapkan
penghapusan kekurangan vitamin A pada tahun 2010.
1
Sekitar 1,2 miliar orang di dunia ini mengkonsumsi jagung sebagai makanan pokok
sementara jagung yang dihasilkan kekurangan vitamin dan mineral esensial yang dibutuhkan
oleh tubuh.
Dengan demikian
Pusat Penelitian Jagung dan Gandum Internasional
(CIMMYT) mengarahkan penelitian untuk menghasilkan jagung dengan kandungan
provitamin A, zat besi, dan Zink yang tinggi.
Jagung Zea mays L. salah satu anggota Poaceae sebagai sumber daya yang tersedia,
telah
digunakan untuk
mengeksplorasi faktor-faktor yang mengontrol karotenogenesis
endosperm. Kandungan karotenoid (provitamin A), pada biji jagung sangat bermanfaat untuk
memperbaiki gizi masyarakat karena akan dikonversi menjadi vitamin A. Giuliano dkk
(2008) memanfaatkan variasi genetik dan biokimia alami dalam koleksi plasma nutfah jagung
untuk mengidentifikasi potensi titik kontrol transkripsi yang mempengaruhi akumulasi
karotenoid endosperm, karena kontrol transkripsi memainkan peran besar dalam
karotenogenesis.
Karotenoid adalah kelompok kompleks pigmen isoprenoid yang bernilai gizi sebagai
senyawa provitamin A dan nonprovitamin A; warnanya yang bervariasi memberikan nilai
tambah komersial sebagai pewarna dalam makanan ( Matthews dan Wurtzel, 2007).
Endosperm jagung (Zea mays) mengandung karotenoid dengan tingkat yang bervariasi.
Phytoene synthase (PSy), sebagai enzim mengendalikan karotenoid endosperm ( Gallagher,
Matthews, Li, dan Wurtzel ,2004;. Wong, Lambert, Wurtzel, Rocheford, 2004;. Pozniak,
Knox, Clarke, dan Clarkel, 2007; Li, Vallabhaneni, dan Wurtzel
2008a, 2008b). PSy1
berperan dalam karotenoid endosperm biji jagung. (Gallagher et al, 2004).
Beberapa macam karotenoid yang penting dan mempunyai hubungan dengan gizi
adalah sebagai berikut:
Tabel 1. Jenis-Jenis karotenoid yang memiliki aktifitas vitamin A
Jenis karotenoid
Aktifitas Vitamin A (%)
α- karoten
4,17
β – karoten
8,33
y - karoten
4,17
β – crytoxantin
4,17
Sumber: Dietary Reference Intakes 2001 dalam Apriantini, 2009
2
Keempat jenis karoten tersebut sebagai prekusor vitamin A, yang paling efektif
adalah β – karoten karena setiap molekulnya bersama air dapat diubah oleh enzim β – karoten
-15 deoxygenase dalam usus menjadi 2 vitamin A sedangkan lainnya hanya mengasilkan satu
vitamin A (Hurst 2002)
Gambar 1. Jalur metabolism karoten. Sumber biotektanaman (2010)
(www.beritaiptek.com) diakses april 2011
Hasil penelitian Yasin (2008) menunjukan bahwa sejumlah populasi jagung Provit-A
benih asal CIMMYT dapat beradaptasi baik untuk lingkungan dataran rendah tropis
mempunyai peluang untuk menghasilkan varietas unggulan baru jagung provit-A yang kaya
beta carotene, namun sampai saat ini belum juga dihasilkan kultivar provit A.
Sulawesi Selatan
memiliki keanekaragaman hayati yang berpotensi untuk
dikembangkan, salah satunya adalah plasma nutfah jagung kuning lokal. Balitsereal Maros
menyimpan aksesi (koleksi) plasma nutfah jagung lokal Sulawesi Selatan yang
kemungkinan mengandung karetenoid yang tinggi dan berpotensi untuk dikembangkan
menjadi kultivar/varietas jagung provit A.
Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan penelitian pada 3 aksesi Sulawesi Selatan
untuk mendeteksi adanya gen Phytoene Synthase 1 (PSY1) pada daun sebagai gen penentu
karoten biji dengan membandingkan dengan 2 aksesi jagung asal CIMMYT (Kui Carotenoid
Syn dan Carotenoid Syn 3) yang telah diuji multi lokasi oleh peneliti di Balitsereal Maros .
3
Metodologi
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni 2011 dengan melakukan penanaman
benih 5 aksesi jagung di KP Balitsereal Maros yaitu 3 dari Sulawesi Selatan dan 2 benih
asala Cimmyt yang telah diuji multi lokasi yaitu Kui Carotenoid Syn dan Carotenoid Syn 3.
Deteksi gen PSY1 di Fakultas Pertanian IPB Bogor.
Bahan untuk deteksi gen Phytoene Synthase 1 (PSY1) berupa daun tanaman jagung .
Gen PSY1 yang akan dideteksi terletak pada RNA, untuk itu dilakukan ekstraksi RNA dari
daun dan amplifikasi dengan metode RT-PCR. RT-PCR yaitu suatu cara untuk mendeteksi
molekul RNA melalui amplifikasi sekuen RNA dalam bentuk cDNA (Complementary
DNA)
Primer yang digunakan adalah Primer gen PSY1 (GenBank ZMU32636) yaitu:
Primer forward (no. 509) 5'-GCATTGCTCAAACGCCAG-3';
Primer reverse (no. 519) 5'-CAGAGAGAGCGGCATCAAG-3',
Metode yang digunakan untuk analisis RNA mengikuti metode Gallagher et al.
(2004) dengan modifikasi mengikuti protokol laboratorium Pusat kajian Pengendalian hama
dan penyakit Terpadu Departemen Proteksi Tanaman Fakultas Peranian IPB Bogor (2011).
Ekstraksi Total RNA, RTR-PCR dan Elektroforesis
-
Ekstraksi RNA Total dan prosedur kerja sesuai petunjuk yang terdapat dalam KIT
(Geneaid). Secara ringkas prosedurnya adalah sebagai berikut:
Timbang Sampel (0,1 g), gerus sampel dgn ditambahkan N2 cair sampai jadi bubuk
lalu dimasukkan ke appendorf tube 1,5 cc dan ditambahkan 500 ul RB buffer dan 5 ul
mercaptoetanol kemudian divortex. Inkubasi pada suhu ruang selama 5 menit.
Masukkan filter kolom pada tube collection 2 ml dan masukkan sampel kedalamnya.
Sentrifuse 3000 rpm selama 3 menit. Buang filter column, pindahkan filtrate
( cairannya) kedalam appendorf tube yang baru (diukur volumenya) dan ditambahkan
ethanol ½ volume sampel. RB column dimasukkan pada collection tube 2 ml, lalu
masukkan sampel kedalamnya dan Sentrifuse pada 14.000 rpm selama 3 menit.
Supernatant di buang dan RB column dipindahkan ke dalam collection tube 2 ml yang
baru. Tambahkan 100 ul Dnase 1 solution ketengah RB column dan biarkan 10 menit
pada suhu ruang. Tambahkan 400 ul W1 buffer ke dalam RB column, sentrifuse pada
4
14.000 rpm selama 3 menit. Buang supernatan dan masukkan kembali RB column ke
collection tube 2 ml. Tambahkan 600 ul Wash bu ffer, (sebelumnya ditambahkan
ethanol sesuasi konsentrasi pada manual), sentrifuse pada 14.000 rpm selama 3 menit.
Buang supernatant dan masukkan kembali Rb column keda;am collection tube 2 ml.
Sentrifuse pada 14.000 rpm selama 4 menit.Pindahkan RB colum kedalam
microsentrifusec tube yag baru yang telah diberi label. Tambahkan RNa-free water.
Biarkan 3 menit. Sentrifuse selama 2 menit pada 14.000 rpm . Diperoleh RNA
(Cairan yang ada pada dasar tabung).
-
RT-PCR dengan one step RT-PCR Premix Hot Start Maxima dengan Kondisi PCR
sebagai berikut: Pre PCR ( 42 oC selama 60 menit, 94 oC selama 3 menit), 35 Siklus
Denaturasi, Anneling dan Ekstention (94 oC selama 30 detik, 54 oC selama 30 detik,
72 oC selama 45 detik). Post Ext 72 oC selama 10 menit.
-
Elektroforesis dengan menggunakan agarose 2 %. Caranya:
0,8 g agarose dilarutkan dalam 40 ml buffer TAE 1x, dipanaskan diatas Heat stirer
sampai agarose larut dan jadi bening, kemudian dibiarkan sampai suhu turun menjadi
60 oC dan dituang pada cetakan yang telah disiapkan dan diletakkan sisir. Setelah gel
mengeras kemudian sisir diangkat dan hasil PCR beserta marker disuntikkan kedalam
masing-masing sumur gel. Gel tersebut kemudian dimasukkan pada bak/tangki yang
telah berisi buffer TAE 1x dan dielektroforesis serkitar 30 menit.
5
Hasil dan Pembahasan
Penelitian tentang deteksi gen Phytoene Synthase 1 (PSY1) pada daun jagung kuning
3 aksesi dari Sulawesi Selatan dan 2 aksesi asal Cimmyt menunjukkan bahwa kelima sampel
memilki pita pada posisi sekitar 1000 bp. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada gambar 2 dan
gambar 3.
Gambar 2. Nomor 1, 2 dan 3 Sampel jagung Sulawesi Selatan
Nomor 4 ( Kui Carotenoid Syn), Nomor 5 ( Carotenoid Syn 3)
1
2
3
4
5
Gambar 3. Nomor 1, 2 dan 3 Sampel jagung Sulawesi Selatan
Nomor 4 ( Kui Carotenoid Syn), Nomor 5 ( Carotenoid Syn 3)
Pada gambar 2 terlihat bahwa intensitas pita yang ditemukan pada posisi sekitar 1000
bp sangat jelas. Hasil sequencing pita tersebut kemudian dicocokkan dengan data NCBI
menunjukkan bahwa 99% sesuai dengan PSY1 jagung kultivar A619 dengan nomor aksesi
6
FJ971249 yang telah dilaporkan Fu et al. 2010 yang terletak pada posisi 2229-3212 (983 bp).
Dari data tersebut diketahui bahwa ketiga aksesi asal Sulawesi Selatan memiliki gen PSY1
yang sama dengan 2 aksesi dari Cimmyt.
Kesimpulan dan Saran.
Plasma nutfah jagung kuning lokal Sulawesi Selatan dan jagung asal Cimmyt memilki
Gen PSY1 pada posisi sekitar 1000 bp (983 bp) yang 99% sesuai dengan PSY1 jagung
kultivar A619 dengan nomor aksesi FJ971249
Untuk mengatahui korelasi antara adanya gen PSY 1 pada daun dan kandungan
karoten pada biji maka penelitian tentang kadar karoten biji perlu dilakukan.
DAFTAR PUSTAKA
Apriantini, A., 2009. Kandungan Karoten, Sifat Fisik dan Kimia Serta Mutu Organoliptik
Pada Wortel (Daucus carota l.) Organik dan Non-Organik Selama Penyimpanan suhu
Dingin. IPB. Bogor
Gallagher CE, Matthews PD, Li F, Wurtzel ET (2004). Gene duplication in the carotenoid
biosynthetic pathway preceded evolution of the grasses (Poaceae). Plant Physiol 135:
1776–1783
Fu, Z., J. Yan, Y. Zheng, M.L. Warburton, J.H. Crouch and J-S Li , 2010. Nucleotide
diversity and molecular evolution of the PSY1 gene in Zea mays compared to some
other grass species. Theor Appl Cenet. 120: 707-720. www.springerlink.com dikases
7 September 2011.
Hurst,W.J, 2002. Methods of analysis for Fungtional foods and Nutraceuticals. Florida CRC
Press. Dalam Apriantini, A. 2009 . Kandungan Karoten, Sifat Fisik dan Kimia Serta
Mutu Organoliptik Pada Wortel (Daucus carota l.) Organik dan Non-Organik Selama
Penyimpanan suhu Dingin. IPB. Bogor
Li F, Vallabhaneni R, Wurtzel ET (2008a) PSY3, a new member of the phytoene synthase
gene family conserved in the Poaceae and regulator of abiotic-stress-induced root
carotenogenesis. Plant Physiol 146: 1333–1345
Li F, Vallabhaneni R, Yu J, Rocheford T, Wurtzel ET (2008b) The maize phytoene synthase
gene family: overlapping roles for carotenogenesis in endosperm,
photomorphogenesis, and thermal stress-tolerance. Plant Physiol 147: 1334–1346
Pozniak CJ, Knox RE, Clarke FR, Clarke JM (2007) Identification of QTL and association of
a phytoene synthase gene with endosperm colour in durum wheat. Theor Appl Genet
114: 525–537
7
WHO, World Food Programme, & UNICEF. (2007). Preventing and controlling
micronutrient deficiencies in populations affected by an emergency. Geneva,
Switzerland: WHO. Retrieved on December 20, 2007, from.
.
http://www.who.int/nutrition/publications/WHO_WFP_UNICEFstatement.pdf.
WHO,
2010.
Micronutrient
deficiencies.
(Vitamin
A
Deficiency).
http://www.who.int/nutrition/topics/vad/en/index.html diakses 28 Oktober 2010
Wikipedia, 2010 http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_A_deficiency diakses 28 okt 2010.
Wong JC, Lambert RJ, Wurtzel ET, Rocheford TR (2004) QTL and candidate genes
phytoene synthase and zetacarotene desaturase associated with the accumulation of
carotenoids in maize. Theor Appl Genet 108: 349–359
Yasin, H.G., 2008. Pembentukan dan Pemurnian Jagung Khusus Provit-A. Laporan Akhir
RPTP 2008. Balai penelitian Tanaman Serealia (BALITSEREAL) Maros.
8
9