Praktikum Biselmol I

Praktikum Biselmol I
1. Penentuan Akurasi dan Presisi Mikropipet
2. PCR gen aktin dari zebra fish
Mikropipet
Teknik Pipeting
Akurasi dan Presisi
Semakin besar E% ?
Semakin besar nilai RSD
Pengukuran yang baik jika?
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑢𝑘𝑢𝑟𝑎𝑛 − 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟
𝐸% =
𝑥 100
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟
𝑅𝑆𝐷 =
𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖
𝑥 100
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑟𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑢𝑘𝑢𝑟𝑎𝑛
PCR
• Metode amplifikasi DNA in vitro
• Amplifikasi DNA spesifik dengan proses replikasi DNA berulang kali
• 1 pg DNA dapat diamplifikasi menjadi 0,5 - 1 g DNA
• Urutan basa DNA yang akan diamplifikasi perlu diketahui
5
Replikasi DNA:
semi-konservatif
•
•
Satu molekul DNA
menjadi 2 molekul DNA
Masing-masing molekul
DNA baru:
•
•
•
1 untai lama
1 untai baru
Untai lama menjadi
templat bagi untai baru
6
Sintesis DNA
• DNA polimerase selalu memerlukan:
•
•
•
•
DNA templat (cetakan)
DNA primer
Kofaktor Mg++
Substrat dNTP:
•
•
•
•
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
• 3’-OH dari gula bereaksi dengan
fosfat dNTP
• Pirofosfat dilepas
• Arah sintesis DNA selalu dari 5’ ke 3’
Mathews et al. (2000) Electronic study guide for
5-8
7
Replikasi DNA in vitro
• Pemisahan kedua rantai DNA dengan
•
•
Alkali
Pemanasan
• Penyediaan primer
•
Oligonukleotida yang komplementer dengan templat
8
PCR
• Memerlukan
•
•
•
•
•
Templat
Sepasang primer
DNA polimerase termostabil
Mg++
dNTP
9
Templat PCR
• Fragmen DNA yang akan diamplifikasi ada pada templat
• Urutan DNA yang akan diamplifkasi sudah diketahui
• Minimal 1 molekul DNA
• Sumber:
• Darah, sperma & jaringan lain (yang segar maupun yang sudah
lama)
• Koloni bakteri, plaque
• DNA murni
10
Primer
• Panjang 18 - 30 nt
• Menentukan fragmen mana yang akan teramplifikasi
• Tm = suhu dimana separuh dari rantai DNA sudah terpisah
Tm harus sama.
Untuk primer < 25 nt: Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
• Dapat ditambahkan sisi pengenalan enzim restriksi pada ujung 5’ dari
primer
• Bila hanya diketahui urutan asam amino dari protein, dapat dibuat
primer degenerate
11
DNA polimerase termostabil
• Enzim Taq DNA polimerase
• Berasal dari Thermus aquaticus
• Pada 95oC, t1/2 = 2 jam
• Tidak mempunyai aktivitas exonuklease 3’  5’
(“proofreading”)
• akibatnya tingkat kesalahan replikasi DNA relatif tinggi
• Pada ujung 3’ ditambahkan dA
• Enzim Pfu DNA polimerase
• Berasal dari Pyrococcus furiosus
• Pada 95oC selama 90 menit, aktivitas masih 90%
• Mempunyai aktivitas exonuklease 3’  5’
(“proofreading”)
• Menghasilkan DNA ujung tumpul
12
Proses PCR
95oC, 3 menit
Denaturasi awal
95oC, 1 menit
Denaturasi
1x
40-65oC, 1-3 menit Penempelan
primer
72oC, 1 menit
Elongasi
25-35 x
72oC, 3 menit
1x
Elongasi akhir
Ukuran DNA hasil PCR ditentukan
dengan elektroforesis gel agarosa
13