PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN SIRIH MERAH (Piper c

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum)
TERHADAP JUMLAH SEL CD4+ PADA MENCIT (Mus musculus) MODEL
RHEUMATOID ARTHRITIS.
Putri Diyah Anggraini, Susilowati, dan Nuning Wulandari
Universitas Negeri Malang.
E-mail: [email protected]; [email protected],
[email protected]
ABSTRAK: Rheumatoid Arthitis (RA) merupakan salah satu penyakit autoimun yang
terjadi karena adanya stress oksidatif. Stres oksidatif memicu teraktivasinya sel CD4
menjadi CD4+. Hal ini menyebabkan inflamasi serta kerusakan pada membran synovial
dan sendi. Pemberian obat Non Steroid Anti Inflamation Drug (NSAID) dalam
pengobatan RA secara terus menerus akan mengakibatkan tukak dan pendarahan pada
saluran pencernaan dan hati. Sirih merah (Piper crocatum) yang memiliki kandungan
flavonoid diharapkan dapat berfungsi sebagai antioksidan dan mengurangi inflamasi
yang terjadi.Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak
daun sirih merah terhadap jumlah sel CD4+ dan dosis ekstrak daun sirih merah yang
paling efektif dalam menurunkan jumlah sel CD4+ pada mencit RA. Penelitian ini
menggunakan hewan coba mencit jantan yang dibagi menjadi enam kelompok yaitu
kontrol, mencit RA, mencit RA dengan obat aspirin, kelompok mencit RA yang
mendapat terapi sirih merah dengan dosis berturutan 100 mg/g BB, 200 mg/g BB dan
400mg/g BB dengan empat ulangan pada masing – masing kelompok perlakuan.
Pemberian perlakuan dilakukan dengan disonde lambung sebanyak 0,05 ml selama 21
hari. Pada akhir perlakuan mencit di bedah dan diisolasi sel limfositnya untuk
menghitung jumlah sel CD4+ menggunakan Flowcytometry. Hasil penelitian
menunjukan bahwa terapi ekstrak daun sirih merah secara signifikan (P<0,05)
menurunkan jumlah sel CD4+. Dosis terapi 200 mg/g BB menunjukkan kecenderungan
dosis efektif menurunkan jumlah sel CD4+.
Kata Kunci: ekstrak daun sirih merah, rheumathoid arthrits, CD4+
ABSTRACT: Rheumatoid arthritis ( RA) is one of an autoimmune disease because of
oxidative stress that would activated CD4 cells to CD4 + and increase number of CD4+
cells. It will cause inflammatory and damage in synovial membrane and joints.
Conventional therapy which used to overcome inflammatory by administer non-steroid
anti-inflammation drugs (NSAID) are able make bleeding and damage gastrointestinal
tract and liver. Red betel (Piper crocatum) content flavonoid which have oxidant
activity. This research was conducted to determine the effect of red betel leaf extract on
the number of cells CD4 + and to find dose red betel are able reduce number CD4 + cells
in RA mice.The animal used were eight weeks male swiss strain mice was eight weeks
with ranged of weight from 28-30 grams. Mice will devides into six group (normal, RA
without therapy, aspirin therapy, therapy by red betel leaf extract dose 100 mg/g, 200
mg/g and 400 mg/g). Each treatment were delivered by gavage with 0.05 mlfor 21
days. At the end of treatment the mice were sacrifice and lymphocytes were isolated to
count number of CD4 + cells using flowcytometry. The results showed leaf extract of
red betel has effect to decrease number of CD4 + cells on RA mice, whereas leaf extract
of red betel optimal dose are 200 mg/g and has tsendency to decrease the number of
CD4 + cells.
Keywords: red betel leaf extract, rheumatoid arthritis, number of CD4+
PENDAHULUAN
Rheumatoid Arthitis (RA) adalah penyakit autoimun yang menyebabkan peradangan
kronik dan degenerasi jaringan ikat pada membran synovial (Wiralis, 2008, McInnes &
Schett, 2011). Berdasarkan data World Health Organization (WHO) (2015) prevalensi
penyakit RA di dunia berkisar antara 0,3% hingga 1%. Prevalensi penderita RA sebanyak
35% di Indonesia padatahun 2011 dan jumlah ini meningkat menjadi 45% pada tahun 2013
(Nugroho, dalam Mariana, 2015). Sehubungan hal tersebut dari hasil beberapa penelitian
yang telah dilakukan untuk mengatasi masalah RA dengan menggunakan hewan coba
diketahui bahwa hewan yang diinduksi dengan Freund’s Adjuvant telah dilaporkan sebagai
model eksperimen RA (Setiawan, 2013). Induksi CFA dan IFA memicu terbentuknya radikal
bebas yaitu Reactive Oxygen Species (ROS) yang dapat menyebabkan stres oksidatif. Stres
oksidatif akan memicu meningkatnya jumlah sel CD4+ yang mengakibatkan terjadinya
inflamasi dan kerusakan pada sendi (Green & Flavell dalam Mandella, 2010).
Terapi konvensional yang digunakan dalam mengatasi inflamasi pada penderita RA
dilakukan dengan pemberian obat Non Steroid Anti Inflamation Drug (NSAID) misalnya
Aspirin. Pemberian obat NSAID ini bertujuan untuk mengurangi rasa nyeri dan inflamasi
yang terjadi, pemberian terapi tersebut dalam jangka waktu yang lama akan mengakibatkan
kerusakan pada saluran pencernaan dan hati (Yulistiani et al., 2007 & Wiralis, 2008). Oleh
karena itu diperlukan bentuk terapi yang aman dan tidak menimbulkan efek samping yang
berbahaya bagi penderita RA seperti terapi dengan menggunakan bahan herbal yang
mengandung senyawa bioaktif, yaitu sirih merah.
Sirih merah merupakan salah satu bahan herbal yang mengandung senyawa bioaktif yang
mengandung senyawa fitokimia meliputi alkaloid, triterpenoid, steroid, flavonoid, dan tanin.
Senyawa flavonoid termasuk senyawa fenolik alam yang potensial sebagai antioksidan yang
diduga mampu mengurangi stres oksidatif yang terjadi (Sherlawatyet al., 2011, Wientarsih,
2012 & Ria, 2011). Sirih merah (Piper crocatum) yang memiliki kandungan flavonoid diharapkan
dapat berfungsi sebagai antioksidan dan mengurangi inflamasi yang terjadi. Tujuan
dilaksanakannya penelitian ini untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun sirih
merah terhadap jumlah sel CD4+ dan dosis ekstrak daun sirih merah yang paling efektif
dalam menurun akan jumlah sel CD4+ pada mencit RA.
METODE PENELITIAN
Hewan Coba
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah 24 mencit (Mus muculus)
jantan galur Swiss dengan umur 8 minggu dan berat berkisar antara 28-30 g dalam keadaan
sehat dan tidak ada kelainan anatomis.
Tempat Penelitian dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Sub Laboratorium Fisiologi Hewan ruang 210,
kandang pemeliharaan hewan Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Malang dan
Laboraturium Biologi Molekuler Universitas Brawijaya Malang. Penelitian ini dilakukan
pada Bulan Oktober sampai Bulan November 2015.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah kandang mencit, botol minum khusus
mencit, timbangan digital, suntikan steril ukuran 1ml, feeding tube ukuran 3,5 mm, neraca
digital, seperangkat alat bedah, papan bedah, pangkal spuit, mikropipet, tabung propilen,
mikrotube, mikroskop, dan hemositometer.
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah aquades, CFA, IFA, ekstrak daun
sirih merah, PBS, pewarna tryphan blue dan antibodi FITC Rat Anti Mouse CD4 Clone
GK 1-5 (BD Pharmigen™).
Persiapan Hewan Coba
Mencit diaklimatisasikan pada suhu kandang pemeliharaan hewan selama 2 minggu.
Setelah 2 minggu mencit dibuat menjadi model RA dengan injeksi CFA sebanyak 0,01 ml
pada intraperitonial. 1 minggu berikutnya dibooster dengan injeksi IFA sebanyak 0,03 ml
pada telapak ekstremitas belakang sebelah kiri.
Pembuatan Larutan Uji
Larutan uji yang digunakan adalah obat antiinflamasi yaitu Aspirin dan ekstrak daun
sirih merah. Dosis Aspirin yang diberikan berasal dari konversi dosis aspirin pada manusiay
aitu 5 mg/70 kg BB. Angka konversi dosis manusia ke mencit adalah 0,0026, sehingga dosis
aspirin yang diberikan untuk mencit adalah 5 x 0,0026 = 0,013 mg/g BB mencit.
Pembuatan ekstrak daun sirih merah dilakukan dengan metode perkolasi sebagai berikut:
1. 100 g daun sirih merah ditambahkan 500 ml etanol 70% yang selanjutnya dimasukkan ke
dalam perkulator untuk dilakukan ekstraksi.
2. Hasil ekstraksi dikeringkan dengan rotari evaporator sehingga didapatkan ekstrak semi
solid.
3. Diambil 0,5 g ekstrak dan ditambahkan dengan 10 ml aquabides untuk disentrifius dengan
kecepatan 1000 rpm dalam waktu 15 menit, sehingga akan diperoleh ekstrak daun sirih
merah sebanyak 0,1 g/ml.
Isolasi Organ Limfoid
Isolasi sel limfosit dilakukan dengan pembedahan setelah 21 hari perlakuan yaitu
sel limpa digerus dengan pangkal spuit diatas PBS sebagai filter. Homogenat yang
didapatkan dimasukkan kedalam tabung propilen 15 ml dan ditambahkan PBS yang
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm, pada suhu 40C, selama 5 menit
hingga didapatkan pelet kemudian disentrifugasi kembali hingga didapatkan pellet yang
merupakan sel limfosit
Perhitungan Sel CD4+
Suspensi pelet limfosit sebanyak 20μl ditambah 80μl tryphan blue dan dihitung
menggunakan haemocitometer untuk mendapatkan jumlah absolut sel. Perhitungan Jumlah
Sel T CD4+ Pelet limfosit diresuspensi dengan 50 µl antibodi (1:50) dalam PBS steril,
kemudian dipindah ke dalam kuvet dan dipasang pada nozzle flowcytometer (BD FACS
CaliburTM). Dilakukan setting pada komputer dengan software BD Cell Quest ProTM
dan dilakukan koneksi dengan flowsitometer (acquiring mode).
Analisis Statistika
Analisis data dilakukan dengan analisis non parametrik dengan uji Kruskal Wallis
dengan program SPSS 20 for Windows, hasil signifikan akan dilakukan Uji Games Howell
dengan taraf kepercayaan 95%.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil perhitungan jumlah sel CD4+ menunjukkan bahwa rerata jumlah sel CD4+ pada
mencit RA menunjukkan adanya perbedaan tidak signifikan pada masing–masing perlakuan.
Perlakuan yang diberi ekstrak daun sirih merah dosis 200 mg/g BB yaitu sebesar 14.068.150
sel/ml memiliki jumlah terendah dibandingkan dengan rerata jumlah sel CD4+ pada mencit
RA yang diberi perlakuan aspirin dan sirih merah dosis 100 mg/g BB. rerata jumlah sel
CD4+ pada mencit RA yang diberi perlakuan aspirin adalah 28.443.357 sel/ml dan rerata
jumlah sel CD4+ pada mencit RA yang diberi perlakuan sirih merah dosis 100 mg/g BB
sebesar 22.329.200 sel/ml. Jumlah sel CD4+ yang tertinggi adalah pada mencit RA yang
diberi perlakuan sirih merah dosis 400 mg/g BB sebesar 38.343.350 sel/ml, dimana jumlah
sel CD4+ ada mencit normal sebesar 23.001.675 sel/ml dan pada mencit RA tanpa diberi
terapi adalah sebesar 34.673.250 sel/ml.
Tabel 1. Rerata jumlah sel CD4+ pada setiap perlakuan.
Perlakuan
Rerata (sel/ml)
Normal
KK+
P1
P2
P3
23.001.675
34.673.250
28.443.357
22.329.200
14.068.150
38.343.350
Keterangan:
Normal :Tidak diberi perlakuan
K: Mencit RA
K+
: Aspirin
P1
: Sirih merah 100 mg/g BB
P2
: Sirih merah 200 mg/g BB
P3
: Sirih merah 400 mg/g BB
Adanya penurunan jumlah sel CD4+ yang diberi terapi ekstrak daun sirih merah
menunjukkan bahwa pada daun sirih merah menunjukkan aktivitas antioksidan yaitu
flavonoid. Winarsi (2007), menyatakan bahwa senyawa antioksidan akan mendonorkan satu
elektronnya kepada senyawa yang bersifat radikal bebas, sehingga akan mengurangi
jumlah radikal bebas dalam tubuh. Berkurangnya senyawa radikal bebas akan menyebabkan
berkurangnya stres oksidatif. Flavonoid sebagai antioksidan akan mengurangi dampak
negatif radikal bebas berlebih dengan cara mencegah terjadinya reaksi berantai
pembentukan radikal bebas, mengikat ion logam (chelating) dan menghambat peroksidasi
lipid (Djamali, 2007). Mekanisme kerja dari flavonoid sebagai antioksidan bisa secara
langsung maupun secara tidak langsung, secara langsung flavonoid akan mendonorkan ion
hidrogen dan bertindak sebagai scavenger (penangkap) radikal bebas sedangkan secara tidak
langsung adalah dengan meningkatkan ekspresi gen antioksidan endogen melalui beberapa
mekanisme (Sumardika dan Jawi, 2012) yang dapat meningkatkan jumlah dan aktivitas
antioksidan di dalam tubuh. Oleh sebab itu, diduga dengan adanya flavonoid yang berperan
sebagai antioksidan akan mengurangi jumlah radikal bebas, sehingga jumlah sel CD4+ akan
ikut berkurang. Berkurangnya jumlah sel CD4+ akan menyebabkan berkurangnya kadar
sitokin proinflamasi yang dihasilkan seperti TNFα, IL-1, IL-4, IL-5 danIL-10, dengan begitu
akan mengurangi inflamasi yang terjadi.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah sel CD4+ pada mencit RA yang diberi
ekstrak daun sirih merah dosis 200 mg/g BB, memiliki jumlah yang lebih rendah
dibandingkan dengan ekstrak sirih merah dosis 400 mg/g BB. Hal ini diduga karena
kandungan antioksidan yang ada pada kelompok sirih merah dosis 200 mg/g BB ini
merupakan dosis optimum sirih merah dalam menurunkan jumlah sel CD4+ pada RA. Pada
dosis 400 mg/g BB yang memiliki kandungan antioksidan yang lebih besar mengalami
kenaikan jumlah sel CD4+. Berdasarkan hasil penelitian Xiang (2011), menyatakan bahwa
pada jumlah yang optimum antoksidan akan mengurangi jumlah dan pembentukan radikal
bebas dalam tubuh. Sehingga, dalam jumlah optimum antioksidan akan mengurangi jumlah
radikal bebas dan menyebabkan berkurangnya jumlah CD4+. Oleh sebab itu sirih merah dosis
200 mg/kg BB diduga merupakan dosis optimum sirih merah dalam menurunkan jumlah sel
CD4+ pada RA karena memiliki jumlah sel CD4+ paling rendah dibandingkan dosis sirih
merah yang lainnya.
Pemberian ekstrak daun sirih merah pada dosis 400 mg/g BB pada mencit RA selama
3 minggu mengakibatkan meningkatnya jumlah sel CD4+ dan tidak menyebabkan
peningkatan ketebalan udem kaki, dimana berdasarkan penelitian Savitri (2015), pemberian
ekstrak daun sirih merah dosis 400 mg/g BB menurunkan ketebalan udem kaki mencit RA.
Hal ini diduga berhubungan dengan jumlah senyawa yang terkandung dalam sirih merah
dosis 400 mg/g BB yang menyebabkan reaksi hipersensitivitas tipe IV atau reaksi lambat
yang terjadi melalui CD4+ atau Delay Type Hypersensitivity (DTH) tipe IV, sehingga
meningkatkan jumlah sel CD4+. Pernyataan ini sesuai dengan pernyataan Baratawidjaja &
Rengganis (2009), yang menyatakan bahwa Delay Type Hypersensitivity (DTH) tipe IV
terjadi akibat adanya bahan yang tidak dapat disingkirkan dari rongga tubuh. DTH memiliki 2
fase yaitu fase sensitasi dan fase efektor. Fase sensitasi terjadi setelah 1-2 minggu kontak
pertama dengan bahan atau antigen, pada saat tersebut berbagai APC akan berikatan dengan
MHC II pada sel T sehingga mengakibatkan sel T teraktivasi umumnya dalah sel CD4+.
Adanya kontak berulang dengan bahan atau antigen akan menyebabkan terjadinya
fase efektor. Pada fase efektor sel Th1 yang merupakan deferensiasi dan poliferasi dari sel
CD4+ akan melepaskan berbagai sitokin seperti IFN-γ, IL-3, dan TNF-β yang mengaktifkan
makrofag untuk mensekresikan IL-1 dan TNF-α beserta IFN-γ dan TNF-β. Tersekresinya IL1 dan TNF-α beserta IFN-γ dan TNF-β akan memicu sel endotel untuk menginduksi monosit
dan sel non spesifik lainnya dalam sirkulasi untuk menempel pada molekul adhesi sel endotel
dan bergerak keluar dari vaskular menuju rongga jaringan dan memicu terjadinya inflamasi
dan kerusakan pada jaringan dimana bahan tersebut terakumulasi (Baratawidjaja &
Rengganis, 2009). Diduga terdapat senyawa yang terkandung pada ekstrak daun sirih merah
dosis 400 mg/g BB tidak dapat disingkirkan dari dalam rongga tubuh yang menyebabkan
teraktivasinya sel CD4+. Pemberian selamam 3 minggu diduga juga menyebabkan
meningkatnya jumlah sel CD4+ akibat semakin banyak bahan yang tidak disingkirkan
terakumulasi dalam rongga tubuh.
PENUTUP
Kesimpulan
1. Terdapat pengaruh pemberian ekstrak daun sirih merah terhadap jumlah sel CD4+ pada
mencit RA.
2. Terdapat kecenderungan jumlah sel CD4+ pada dosis 200 mg/g BB dalam menurunkan
jumlah sel CD4+ dibandingkan dengan ekstrak daun sirih merah dosis 100 mg/g BB,
sedangkan pada perlakuan sirih merah dosis 400 mg/g BB memiliki jumlah sel CD4+
tertinggi, yaitu dengan jumlah sel 38.343.350 sel/ml.
Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek sirih merah pada jumlah sel CD8
dan sitokin yang lain yang berperan dalam mekanisme anti inflamasi sehingga dapat
diketahui dengan pasti pengaruhnya sebagai antiinflamasi.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan jangka waktu lebih dari 3 minggu agar
diketahui pengaruh pemberian ekstrak daun sirih merah dalam jangka waktu yang lebih
lama.
3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai reaksi hipersensitivitas pada pemberian
ekstrak daun sirih merah pada RA sehingga dapat memberikan informasi mengenai dosis
esktrak daun sirih merah yang aman dan tidak menimbulkan reaksi hipersensitivitas saat
dikonsumsi.
DAFTAR RUJUKAN
Baratawidjaja, K.N, dan Rengganis, I. 2009. Imunologi Dasar Edisi ke 8. Jakarta: Balai
Penerbit FKUI
Djamali, A. 2007. Oxidative Stress as a Common Pathway to Chronic Tubulointersitial
Injury in Kidney Allograft. JournalPhysiol Renal. 293: F445-F455
Mandella, N.I. 2010. Ekspresi Tumor Necrosis Factor (TNF-α) dan Gambaran Histopatologi
Sendi Tikus Arthtritis (Rattus norvegicus) yang Mendapatkan Terapi Ekstrak Buah
Kesemek Junggo (Diospyroskaki L.f). Skripsi tidakditerbitkan. Malang: FKH UB
Mariana. 2015. Studi Kasus pada Keluarga Tn. D yang Mengalami Masalah Keperawatan
Perubahan Pemeliharaan Kesehatan dengan Diagnosa Medis Rheumathoid Arthritis di
Wilayah Kerja Puskesmas Sukorame Kota Kediri. Skripsi tidak diterbitkan. Universitas
PGRI: Kediri
Ria, S. 2011. Skrining Fitokimia dan Isolasi Senyawa Flavonoid dari Daun Sirih Merah
(Pipper porphyrophyllum N.E.Br). Skripsi tidak diterbitkan. Medan: Fakultas Farmasi
USUT.
Savitri, L. 2015. Pengaruh Pemberian Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap
Kadar Interlekukin I Beta (IL-1β) dan Ketebalan Udem Kaki Mencit (Mus musculs)
Galur Swiss Model Rheumatoid Arthritis. Skripsi tidak diterbitkan. Malang : FMIPA
UM.
Serlahwaty, D., Sugiastuti, S., Ningrum, R.C. 2011. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Air dan
Etanol 70% Daun Sirih Hijau (Piper betle L.) dan Sirih Merah (Piper cf. fragile Benth.)
dengan Metode perendaman Radikal Bebas DPPH. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia.
9(2): 143-146
Setiawan, A. 2013.Pengaruh Pemberian Ekstrak Air Buah Kesemek (Diospyros Kaki L.F.)
terhadap Kadar Interleukin 8 (IL8) dan Gambaran Histopatologi jaringan Sendi Tikus
(Rattus novergicus) Arthritis. Skripsi tidak diterbitkan. Malang : PKH UB
Sumardika, I.W. dan Jawi, I.M. 2012. Ekstrak Air Daun Ubi Jalar Ungu Memperbaiki
Profil Lipid dan Meningkatkan Kadar SOD Darah Tikus yang Diberi Makanan
Tinggi Kolesterol. Medicina. 43 : 67-71.
Wientarsih I, Madyastuti R, Prasetyo ,B.F, Firnanda D. 2012. GambaranSerumUreum,
dan Kreatinin pada Tikus Putih yang Diberi Fraksi Etil Asetat Daun Alpukat. Jurnal
Veteriner. 13(1): 57–62.
Wiralis. 2008. Pengaruh Pemberian Jus Jambu Biji (Psidium guajava L) terhadap Kadar Ion
Nitrit dan Gambaran Histopatologik Panus Sendi Adjuvant Induced Arthritis Tikus
Wistar. Tesis. Semarang: PPs Universitas Diponegoro.
Xiang, N.C., S.H. Wan, H.X. Yuan, B.G. Lin, B.J. Wen. 2011. Antioxidant Research of
Persimmon Extraction in Ionizing Radiatio Mice. Abstract. Journal Advanced
Materials Research: 343-344
Yulistiani, Bambang, S., Zulkarnain, & Joewono, S.2007. Identifikasi Drug Related Problem
pada Kasus Rheumatoid Arthritis Studi Di Instalasi Rawat Jalan Divisi Rheumatologi
Bagian Ilmu Penyakit Dalam RSU Dr. Soetomo Surabaya). Abstrak. (online)
(http://elib.pdii.lipi.go.id/katalog/indeks.php/searchkatalog/byld/55263)
Agustus 2015
Diakses
11