metodologi penelitian

METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dimulai pada bulan Mei sampai Agustus 2011 di
Laboratorium Fisiologi, Bagian Fisiologi dan Farmakologi Departemen Anatomi,
Fisiologi, dan Farmakologi dan di Unit Reproduksi dan Rehabilitasi (URR)
Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi Fakultas Kedokteran HewanInstitut Pertanian Bogor.
Materi Penelitian
Hewan Coba
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah empat ekor
kerbau lumpur (Bubalus bubalis) betina berumur 2 sampai 2,5 tahun.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah syringe/spuit steril, jarum
ukuran 18G, tabung darah, gelas objek, gelas penutup, kamar hitung
(hemocytometer), pipet leukosit, label, mikroskop, dan counter. Bahan yang
digunakan adalah darah, antikoagulan Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
(EDTA), tissue, alkohol 70%, kapas, methanol, minyak emersi, pewarna Giemsa
10%, dan larutan Turk.
Metode Penelitian
Tahap Persiapan
Kerbau lumpur diadaptasikan selama dua minggu sebelum dilakukan
pengambilan sampel darah. Masing-masing kerbau dipelihara di dalam kandang
berukuran 2x2,5 meter, diberi pakan rumput dan air minum ad libitum. Kerbau
juga diberi obat cacing albendazol dan diberi vitamin B-kompleks untuk menjaga
kondisi kerbau agar tetap optimal.
Pengambilan Darah Kerbau
Pengambilan darah kerbau dilakukan setiap dua hari sekali pada pagi hari
pukul 07.00 WIB di URR. Darah diambil menggunakan spuit steril dan jarum
ukuran 18G melalui vena jugularis yang terletak di lateral leher (Sulong et al.
1980) yang telah dibersihkan dengan kapas yang diberi alkohol 70%. Jumlah
darah yang diambil sebanyak 2 ml dan dimasukkan ke tabung yang telah diberi
EDTA, lalu dihomogenkan. Tabung darah disimpan di dalam
cool box dan
dibawa ke laboratorium untuk dihitung jumlah leukosit.
Penghitungan Jumlah Leukosit
Darah pada tabung yang telah dicampur dengan EDTA dihisap dengan
pipet hingga tanda 0,5 dan ujung pipet dibersihkan dengan tissue. Kemudian hisap
larutan Turk dengan pipet yang sama hingga mencapai batas angka 11. Pipet
kemudian dikocok kurang lebih selama tiga menit hingga homogen. Selanjutnya,
buang dua atau tiga tetes larutan sebelum dimasukkan ke kamar hitung. Larutan
yang telah dimasukkan ke kamar hitung ditunggu selama satu menit, setelah itu
leukosit dihitung menggunakan perbesaran 10 kali atau 40 kali pada lensa
objektif. Leukosit yang dihitung adalah leukosit yang terdapat pada empat sudut
kamar hitung bertuliskan huruf W yang masing masing memiliki 16 kotak kecil
yang dapat dilihat pada Gambar 6. Rumus perhitungan jumlah leukosit adalah:
Gambar 6 Kamar hitung (hemocytometer) (McCurnin & Bassert 2006).
Pembuatan Preparat Ulas Darah dan Diferensial Leukosit
Pembuatan preparat ulas langsung dilakukan di tempat pengambilan darah
yaitu di URR. Pertama-tama, dipersiapkan dua gelas objek. Darah segar yang
terdapat pada spuit diteteskan di bagian ujung gelas objek pertama dengan posisi
permukaan datar. Lalu, ujung gelas objek kedua disentuhkan pada bagian gelas
objek pertama yang ditetesi darah tersebut. Darah akan menyebar ke sisi bagian
ujung gelas objek kedua, kemudian posisikan gelas objek kedua agar membentuk
sudut 30-45o terhadap gelas objek pertama. Gelas objek kedua didorong di atas
permukaan gelas objek pertama agar darah dapat menyebar ke permukaan secara
rata dan membentuk lapisan tipis (Samuelson 2007). Ulas darah tidak boleh
terlalu tebal karena sel darah akan terlihat sangat padat, sehingga sulit dalam
menghitung dan membedakan leukosit. preparat dibiarkan mengering di udara
terbuka.
Preparat yang telah kering segera difiksasi menggunakan metil alkohol
(methanol) selama 3-5 menit, setelah itu diambil dan dikeringkan kembali di
udara. Setelah kering, preparat diwarnai dengan Giemsa 10% selama 30 menit.
Preparat yang telah diwarnai segera dicuci dengan air dan dibiarkan mengering.
Penghitungan persentase jenis leukosit dilakukan dengan perbesaran lensa objektif
100 kali, dengan beberapa lapangan pandang hingga jumlah total leukosit yang
ditemukan mencapai 100 leukosit. Penggunaan lensa objektif dengan perbesaran
100 kali harus menggunakan minyak emersi dan dibersihkan dengan xylol.
Penghitungan jumlah absolut dari masing-masing jenis leukosit dihitung dengan
rumus:
Analisis Data
Jumlah total leukosit dan jenis-jenis leukosit akan dihitung rataan dan
simpangan baku, selanjutnya dianalisis secara deskriptif.