Untitled - Research Report - Universitas Muhammadiyah Malang
advertisement
i Penerbit Universitas Muhammadiyah Malang i ii PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Hak Cipta © Elfi Anis Saati, Rokhmatul Asiyah, M. Ariesandy, 2016 Hak Terbit pada UMM Press Penerbit Universitas Muhammadiyah Malang Jl. Raya Tlogomas No. 246 Malang 65144 Telepon (0341) 464318 Psw. 140, (0341) 7059981 Fax. (0341) 460435 E-mail: [email protected] http://ummpress.umm.ac.id Anggota APPTI (Asosiasi Penerbit Perguruan Tinggi Indonesia) Cetakan Pertama, Agustus 2016 ISBN : 978-979-796-128-2 xii; 89 hlm.; 16 x 23 cm Setting Layout: Septian R. Cover: A.H. Riyantono Hak cipta dilindungi undang-undang. Dilarang memperbanyak karya tulis ini dalam bentuk dan dengan cara apapun, termasuk fotokopi, tanpa izin tertulis dari penerbit. Pengutipan harap menyebutkan sumbernya. iii Sanksi Pelanggaran pasal 72: Undang-undang No. 19 Tahun 2002, Tentang Hak Cipta: 1. Barang siapa dengan sengaja dan tanpa hak melakukan perbuatan sebagaimana dimaksud dalam Pasal 2 ayat (1) atau Pasal 49 ayat (1) dan ayat (2) dipidana dengan pidana penjara masing-masing paling singkat 1 (satu) bulan dan/atau denda paling sedikit Rp. 1.000.000,00 (Satu Juta Rupiah), atau pidana penjara paling lama 7 (tujuh) tahun dan/atau denda paling banyak Rp. 5.000.000.000,00 (Lima Miliar Rupiah). 2. Barang siapa dengan sengaja menyiarkan, memamerkan, mengedarkan, atau menjual kepada umum suatu ciptaan atau barang hasil pelanggaran Hak Cipta atau Hak Terkait sebagaimana dimaksud pada ayat (1) dipidana dengan pidana penjara paling lama 5 (lima) tahun dan/atau denda paling banyak Rp. 500.000.000,00 (lima ratus juta rupiah). iv PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI v KATA PENGANTAR Pewarna non-pangan yang masih banyak (11,31%) digunakan dan beredar di pasaran seperti Rhodamin B, Methanyl yellow dan Amaranth, serta sebanyak 44% makanan jajanan di sekolah dinyatakan tidak aman konsumsi, dikhawatirkan dapat membahayakan kesehatan dan kecerdasan generasi bangsa. Gerakan back to nature kian merambah penggunaan bahan alam sebagai bahan aditif termasuk zat pewarna alami. Kepentingan industri pewarna alami makanan menggantikan pewarna sintetis telah meningkat secara signifikan selama tahun-tahun terakhir, terutama disebabkan oleh masalah keamanan pangan. Jenis pewarna yang potensial untuk dikembangkan adalah pigmen sebagai sumber zat pewarna alami. Pentingnya akseptabilitas warna produk dan kebutuhan untuk menarik lebih banyak konsumen telah menghasilkan perkembangan pigmen baru untuk diaplikasikan pada produk industri. Pigmen seringkali dapat diperoleh dari semua bagian/organ tanaman diantaranya bunga, buah, umbi, daun dan akar. Pigmen yang seringkali ditemukan dalam bunga (floral) antara lain flavonoid, karotenoid dan betalain, dan jenis pigmen flavonoid (termasuk antosianin) merupakan pigmen yang paling banyak ditemukan dan tersebar luas di alam, padahal negara Indonesia mempunyai kekayaan hayati yang amat melimpah oleh karenanya punya potensi besar menggantikan pewarna berbahaya tersebut. Antosianin adalah senyawa pigmen yang bersifat amfoter, penyumbang warna merah, merah muda, ungu dan biru. Sifat mudah larutnya v vi PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI kedalam air menjadikan pigmen antosianin sebagai bahan alam yang banyak digunakan untuk dikonsumsi karena mudah diserap oleh tubuh, dan memiliki kemampuan menangkap radikal bebas dan aktivitas antioksidan yang tinggi serta menunjukkan efek penghambatan terhadap pertumbuhan beberapa sel kanker. Di luar negeri produk perwarna alami yang memiliki stabilitas tinggi dapat digunakan dalam berbagai aplikasi termasuk minuman, makanan, obat-obatan, suplemen diet, kosmetik, barang kerajinan maupun pakan ternak. Oleh karena hayati lokal kita amatlah beragam, maka buku ini bermaksud memberi gambaran tentang eksplorasi pigmen antosianin yang menggembirakan. Diantaraya bunga turi, mawar, kana merah terbukti aman dikonsumsi dan efektif menyumbang warna alami produk pangan seperti sari buah, sirup, saos (Saati dkk., 2007,2008) serta dapat berperan menjadi protektor hati dan ginjal (Saati, 2012). Lebih detail dijelaskan bagaimana metode isolasi dan identifikasi yang tepat guna memperoleh informasi jenis pigmen antosianin. Mengenalkan dan meningkatkan kesadaran masyarakat terhadap keamanan pangan serta mengetahui kekayaan hayati potensial agar dapat digunakan sebagai bahan aditif alami. Sesuai target kedaulatan Pangan dari UU Pangan no 18 tahun 2012 adalah memberikan hak bagi masyarakat untuk menentukan sistem Pangan yang sesuai dengan potensi sumber daya lokal. Sekaligus ingin mengetahui lebih dalam tentang khasiat madu pada surat An Nahl ayat 69. "Kemudian makanlah dari tiap-tiap (macam) buah-buahan dan tempuhlah jalan Tuhanmu yang telah dimudahkan (bagimu). Dari perut lebah itu keluar minuman yang bermacam-macam warnanya, di dalamnya terdapat obat menyembuhkan bagi manusia. Sesungguhnya pada yang demikian itu benar-benar terdapat tanda kebesaran Tuhan bagi orang yang memikirkan." [QS. An-Nahl : 69]. Di situ dijelaskan bahwa madu (merupakan minuman yang bermacam warnanya) adalah merupakan kumpulan pigmen. Ucapan terimakasih kepada DPPM DIKTI, DPPM-UMM dan semua pihak yang telah membantu pelaksanaan penelitian terkait identifikasi pigmen antosianin dan mafaatnya. Semoga tulisan ini dapat memberikan manfaat yang luas. Malang, April 2016 vii DAFTAR ISI KATA PENGANTAR ................................................................................ v DAFTAR ISI ............................................................................................... vii DAFTAR TABEL ........................................................................................ ix DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xi BAB 1 FUNGSI PIGMEN SEBAGAI ZAT PEWARNA ALAMI PLUS ............................................................................................. 1 A. Fungsi Pigmen sebagai Zat Pewarna dan Antioksidan Alami pada Produk Industri ............................................ 3 BAB 2 POTENSI BAHAN ALAM SEBAGAI SUMBER ZAT PEWARNA DAN ANTIOKSIDAN ALAMI ......................... 7 A. Prospektif Penggunaan Bahan Alam .............................. 9 B. Pigmen Antosianin dan Kegunaannya .......................... 10 C. Fungsi Pigmen sebagai Zat Pewarna dan Antioksidan Alami ..................................................................................... 14 BAB 3 TEKNIK ISOLASI DAN IDENTIFIKASI PIGMEN ANTOSIANIN ............................................................................ 17 A. Metode Spektrofotometri ................................................... 18 B. Metode Kromatografi dan KLT (Kormatografi Lapis Tipis) ..................................................................................... vii 19 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI viii C. Metode Fourier Transform Infrared (FTIR) ....................... 21 D. Metode HPLC (High performance liquid chromatography) ... 22 E. Metode LCMS (Liquid chromatography-mass spectrometry) ... 24 F. Metode NMR (Nuclear magnetic resonance) .................... 25 BAB 4 HASIL IDENTIFIKASI PIGMEN ANTOSIANIN BUNGA MAWAR ....................................................................................... 29 A. Pelarut Ekstraksi ................................................................. 31 B. Hasil Isolasi dan Identifikasi Pigmen Antosianin ....... 37 C. Pengujian Pigmen Antosianin sebagai Pewarna Alami Produk................................................................................... 67 D. Pengujian Fungsional Pigmen sebagai Antioksidan Alami, Melalui SGOT dan SGPT .................................................. 69 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 75 LAMPIRAN ................................................................................................ 87 ix DAFTAR TABEL Tabel 1 Perubahan pH dan Warna Antosianin ................................ 13 Tabel 2 Harga Rf Antosianidin dengan Beberapa Fase Gerak/ Mobil ........................................................................................... 20 Nilai Waktu Retensi HPLC dan Bobot Massa Antosianin dalam Ekstrak ........................................................................... 23 Bobot Massa dari Beberapa Antosianidin, Gula dan Gugus Asilasi pada Antosianin .......................................................... 26 Nilai Rerata Kadar Air, Kadar Gula Total, Vitamin C dan Minyak Atsiri MBM Merah ................................................... 37 Nilai Rerata Kadar Air, pH, Absorbansi, Total Padatan Terlarut Pigmen Bubuk dari Ekstrak MBM ....................... 39 Nilai Rerata Intensitas Warna (Kecerahan, Kemerahan, Kekuningan) Bubuk Pigmen Lokal Batu, Hibrid Holand .. 40 Peak Absorbansi Pita I - II Filtrat Pigmen Bunga Mawar Lokal Batu Hasil Ektraksi dengan Beragam Pelarut ........ 43 Rerata Kadar dan Rendemen Pigmen Bunga Mawar Lokal Batu Akibat Beragam Pelarut Ekstraksi .............................. 44 Tabel 10 Nilai Absorbansi, Rf, Perubahan Warna Akibat Respon Pemanasan serta Penambahan NaOH Terhadap Ekstrak Pigmen Antosianin dalam MBM Lokal Batu ..................... 46 Tabel 11a Penentuan Jenis Pigmen Antosianin Berdasarkan Nilai Rf Analisa KLT ......................................................................... 51 Tabel 3 Tabel 4 Tabel 5 Tabel 6 Tabel 7 Tabel 8 Tabel 9 ix x PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Tabel 11b Nilai Rf Analisa KLT (F 254) Glikon Hasil Fraksinasi Kolom C18. ................................................................................. 52 Tabel 12 Gugus Fungsi di Daerah Peak (Pita) Spektrum Infra Merah pada Pigmen MBM Lokal Batu ............................................ 54 Tabel 13 Sebaran Ion Bobot Molekul Pigmen Antosianin MBM Lokal Batu Analisa LCMS ...................................................... 60 Tabel 14 Penentuan Jenis Pigmen Antosianin MBM Lokal Batu Metode NMR 1H ..................................................................... 64 Tabel 15 Rerata Tingkat Kecerahan (L) dan Kemerahan (a+) Bubuk Ekstrak Mawar Merah pada Perlakuan Potong Bunga Mawar ........................................................................................ 67 Tabel 16 Nilai pH Beberapa Produk Industri Tang Berpotensi untuk Disumbang Warna Alami dari Pigmen Antosianin Bunga Mawar Merah .............................................................. 68 Tabel 17 Nilai Intensitas Warna Beberapa Produk Industri Hasil Aplikasi Pigmen Antiosianin 3,5% ....................................... 69 Tabel 18 Daya Antioksidan Pigmen MBM Hasil Beragam Pelarut Ekstraksi ..................................................................................... 70 Tabel 19 Hasil Analisa Statistik Uji SGPT dan SGOT Tiga Dosis Pemberian Tablet Dibandingkan dengan Kontrol dan Pemberian CCl4. ....................................................................... 71 xi DAFTAR GAMBAR Gambar 1 Struktur Molekul Antosianin .......................................... 11 Gambar 2 Beberapa Jenis Glikon yang Lepas Ikatan Aglikon ... 11 Gambar 3 Contoh Struktur Molekul Antosianin yang Lengkap .. 11 Gambar 4 Contoh Hasil Analisa Antosianin (Sorghum Hitam) Berdasarkan Masa Tenggatnya (Ritention Time) ......... 24 Penentuan Struktur Molekul Sianidin Berdasarkan Analisa NMR1H ................................................................. 27 Gambar 5b Struktur Molekul Pigmen Antosianin dengan Asilasi ... 27 Gambar 5a Gambar 6 Gambar 7 Perbedaan Mahkota dan Warna Bunga Lokal Batu dan Hibrid .................................................................................. 41 Grafik Sebaran Nilai Absorbansi Glikon (P1) Aglikon (P2) Mawar Akibat Beragam Pelarut Ekstraksi .......... 43 o Pemanasan pada suhu 80-100 C 5 menit, dengan 2M HCl ....................................................................................... 47 Gambar 8b Penambahan 2M NaOH .................................................. 47 Gambar 9a Nilai Rf Hasil Pengamatan KLT Antosianin ............... 50 Gambar 9b Nilai Rf Hasil Pengamatan KLT Glikon, Jenis Gula yang Diikat Antosianidin ................................................. 50 Gambar 8a Gambar 10 Pigmen Hasil Evaporasi Pigmen dan Isolat Hasil Fraksinasi dengan Kolom C18 Bunga Mawar Lokal Batu ...................................................................................... xi 50 xii Gambar 11 Gambar 12 Gambar 13 Gambar 14 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Struktur Molekul Antosinidin yang Berbeda Gugus Fungsi pada Cincin B ....................................................... 55 Analisa FTIR Bahan Sample Hasil Ekstrak Kasar Pigmen MBM ..................................................................... 55 Sebaran Waktu Tambat Pigmen Standar dan Pigmen MBM Lokal Batu ............................................................... 57 Waktu Tenggat Munculnya Pigmen Antosianin Fraksi I (3,4 menit) dan II (3,9 menit) Hasil Fraksinasi C18. ... 59 Sebaran Peak Dominan Bobot Molekul Pigmen Sianidin Hasil Analisa LCMS ......................................................... 61 Gambar 16a Malvidin-glukosida (M1, M2a-b-c) dan PelargonidinGlukosida ............................................................................ 62 Gambar 16b Analisa LCMS Antosianin ............................................... 62 Gambar 15 Gambar 17a Sebaran Signal Molekul Aglikon (Antosianidin) Jenis Malvidin .............................................................................. 63 Gambar 17b Sebaran Signal Molekul Glikon ...................................... 63 Gambar 18 Komponen Penyusun Malvidin-3-p-coumarilrutino sida-5-glukosida ................................................................. 66 Grafik Efek Pemberian Tablet Effervescent pada Tikus Terhadap Nilai SGPT dan SGOT .................................. 73 Aplikasi Pigmen Antosianin pada Beberapa Produk Pangan ................................................................................. 87 Bubuk Pigmen (A) dan Tablet Effervescent (B) dari Pigmen MBM Lokal Batu ................................................ 87 Gambar 22 Tahapan Pengujian SGPT & SGOT pada Tikus ......... 88 Gambar 23 Pengamatan Frekuensi Gelombang Gugus Fungsi Pigmen MBM (fraksi I, II, ekstrak, & bubuk pigmen) Analisa FTIR ...................................................................... 89 Gambar 19 Gambar 20 Gambar 21 Fungsi Pigmen Sebagai Zat Pewarna Alami Plus 1 Bab 1 FUNGSI PIGMEN SEBAGAI ZAT PEWARNA ALAMI PLUS K epentingan industri pewarna alami menggantikan pewarna sintetis telah meningkat secara signifikan selama beberapa tahun terakhir, terutama disebabkan oleh masalah keamanan pangan. Zat pewarna alami dapat dikembangkan dari pigmen flavonoid khususnya antosianin, yang diperoleh dari jaringan-jaringan tanaman yang ada di sekitar kita. Ada yang terdapat dalam jaringan buah, bunga, daun, batang maupun akar dari kelompok tanaman buah, sayuran maupun bunga (Nollet, 1996). Negara kita mempunyai kekayaan hayati melimpah, oleh karena itu amat diperlukan upaya penggalian potensinya (Taslan, 2005). Mawar (Rosa sp.) merupakan salah satu bunga potong yang banyak diminati masyarakat, yang seringkali digunakan pada acara formal maupun non formal. Dibalik keelokan warna bunga mawar, pigmen antosianin yang dikandungnya diharapkan dapat memberikan harapan sebagai zat pewarna alami yang menyumbangkan pengganti pewarna berbahaya tersebut. Apabila jenis pigmen yang terkandung dalam mahkota bunga mawar merah ini dapat diketahui, maka dapat ditemukan sumber pigmen alternatif yang ketersediaannya banyak di sekitar kita. Secara konseptual, metode ekstraksi, isolasi dan identifikasi yang tepat akan dapat menghasilkan kualitas pigmen yang maksimal dan stabil serta informasi yang lebih lengkap terkait komponen penyusun pigmen antosianin tersebut. Pigmen antosianin lebih stabil diekstraksi 1 2 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI menggunakan pelarut air atau alkohol yang diasamkan (Li, 2009; Barzack, 2005; Gizir, 2007). Beberapa jenis asam yang dapat digunakan antara lain HCl, asam sitrat, asam laktat, asam sulfat, namun belum dilaporkan jenis asam manakah yang paling efektif digunakan untuk mengekstraksi pigmen antosianin, khususnya pigmen dalam MBM lokal Batu. Metode ekstraksi, isolasi dan purifikasi yang tepat guna memperoleh informasi jenis pigmen antosianin MBM lokal Batu, yaitu dengan melaksanakan uji kualitatif dan uji kuantitatif meliputi analisa Kromatografi (KLT, FT-IR dan HPLC) serta guna menunjang kevalidan penentuan massa molekul senyawa dilaksanakan juga analisa LC-MS dan menentukan struktur molekul jenis pigmen antosianin yang dikandungnya menggunakan analisa NMR. Permasalahan yang seringkali timbul dalam melakukan aplikasi pigmen khususnya pigmen antosianin ini adalah stabilitasnya terhadap pengaruh aspek suhu, cahaya, nilai pH, oksidasi, enzim dan keberadaan logam serta senyawa lainnya. Stabilitas warna antosianin dapat dipertahankan atau ditingkatkan dengan reaksi kopigmentasi. Antosianin umumnya lebih stabil pada larutan asam, dan stuktur dominan antosianin berada dalam bentuk inti kation flavium yang terprotonisasi dan kekurangan elektron. Dalam upaya meningkatkan stabilitasnya tersebut pigmen antosianin MBM lokal Batu dilakukan optimasi pH, sebelum dilakukan penambahan kopigmen. Kopigmen yang diujikan adalah komponen anion (pembawa gugus nitrat, sulfit, posfat dan fenol) dan aditif alami, yang seringkali digunakan dalam pengolahan pangan (sukrosa, garam NaCl dana asam sitrat) agar diketahui kemanfaatan penggunaannya menjadi lebih luas. Sifat mudah larutnya ke dalam air menjadikan pigmen antosianin sebagai senyawa kimia yang banyak digunakan untuk dikonsumsi. Dalam upaya meningkatkan potensi pigmen antosianin bunga mawar perlu dilakukan uji efektivitas / aplikasinya pada produk pangan maupun suplemen. Hal ini disebabkan karena mudah diserapnya pigmen antosianin oleh tubuh, juga ditemukan bersifat sinergis dengan asam sitrat (Saati dkk, 2009, didukung pendaftaran Paten di DIRJEN HAKI No. P0000700579) dan gula (sebagai kesesuaian komponen glikon pada antosianin) (Eskin, 1979; Rein, 2005), serta sebagai antioksidan dan berpotensi digunakan sebagai bahan baku pangan fungsional seperti tablet effervescent (Saati, 2009; Pendaftaran Paten No P00200900698). Ke Fungsi Pigmen Sebagai Zat Pewarna Alami Plus 3 depan diharapkan dapat diaplikasikan untuk produk kesehatan, misalnya untuk obat mengurangi resiko penyakit jantung, kanker, hyperlipidemias dan penyakit kronis lainnya seperti penyakit diabetes dan stroke. Dalam buku ini ditampilkan hasil pengujian SGPT-SGOT ekstrak, isolat pigmen dan tablet effervescent pada tikus. Di negara maju penggunaan zat pewarna alami pada produk makanan sudah digalakkan, produk perwarna alami yang dapat digunakan dalam berbagai aplikasi termasuk minuman, makanan, obatobatan, suplemen diet, kosmetik, barang kerajinan maupun pakan ternak (US Patent No. 20090246343, Wu et. al, 2008). Dengan demikian hasil penelitian ini diharapkan dapat dimanfaatkan bagi pengembangan potensi bunga mawar sebagai zat pewarna alami dan bioaktif (antioksidan) pada beberapa produk industri, agar meningkatkan dayagunanya serta turut mendukung pemberdayaan kekayaan hayati lokal untuk memperbanyak persediaan pangan sehat dan menambah pendapatan masyarakat. A. Fungsi Pigmen sebagai Zat Pewarna dan Antioksidan Alami pada Produk Industri Menurut Henry dan Houghton (1996), bahwa warna yang ditambahkan pada makanan karena mempunyai tujuan antara lain: mempertegas warna yang telah ada pada produk makanan, meyakinkan keseragaman warna makanan dari tahap ke tahap, mempertahankan penampakan asli makanan dan untuk memberi warna dengan sengaja pada makanan. Menurut Fardiaz, dkk (1987), bila dibandingkan dengan pewarna-pewarna sintetis, penggunaan warna alami mempunyai keterbatasan antara lain: (1) seringkali memberikan rasa dan flavor khas yang diinginkan, (2) konsentrasi yang rendah, (3) stabilitas pigmen yang rendah, (4) keseragaman warna yang kurang baik, dan (5) spektrum warna yang tidak seluas seperti pewarna sintetis. Pigmen antosianin adalah pewarna alami penyebab warna merah, oranye, ungu dan biru, banyak terdapat pada bunga seperti bunga krisan, pelargonium, aster cina (Lewis et al., 1997) dan buah-buahan (buah apel, chery, anggur, strawberi (Harborne, 1987, De Man, 1989, Nollet, 1996), juga terdapat pada buah mangsi (Irawati, 2002). Menurut Henry dan Houghton (1996), ada beberapa faktor yang berhubungan dengan aplikasi pewarna terhadap produk, harus 4 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI dipertimbangkan dalam proses pembuatannya, yaitu antara lain: (i) Kelarutan pigmen, yaitu antosianin larut dalam air, sedangkan kurkumin, klorofil dan xantofil larut dalam minyak atau lemak, (ii) Bentuk kimia, yaitu pewarna tersedia dalam bentuk antara lain ekstrak, bubuk, pasta, dan konsentrat. Penentuan pemakaian bentuk pewarna sangat penting untuk mengetahui bahwa warna akan berubah jika pigmen rusak selama prossesing. Peningkatan suhu sering sekali menyebabkan rusaknya struktur pigmen yang menyebabkan perubahan warna. (iii) Tingkat kesamaan (pH), pewarna makanan yang dalam air (terutama yang berbentuk cairan) dibuat dengan pH maksimum. Penambahan larutan buffer ke dalam produk akan berubah pH larutan, dan (iv) Bahan tambahan lain. Sebagai acuan syarat kesehatan digunakan syarat mutu air untuk industri hasil pertanian pangan atau air minum, di antaranya kandungan Cl (cloride) maksimum 250 mg/l, dengan kandungan phenol (phenolik) maksimal 0,002 mg/l, kandungan maksimal untuk unsur berbahaya seperti Fe, Mn, Pb, dan Cu, masing - masing sebesar 0,2; 0,1; 0,5 dan 3,0 mg/l (Susanto dan Saneto, 1994). Radikal bebas yaitu suatu molekul beroksigen (mengandung O) dengan atom yang pada orbit terluarnya memiliki elektron yang tidak berpasangan. Karena tidak berpasangan tersebut maka molekul tersebut menjadi tidak stabil. Senyawa bioaktif seperti pigmen flavonoid, atau antosianin merupakan suatu molekul yang bersifat sebagai antioksidan, yaitu merupakan zat yang anti terhadap zat lain yang bekerja sebagai oksidan. Antioksidan mempunyai peran yang penting dalam membantu mencegah kerusakan sel-sel sehat akibat adanya radikal bebas tersebut. Pigmen flavonoid, khususnya antosianin tidak hanya berperan dalam menyumbangkan warna alami pada makanan, minuman, obat-obatan dan kosmetik, bahkan menurut Soni and Maria (2007), bahwa sejumlah penelitian menunjukkan dampak potensial kelompok flavonoid antara lain mengurangi resiko penyakit jantung, kanker, hyperlipidemias dan penyakit kronis lainnya melalui asupan makanan kaya antosianin. Pada penelitian dan paten yang terdahulu, senyawa antioksidan yang telah diketahui diperoleh dari ekstrak / juice nanas, dari Paten USPTO No. 6224926 ( 23 Agustus 1999) oleh Ronald E. Wrolslad and Ling Wen digunakan sebagai anti-browning. Berbagai metode pengujian aktivitas antioksidan telah digunakan untuk meneliti dan membandingkan Fungsi Pigmen Sebagai Zat Pewarna Alami Plus 5 aktivitas antioksidan dalam makanan. Aktivitas antioksidan menggunakan metode penangkapan radikal bebas dapat dilakukan dengan cepat, mudah dan sederhana. Metode DPPH (2,2-Diphrnyl-2picrylhydrazyl) digunakan untuk mengetahui kemampuan zat antioksidan untuk menangkap radikal bebas (Hatano et al, 1998). Radikal 2,2Diphrnyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) adalah radikal bebas stabil yang menerima sebuah elektron atau hidrogen untuk diubah menjadi molekul diamagnetik. DPPH banyak digunakan pada sistem penelitian aktivitas penangkapan radikal pada senyawa alami tumbuhan. Aktivitas antiradikal ditandai dengan perubahan warna larutan dari ungu menjadi kuning bening dengan penurunan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm (Soares et al, 1997). 6 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Potensi Bahan Alam Sebagai Sumber Zat Pewarna dan Antioksidan Alami 7 Bab 2 POTENSI BAHAN ALAM SEBAGAI SUMBER ZAT PEWARNA DAN ANTIOKSIDAN ALAMI W arna di dalam bahan pangan merupakan salah satu faktor yang penting dalam kualitas bahan pangan tersebut, disamping tekstur, rasa dan atribut sensori lainnya (Joshi dan Brimelow, 2002). Pewarna dalam produk pangan umumnya bertujuan: (1) memperbaiki penampakan makanan yang memudar akibat pengolahan; (2) memperoleh warna yang seragam pada komoditi yang warna alamiahnya tidak seragam; (3) memperoleh warna yang lebih baik daripada warna aslinya; (4) melindungi vitamin dan flavor yang peka terhadap cahaya selama penyimpanan; (5) sebagai identitas produk dan (6) indikator visual dari kualitas (Hendry, 1996; Francis, 2002). Warna yang tampak pada makanan dikarenakan dua hal, yaitu penambahan pewarna sintetis dan karena adanya pigmen alami atau tanpa tambahan bahan dari luar. Dalam Undang-undang Pangan RI Nomor 7 Tahun 1996, keamanan pangan didefinisikan sebagai kondisi dan upaya yang diperlukan untuk mencegah pangan dari kemungkinan cemaran biologis, kimia dan benda lain yang dapat mengganggu, merugikan dan membahayakan kesehatan manusia. Keamanan pangan ini berkaitan erat dengan sanitasi pangan, bahan tambahan makanan, rekayasa genetika dan iradiasi pangan, kemasan pangan, jaminan mutu pangan dan pemeriksaaan laboratorium serta pangan tercemar (Depkes RI, 2000). 7 8 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Padahal kenyataan di Indonesia, dalam melakukan bisnisnya produsen makanan masih banyak menggunakan bahan tambahan makanan (food additive) yang kurang terpantau baik dalam ketepatan bahan yang digunakan maupun dosis yang digunakan, diantaranya adalah zat pewarna seperti laporan hasil survey BPOM Tahun 2006. Padahal produk perwarna alami yang memiliki kestabilan sangat baik dapat digunakan dalam berbagai aplikasi termasuk minuman, makanan, obat-obatan, suplemen diet, kosmetik, barang kerajinan maupun pakan ternak (US Patent No. 20090246343, Wu et. al, 2009). Dari penelitian yang telah dilakukan menunjukkan banyak komoditas hortikultura (buah-buahan, sayuran dan bunga) selain sarat mengandung vitamin dan mineral juga mengandung senyawa non-gizi yang ternyata manfaatnya besar bagi kesehatan. Komponen non-gizi yang dimaksud adalah serat, bioaktif, dan lain-lain. Dari penelitian yang telah dilakukan terungkap bahwa komponen bioaktif dapat menetralkan racun obat dan zat karsinogen dengan jalan menetralkan radikal bebas, menghambat enzim yang mengaktifkan karsinogen sekaligus merangsang enzim yang menetralkan zat karsinogen. Di negara maju penggunaan zat pewarna makanan dilakukan dengan sangat hati-hati, sedangkan di negara berkembang termasuk negara kita, pengawasan pewarna makanan sintetis yang berbahaya masih sulit dilakukan (Nugrahaningsih, 2002). Zat pewarna sintetis ada kecenderungan disalah- gunakan pemakaiannya, misalnya akhir-akhir ini disinyalir (diberitakan dalam media massa, cetak) banyak makanan dan minuman yang beredar mengandung pewarna yang bukan pewarna makanan (tetapi untuk tekstil dan kulit) dan mengandung pewarna makanan yang sudah dilarang digunakan dan dinyatakan sebagai bahan berbahaya. Apalagi Badan Pengkajian Pengawas Obat dan Makanan MUI mengindikasikan bahwa masih banyak produk makanan, obat dan kosmetik yang beredar di negara kita, diproduksi dengan proses yang dikategorikan haram. Residu penggunaan alkohol pada suatu proses produksi disarankan POM MUI tidak boleh melebihi kadar 1%. Menurut fatwa MUI terbaru dinyatakan bahwa minuman olahan dengan kadar etanol kurang dari 1 % bukanlah khomr tetapi haram dikonsumsi (Yaqin, BP-POM MUI Jatim, 2006). Hasil penelitian Ghorpade dalam Maga (1994) menunjukkan bahwa warna hijau dari F.D dan C. Green Indigocarmine (contoh pewarna sintetis) Potensi Bahan Alam Sebagai Sumber Zat Pewarna dan Antioksidan Alami 9 dapat meracuni sel sumsum tulang. Tartarin, pewarna kuning sintetis dapat menimbulkan reaksi gatal-gatal, asma dan sebagainya (Darmansjah, 1995). Penggunaan antioksidan sintetik dalam waktu lama dan dosis yang berlebihan dapat menyebabkan karsinogenik maupun kanker, maka diperlukan pemanfaatan bahan alami dengan harapan lebih aman untuk digunakan pada berbagai produk makanan (Giese, 1996). A. Prospektif Penggunaan Bahan Alam Menurut Jenie et al. (1994), penggunaan pewarna sintetik sebagai pewarna makanan atau minuman dapat berdampak negatif yaitu menyebabkan toksik dan karsiogenik. Untuk itu perlu pengembangan alternatif zat warna yang aman, yaitu dengan meningkatkan pemakaian pewarna alami dari tumbuh-tumbuhan (Lauro dalam Wroldstard, 1998). Oleh karena itu sekarang ini sudah saatnya kita memasyarakatkan kembali penggunaan senyawa bioaktif, diantaranya sosialisasi pentingnya zat pewarna dan antioksidan alami pada makanan, dan mencari metode bagaimana penggunaannya agar mudah dan praktis (applicable) ( Susanto, 2002; Saati, 2012; Taslam, 2005). Zat pewarna alami yang bersifat lebih aman, dapat digunakan dari pigmen karotenoid, kurkumin, antosianin dan pigmen lainnya, yang terdapat dalam jaringan buah, bunga, daun, batang maupun akar tanaman. Menurut Hudson (2007), antioksidan alami yang terdapat dalam makanan berasal dari kelompok bahan tambahan makanan yang khusus diisolasi dari sumber-sumber alam dan ditambahkan ke dalam bahan pangan. Dengan hasil penelitian-penelitian yang menunjukkan efek samping dari penggunaan bahan kimia/sintetis terhadap kesehatan manusia, pada akhirnya menyadarkan kita akan pentingnya menjaga kesehatan dengan menggunakan bahan alami (back to nature). Zat pewarna alami merupakan senyawa pewarna yang berasal dari sumber-sumber makhluk hidup seperti hewan dan tanaman. Zat pewarna sintetik merupakan senyawa pewarna yang dihasilkan melalui proses sintetik kimia. Oleh karena itu sudah sangat diperlukan upaya penggalian potensi kekayaan hayati negeri kita, yang terkenal begitu melimpah (Taslan, 2005). Flavonoid adalah jenis pigmen yang bersifat larut dalam air, yang termasuk didalamnya adalah antosianin dan antosantin, kedua-duanya merupakan pigmen yang dapat dihasilkan dari mahkota bunga, sesuai 10 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI dengan asal namanya “anthos” (bahasa Latin) yang berarti bunga. Melalui Uji LD50 terbukti dalam penelitian Saati, dkk. (2007), bahwa pigmen bunga kana merah dan kana kuning terbukti tidak toksik, berarti aman dikonsumsi manusia. Zat pewarna alami ini dapat digunakan dalam berbagai aplikasi makanan dan minuman, seperti pada sereal, produk roti, pasta / mie, gula, produk susu, es krim, olahan daging, olahan unggas, dan produk makanan laut, acar, kerupuk, dan sebagainya (Wu et. al, 2008 : Patent No. 20090246343). Di luar negeri, sudah banyak digunakan pada produk daging dan unggas, susu, tepung, roti, minuman, obat-obatan dan kosmetik (Borzelleca and Hallagan, 1992). Bahkan menurut Soni et. al. (2009), bahwa sejumlah penelitian menunjukkan dampak potensial kelompok flavonoid antara lain mengurangi resiko penyakit jantung, kanker, hyperlipidemias dan menurut Garz’on et al. (2009), bahwa penyakit kronis seperti diabetes melitus dan stroke dapat dicegah melalui asupan makanan kaya antosianin. B. Pigmen Antosianin dan Kegunaannya Antosianin merupakan pigmen yang tergolong senyawa flavonoid, mengandung dua cincin benzena yang dihubungkan oleh tiga atom karbon dan dirapatkan oleh satu atom oksigen sehingga terbentuk cincin di antara dua benzena. Senyawa antosianin merupakan senyawa kation flavium, yang tergolong ke dalam turunan benzopiran. Stuktur utama turunan benzopiran ditandai dengan adanya dua cincin aromatik benzena (C6H6) yang dihubungkan dengan tiga atom karbon dan satu atom O yang membentuk cincin. Antosianin merupakan pigmen alami yang dapat menghasilkan warna biru, ungu, violet, magenta dan kuning. Pigmen ini larut dalam air yang terdapat pada bunga, buah dan daun tumbuhan (Moss, 2002). Pigmen antosianin adalah pigmen yang bersifat larut air, terdapat dalam bentuk aglikon sebagai antosianidin dan glikon sebagai gula yang diikat secara glikosidik (seperti pada Gambar 1). Bersifat stabil pada pH asam, yaitu sekitar 1-4, dan menampakkan warna oranye, merah muda, merah, ungu hingga biru. Potensi Bahan Alam Sebagai Sumber Zat Pewarna dan Antioksidan Alami 11 Gambar 1. Struktur Molekul Antosianin (Sumber : Li, 2009) Glikon yang seringkali diikat oleh antosianidin (sebagai aglikon) dalam pigmen antosianin antara lain: Gambar 2. Beberapa Jenis Glikon yang Lepas Ikatan dari Aglikonnya Beberapa contoh ikatan antara antosianidin (aglikon) dengan glikon: Gambar 3. Contoh Struktur Molekul Antosianin yang Lengkap (Rein, 2005) 12 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Antosianin terdapat dalam vakuola sel bagian tanaman. Vakuola adalah organel sitoplasmik yang berisikan air, serta dibatasi oleh membran yang identik dengan membran tanaman (Kimbal, 1993). Secara kimia antosianin merupakan turunan garam flavilum atau benziflavilum. Antosianin merupakan satuan gugus glikosida yang terbentuk dari gugus aglikon dan glikon (Markakis, 1982). Terdapat lima jenis gula yang ditemui pada molekul antosianin, yaitu: glukosa, rhamnosa, galaktosa, xilosa dan arabinosa. Sedangkan senyawa-senyawa bentuk lainnya sangat jarang ditemui (Francis, 1985). Pigmen antosianin tersebut banyak ditemukan dari mahkota bunga, seperti bunga mawar, kana, kembang sepatu, rosella, gladiol, turi dan lain-lain yang menampilkan warna merah muda - tua, keunguan hingga biru. Namun pigmen ini juga dapat diambil dari beberapa organ tanaman dari umbi, daun hingga buah, seperti ubi jalar ungu, lobak, beet, kol meah/ungu, daun bayam merah keunguan, buah arbei, strobbery, anggur, duwet dan kulit buah naga. Pigmen ini mempunyai absorbansi maksimal pada kisaran panjang gelombang 480-528 nm, dan menurut Henry (1996), antosianin ditampakkan oleh panjang gelombang dari absorbsi maksimal spektrum pada 525 nm. Masing-masing jenis antosianin memiliki absorbansi maksimal pada panjang gelombang tertentu. Dengan pelarut etanol, jenis pelargonidin berkisar antara 498-513 nm, sianidin pada 514-523 nm, delfinidin 534 nm, dan malvidin 543 nm. Senyawa antosianin ditemukan dalam ekstrak air tumbuhan, bahkan senyawa yang hanya larut sedikit dalam air ini, kepolarannya memadai untuk diekstraksi oleh metanol, etanol atau aseton, yang juga sering digunakan untuk ekstraksi flavonoid. Sifat dan warna antosianin di dalam jaringan tanaman dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti: jumlah pigmen, letak dan jumlah gugus hidroksi dan metoksi, kopigmentasi, dan sebagainya (Markakis, 1982). Warna antosianin berubah dengan berubahnya pH. Pada pH tinggi antosianin akan berwarna biru, kemudian berwarna violet dan akhirnya berwarna merah pada pH rendah (DeMan, 1997). Konsentrasi pigmen yang tinggi di dalam jaringan akan menyebabkan warna merah, konsentrasi sedang menyebabkan warna jingga hingga ungu, sedangkan konsentrasi rendah menyebabkan warna biru (Winarno, 2002). Jumlah gugus hidroksi yang dominan menyebabkan warna cendrung biru dan Potensi Bahan Alam Sebagai Sumber Zat Pewarna dan Antioksidan Alami 13 relatif tidak stabil. Sedangkan jumlah gugus metoksi yang dominan dibandingkan gugus hidroksi pada stuktur antosianidin, menyebabkan warna cendrung merah dan relatif lebih stabil. Antosianin adalah senyawa yang bersifat amfoter, yaitu memiliki kemampuan untuk bereaksi baik dengan asam maupun dengan basa. Dalam media asam, antosianin berwarna merah seperti halnya saat dalam vakuola sel dan berubah menjadi ungu dan biru jika media bertambah basa. Perubahan warna karena perubahan kondisi lingkungan ini tergantung dari gugus yang terikat pada stuktur dasar dari posisi ikatannya (Charley, 1970). Perubahan pH mengakibatkan perubahan warna antosianin seperti ditunjukkan pada Tabel 1. Antosianin adalah pigmen penyumbang warna merah, merah muda, ungu dan biru (Lewis et al., 1997), dapat diperoleh dari mahkota bunga yang berwarna merah, pink, ungu dan biru, Pigmen antosianin yang umumnya diinginkan pada beberapa produk pangan seperti sirup, sari buah, jelly, yoghurt (Saati dan Asmi Abbas, 2003), tepung, susu, makanan bayi, aneka kue, cake dan lain-lain. Hasil penelitian ekstraksi buah arbei menunjukkan bahwa penggunaan pelarut etanol dan asam sitrat (90 : 10) menghasilkan pigmen antosianin yang lebih baik, dibandingkan pelarut asam sitrat saja atau dengan aquades dan asam sitrat serta terbukti efektif menyumbangkan warna kue bolu kukus (Mulyanto, 2006). Tabel 1. Perubahan pH dan Warna Antosianin Sumber: Rein (2005) 14 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Ekstrak arbei tersebut juga terbukti mempunyai kemampuan menangkap radikal bebas tertinggi pada suhu 100oC pada pemanasan selama 10 menit (Pramono, 2007), sesuai pendapat Hudson (2007) bahwa antioksidan alami dapat diperoleh dari sumber-sumber alam dan dapat ditambahkan ke dalam bahan pangan. Studi baru-baru menunjukkan bahwa antosianin memiliki kemampuan menangkap radikal bebas dan aktivitas antioksidan yang tinggi serta menunjukkan efek penghambatan terhadap pertumbuhan beberapa sel kanker. Hewan percobaan menunjukkan bahwa asupan oral antosianin dari ungu ubi jalar (Ipomea batatas L.) dan kubis merah (Brassica oleracea L.) menekan tikus karsinogenesis kolon akibat diinduksi 1,2-dimethylhydrazine dan 2 - amino-1-metil-6-phenylimidazo-[4,5-b] piridin ( Hui et. al., 2004). C. Fungsi Pigmen sebagai Zat Pewarna dan Antioksidan Alami Menurut Henry dan Houghton (1996), bahwa warna yang ditambahkan pada makanan karena mempunyai tujuan antara lain: mempertegas warna yang telah ada pada produk makanan, meyakinkan keseragaman warna makanan dari tahap ke tahap, mempertahankan penampakan asli makanan dan untuk memberi warna dengan sengaja pada makanan. Menurut Fardiaz, dkk (1987), bila dibandingkan dengan pewarna-pewarna sintetis, penggunaan warna alami mempunyai keterbatasan antara lain: (1) seringkali memberikan rasa dan flavor khas yang diinginkan, (2) konsentrasi yang rendah, (3) stabilitas pigmen yang rendah, (4) keseragaman warna yang kurang baik, dan (5) spektrum warna yang tidak seluas seperti pewarna sintetis. Pigmen antosianin adalah pewarna alami penyebab warna merah, oranye, ungu dan biru, banyak terdapat pada bunga seperti bunga krisan, pelargonium, aster cina (Lewis et al., 1997) dan buah-buahan (buah apel, chery, anggur, strawberi (Harborne, 1987, De Man, 1989, Nollet, 1996), juga terdapat pada buah mangsi (Irawati, 2002). Menurut Henry dan Houghton (1996), ada beberapa faktor yang berhubungan dengan aplikasi pewarna terhadap produk, harus dipertimbangkan dalam proses pembuatannya, yaitu antara lain: (i) Kelarutan pigmen, yaitu antosianin larut dalam air, sedangkan kurkumin, klorofil dan xantofil larut dalam minyak atau lemak, (ii) Bentuk kimia, yaitu pewarna tersedia dalam bentuk antara lain ekstrak, bubuk, pasta, dan konsentrat. Penentuan pemakaian bentuk pewarna sangat penting Potensi Bahan Alam Sebagai Sumber Zat Pewarna dan Antioksidan Alami 15 untuk mengetahui bahwa warna akan berubah jika pigmen rusak selama prossesing. Peningkatan suhu sering sekali menyebabkan rusaknya struktur pigmen yang menyebabkan perubahan warna. (iii) Tingkat kesamaan (pH), pewarna makanan yang dalam air (terutama yang berbentuk cairan) dibuat dengan pH maksimum. Penambahan larutan buffer ke dalam produk akan berubah pH larutan, dan (iv) Bahan tambahan lain. Sebagai acuan syarat kesehatan digunakan syarat mutu air untuk industri hasil pertanian pangan atau air minum, di antaranya kandungan Cl (cloride) maksimum 250 mg/l, dengan kandungan phenol (phenolik) maksimal 0,002 mg/l, kandungan maksimal untuk unsur berbahaya seperti Fe, Mn, Pb, dan Cu, masing - masing sebesar 0,2; 0,1; 0,5 dan 3,0 mg/l (Susanto dan Saneto, 1994). Radikal bebas yaitu suatu molekul beroksigen (mengandung O) dengan atom yang pada orbit terluarnya memiliki elektron yang tidak berpasangan. Karena tidak berpasangan tersebut maka molekul tersebut menjadi tidak stabil. Senyawa bioaktif seperti pigmen flavonoid, atau antosianin merupakan suatu molekul yang bersifat sebagai antioksidan, yaitu merupakan zat yang anti terhadap zat lain yang bekerja sebagai oksidan. Antioksidan mempunyai peran yang penting dalam membantu mencegah kerusakan sel-sel sehat akibat adanya radikal bebas tersebut. Pigmen flavonoid, khususnya antosianin tidak hanya berperan dalam menyumbangkan warna alami pada makanan, minuman, obat-obatan dan kosmetik, bahkan menurut Soni and Maria (2007), bahwa sejumlah penelitian menunjukkan dampak potensial kelompok flavonoid antara lain mengurangi resiko penyakit jantung, kanker, hyperlipidemias dan penyakit kronis lainnya melalui asupan makanan kaya antosianin. Pada penelitian dan paten yang terdahulu, senyawa antioksidan yang telah diketahui diperoleh dari ekstrak / juice nanas, dari Paten USPTO No. 6224926 ( 23 Agustus 1999) oleh Ronald E. Wrolslad and Ling Wen digunakan sebagai anti-browning. Berbagai metode pengujian aktivitas antioksidan telah digunakan untuk meneliti dan membandingkan aktivitas antioksidan dalam makanan. Aktivitas antioksidan menggunakan metode penangkapan radikal bebas dapat dilakukan dengan cepat, mudah dan sederhana. Metode DPPH (2,2-Diphrnyl-2picrylhydrazyl) digunakan untuk mengetahui kemampuan zat antioksidan untuk menangkap radikal bebas (Hatano et al, 1998). Radikal 2,2- 16 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Diphrnyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) adalah radikal bebas stabil yang menerima sebuah elektron atau hidrogen untuk diubah menjadi molekul diamagnetik. DPPH banyak digunakan pada sistem penelitian aktivitas penangkapan radikal pada senyawa alami tumbuhan. Aktivitas antiradikal ditandai dengan perubahan warna larutan dari ungu menjadi kuning bening dengan penurunan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm (Soares et al, 1997). Teknik Isolasi dan Identifikasi Pigmen Antosianin 17 Bab 3 TEKNIK ISOLASI DAN IDENTIFIKASI PIGMEN ANTOSIANIN E kstraksi merupakan suatu cara untuk memisahkan campuran beberapa zat menjadi komponen terpisah (Winarno et al., 1973). Waktu ekstraksi zat pewarna alami harus diketahui secara optimal dan juga harus dipertimbangkan dari segi efektifitasnya. Efektifitas ekstraksi tidak dapat dilepaskan dari kemampuan bahan pengekstrak untuk melarutkan senyawa yang diekstrak. Peristiwa pembentukan larutan dikatakan sebagai interaksi antara pelarut dengan zat yang dilarutkan (Winarno et al., 1973). Bila dikaitkan dengan energi, maka defenisi pelarutan adalah: (1) Peristiwa pemutusan ikatan solut-solut yang membutuhkan energi; (2) Peristiwa pemutusan ikatan solven-solven yang membutuhkan energi; (3) Peristiwa pembentukan ikatan solutsolven yang melepaskan energi. Jadi, apabila energi yang dilepaskan pada tahap 3 dapat menutup energi yang dibutuhkan pada tahap 1 dan 2 maka zat dapat terlarut (Petrucci, 1987). Ekstraksi adalah proses pengeluaran sesuatu zat dari campuran bahan dengan jalan menambahkan bahan ekstraksi tepat pada waktunya. Hanya zat yang diekstrak yang dapat larut dalam bahan ekstraksi. Pemisahan yang diinginkan dapat terjadi karena adanya perbedaan dalam sifat yaitu dapat larutnya antara bahan-bahan campuran dari suatu campuran zat dalam bahan pelarut. Untuk mendapatkan senyawa pengekstrak yang baik, diperlukan bahan pengekstrak yang memiliki kepolaran yang sama dengan zat yang 17 18 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI diekstrak. Senyawa non polar hanya dapat larut dengan baik dalam senyawa non polar seperti eter, kloroform, benzen, etanol dan metanol. Hal serupa juga berlaku pada senyawa polar yang hanya dapat larut dengan baik dalam senyawa polar seperti air. Senyawa bioaktif yang diekstrak tersebut akan larut dalam pelarut karena kesesuaian/ kesamaan polaritas yang disebut like disolves like (Chan et al., 2009). Berbagai senyawa organik, pada umumnya termasuk dalam senyawa non polar. Senyawa-senyawa organik menggabungkan atomnya dengan membagi secara bersama elektron-elektron dari atomnya. Ikatan yang terjadi dikenal sebagai ikatan kovalen (Hart, 1990). Antosanin dapat diekstrak dengan pelarut agak polar dan jenis pelarut yang digunakan mempunyai kesesuaian kelarutan dengan antosianin, baik dari segi polaritasnya maupun tingkat kelarutannya dalam air atau dapat bercampur dengan air dalam berbagai proporsi. Menurut Markakis (1982), metode ekstraksi yang baik untuk bahan hayati (yang berasal dari tanaman) adalah dengan melarutkan bahan ke dalam 1% HCl dalam metanol. Aamun untuk penerapan dalam pangan, metode ekstraksinya menggunakan 1% HCl dalam etanol. Hal ini dikarenakan sifat toksik dari metanol. Berbagai contoh ekstraksi antosianin misalnya ekstraksi dengan menggunakan etanol dengan HCl 1,5N pada kulit buah rambutan (Wijaya et al. 2001), ekstraksi dengan menggunakan etanol pada kulit buah duwet (Sari, 2005). Guillotin et al., (2009) telah memastikan bahwa deglikosilasi antosianin menyebabkan hilangnya stabilitas warna dan molekul. Oleh karennya jika menggunakan enzim untuk ekstraksi jus buah maka dianjurkan tanpa glikosidase. A. Metode Spektrofotometri Sudah lama sekali ahli kimia menggunakan warna sebagai suatu pembantu dalam mengidentifikasi zat kimia. Spektrofotometer adalah suatu alat atau instrumen untuk mengukur trasmisi atau absorben suatu contoh sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometri dapat dibayangkan sebagai suatu perpanjangan dari penilikan visual dimana studi yang lebih terinci mengenai pengabsorpsian energi cahaya oleh spesies kimia sebagai fungsi dari panjang gelombang radiasi, demikian pula pengabsorpsian yang menyendiri pada suatu panjang gelombang tertentu, memungkinkan kecermatan yang lebih besar dalam pencirian dan pengukuran kuantitatif. Teknik Isolasi dan Identifikasi Pigmen Antosianin 19 Kebanyakan penerapan spektrofotometri ultraviolet dan cahaya tampak pada senyawa organik yang didasarkan pada transisi n-Π* atau pun Π-Π* dan karenanya memerlukan hadirnya gugus kromoforat dalam molekul itu. Transisi ini terjadi pada daerah spektrum sekitar 200 hingga 700 nm yang praktis untuk digunakan dalam eksperiment. Spektrofotometer UV - V15 yang komersial biasanya beroperasi dari sekitar 175 atau 200 hingga 1000 nm. Identifikasi kualitatif senyawa organik dalam daerah ini jauh lebih terbatas daripada daerah inframerah, ini karena pita absorbsi terlalu lebar dan kurang terperinci (....., tahun..). Untuk antosianin diperlukan pelarut HCl 0,4 M dalam methanol dalam ekstraksinya. Spektrum khas flavonoid terdiri atas dua maksimal pada rentang 240-285 nm (pita II) dan 300-550 (pita I). Rentangan serapan spektrum untuk antosianin dan antosianidin adalah 270-280 nm (pita II) dan 465-560 nm pada pita I (Markham, 1988), sedangkan menurut Harborne (1996) jangka spektrum tampak dari antosianin adalah 475 sampai 550 nm. B. Metode Kromatografi dan KLT (Kormatografi Lapis Tipis) Kromatografi adalah proses pemisahan yang didasarkan pada perbedaan distribusi komponen diantara fase gerak dan fase diam (Vogel, 1987). Pemisahan komponen pigmen antosianin dari ekstrak kulit anggur dapat dilakukan dengan cara kromatografi kertas atau KKt dengan menggunakan kertas Whatman no.1 atau no.3 (Anderson et al., 1970). Adapun pengembang yang digunakan Harbone (1987) adalah campuran n-butanol : asam asetat : air (4:1:5 v/v), campuran n-butanol: HCl 2 M (1:1 v/v) atau 1% HCl yang dipakai sebagai lapisan atas. Dengan metode ekstraksi menurut Nyman and Kumpulainen (2001) pigmen bunga kana merah tua dapat terdeteksi yaitu pigmen antosianin dari jenis antosianidin (didominasi delfinidin, kemudian malvinidin gilkosida), melalui metode kromatografi kertas (KKt) dan Spketrofotometri UV-Vis. Bunga kana merah muda diketahui mengandung pigmen antosianin berjenis sianidin glikosida, kemudian identifikasi pigmennya dilengkapi dengan metode HPLC (High Pressure Liquid Cromatografi) (Saati, 2006). Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) adalah suatu teknik kromatografi yang berguna untuk memisahkan senyawa organik. Oleh karena kesederhanaan dan kecepatan KLT, sering digunakan untuk membantu 20 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI kemajuan reaksi organik dan untuk memeriksa kemurnian produk (Bryan, 2001). Lapisan penyerap dari KLT dapat berupa aluminium oksida, kalsium hidroksida, magnesium fosfat, poliamida, sephadex, selulosa, silika gel, dan campuran dua bahan tersebut atau lebih. Antosianin dapat dipisahkan dengan KLT pada selulosa atau pada campuran selulosa dan silika gel (Harborne, 1996). Pemisahan dalam KLT melibatkan pembagian campuran dua atau lebih zat antara fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam adalah lapisan tipis dari penyerap (biasanya silika atau alumina) yang dilapiskan di atas pelet. Fasa gerak adalah cairan pengembang yang berjalan di atas fasa diam, membawa sampel guna tahapan elusi. Komponen dari sampel akan dipisahkan di atas fasa diam disesuaikan berapa banyak penyerap pada fasa diam yang larut dalam fasa gerak (Madison, 1995). Pada tahap identifikasi atau penampakan noda, jika noda sudah berwarna dapat langsung diperiksa dan ditentukan harga Rf-nya. Besaran Rf ini menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fasa diam. Rf juga disebut faktor retardasi atau faktor retensi. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh eluen (fasa gerak) (Soebagio, dkk, 2005). Beberapa acuan standar dalam penentuan jenis pigmen antosianin, seperti nilai Rf dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Harga Rf Antosianidin dengan Beberapa Fase Gerak/Mobil Teknik Isolasi dan Identifikasi Pigmen Antosianin 21 Wagner dan Bladt (2001) telah mengidentifikasi senyawa antosianin dari Malvae silvestris flos dan Cyani flos menggunakan plat silika gel 60 F254 menggunakan eluen etil asetat-asam asetat glasial-asam format-air (100:11:11:26) dan n-Butanol-asam asetat glasial-air (50:10:20). Dalam kedua sampel ini menunjukkan kemiripan pola kromatografi lapis tipis dengan satu daerah merah menyolok dengan Rf 0,05-0,1. C. Metode Fourier Transform Infrared (FTIR) Fourier Transform Infrared (FTIR) adalah metode analisa persenyawaan menggunakan deteksi frekuensi gelombang dari atom-atom yang dikandung komponen penyusun dari suatu zat. Jumlah energi yang diperlukan untuk meregangkan suatu ikatan tergantung pada tegangan ikatan dan massa atom yang terikat. Bilangan gelombang suatu serapan dapat dihitung menggunakan persamaan yang diturunkan dari Hukum Hooke, yaitu? Bilangan gelombang dari vibrasi regangan (v) tersebut merupakan hubungan antara konstanta gaya ikatan (f) dan massa atom (dalam gram) yang digabungkan oleh ikatan (m1 dan m2). Konstanta gaya merupakan ukuran tegangan dari suatu ikatan. Persaman tersebut menunjukkan bahwa ikatan yang lebih kuat dan atom yang lebih ringan menghasilkan frekuensi yang lebih tinggi. Semakin kuat suatu ikatan, makin besar energi yang dibutuhkan untuk meregangkan ikatan tersebut. Frekuensi vibrasi berbanding terbalik dengan massa atom sehingga vibrasi atom yang lebih berat terjadi pada frekuensi yang lebih rendah (Bruice, 2001). Pancaran infra merah pada umumnya mengacu pada bagian spektrum elektromagnetik yang terletak di antara daerah tampak dan daerah gelombang mikro. Penggunaan spektroskopi inframerah pada bidang kimia organik hampir selalu menggunakan daerah di 650 - 4000 cm-1. (Silverstain, 1967). Spektrofotometer FTIR merupakan alat untuk mendeteksi gugus fungsional, mengidentifikasi senyawa dan menganalisis campuran. Banyak pita absorpsi yang terdapat dalam daerah yang disebut daerah "sidik jari" spektrum. Spektrum FTIR suatu sampel dapat diketahui letak pita serapan yang dikaitkan dengan adanya suatu gugus fungsional tertentu (Day dan Underwood, 1999). Jasmina et al. (2001) telah melaporkan dapat menentukan interaksi kopigmentasi antosianin jenis malvidin 3,5-diglukosida dengan beberapa jenis asam organik antara lain asam tannat dan asam ferulat (pada pH 22 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI 2,5 dan 3,65) menggunakan metode analisa FTIR, ditandai munculnya gugus hidroksi pada pita 3500 cm-1 dan gugus ion oxonium (antosianin) pada pita 3000 cm-1. Puspitasari (2003) telah mengidentifikasi flavonoid menggunakan spektroskopi infra merah dan didapatkan pola-pola serapan -OH pada daerah 3500-3400 cm-1, serapan C=O pada 1700-1600 cm-1, rentangan CO pada 1100-1000 cm-1, dan serapan asimetri dan simetri C=O aromatis pada 1600-1400 cm-1. D. Metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC) HPLC (High performance liquid chromatography) adalah merupakan teknik analisa yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner, maka molekul-molekul di dalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya berbeda dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom. HPLC mempunyai prinsip yang mirip dengan reverse phase. Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi. Kolom yang digunakan dalam HPLC lebih pendek dan berdiameter kecil, namun dapat menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dalam jumlah besar Beberapa acuan standar dalam penentuan jenis pigmen antosianin, seperti nilai waktu tambat (retention time) dan bobot molekul (m/z) dan struktur molekul yang perlu diketahui, dapat dilihat pada Tabel 3. Analisa HPLC terhadap pigmen antosianin pada kulit buah berry oleh Kuwayama et al (2005) dengan detektor spektrofotometri L-7420; Teknik Isolasi dan Identifikasi Pigmen Antosianin 23 HITACHI, Japan) menggunakan kolom ODS (Wakosil-II 5C18 AR, 4.6 mm i.d. 250 mm; Wako Pure Chemical, Japan), pelarut elusinya 7% yaitu larutan B (50% CH3CN, 40% CH3COOH and 0.5% CF3COOH dalam H2O), dilanjutkan elusi dengan pelarut 7-35% larutan B dalam pelarut A (0.5% CF3COOH dalam H2O) menemukan kandungan jenis antosianin antara lain sianidin, pelargonidin, delphinidin, petunidin dan malvidin, pada λ 530 nm. Sedangkan Lee et al. (2008) menganalisa pigmen antosianin menggunakan HPLC tipe A HP1100 system equipped dengan DAD (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA), menggunakan pelarut A yaitu 100% acetonitrile dan pelarut B (10% (v/v) asam asetat dan 1% (v/v) asam posfat dalam air/aquades, pada 280 and 520 nm. Tabel 3 Nilai Waktu Retensi HPLC dan Bobot Massa Antosianin dalam Ekstrak Sumber : Mullen et.al. (2010) 24 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Hasil analisa pigmen antosianin dari ekstrak dedak sorghum hitam (dengan C-18 Sephadex) menggunakan metode spektrofotometri dan HPLC menunjukkan bahwa terdapat jenis luteolinidin dan apigeninidin dalam 50% kandungan antosianin (Awika et. al., 2004), dapat dilihat pada Gambar 4. Gambar 4. Contoh Profil Hasil Analisa Antosianin (Sorghum Hitam) Berdasarkan Masa Tenggatnya (Ritention Time) (Awika et. al., 2004) Keterangan peak standar : a) Sianidin 3-5-diglukosida, b) pelargonidin 3-5, diglukosida, c) sianidin 3-glukosida, d) sianidin 3-rutinosa, e) sianidin (cloride), f) luteolinidin, g) apigenidin, h) peonidin. Peak 1) dan 4-7) memungkinkan sebagai luteolinidin, dan 2-3) sebagai apigeninidin E. Metode Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS) LCMS (Liquid chromatography-mass spectrometry) adalah kromatografi cair-spektrometri massa, dimana secara kimia analitik teknik yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik kromatografi cair (atau HPLC) dengan kemampuan analisis spektrometri massa. LCMS adalah Teknik Isolasi dan Identifikasi Pigmen Antosianin 25 teknik yang kuat digunakan untuk banyak aplikasi yang memiliki sensitivitas yang sangat tinggi dan selektivitas. Metode ini umumnya digunakan pada analisa deteksi dan identifikasi bahan kimia yang berorientasi terhadap potensi bahan kimia lainnya (dalam campuran kompleks). Perbedaan utama antara tradisional HPLC dan kromatografi yang digunakan dalam LC-MS adalah bahwa dalam kasus terakhir skala biasanya jauh lebih kecil, baik sehubungan dengan diameter dalam kolom dan bahkan lebih lagi sehubungan dengan tingkat mengalir karena skala sebagai kuadrat dari diameter. Penelitian Lopes et al. (2010), menggunakan metode HPLC-ESIMS/MS mendeteksi jenis pigmen antosianin antara lain delpinidin 3glukosida, sianidin 3-glukosida dan sianidin 3-(6"-malonil)glukosida dalam kulit buah anggur, dengan total antosianin sekitar 420.26 ± 3.07 mg/kg berat basah, dengan mendeteksi jenis antosianin malvidin 3glukosida pada rite time 15,03 menit dengan bobot molekul 493/ 331, dan jenis sianidin 3-(6"-malonil)glukosida pada Rt 16.01 dengan m/z 535/449/287. Beberapa acuan standar dalam penentuan jenis pigmen antosianin, seperti nilai rite time dan bobot molekul (m/z) dan struktur molekul yang perlu diketahui, dapat dilihat pada Tabel 4. F. Metode Nuclear Magnetic Resonance (NMR) NMR (Nuclear magnetic resonance) adalah metode analisa menggunakan resonansi magnet inti yang memberikan keterangan jumlah setiap tipe hidrogen, yang menunjukkan keterangan tentang sifat lingkungan dari setiap tipe atom hidrogen tersebut. Dalam percobaan/penelitian ini akan dilengkapi dengan analisa NMR menggunakan metode Hartati dan Hanafi (2001), agar dapat diketahui dengan lebih pasti bagaimana molekul pigmen antosianin (antosianidin dan glikon yang mengikatnya) mahkota bunga mawar, seperti contoh gambar hasil uji NMR Rein (2005). Penelitian Hillebrand et al. (2009) dengan menggunakan analisa kombinasi HPLC-DAD-ESI-MS dan NMR dapat menentukan jenis dan struktur molekul pigmen antosianin yang dikandung ubi jalar ungu (Solanum tuberosum L.) dari empat cultivar yaitu 3-p-coumaril rutinosa-5-glukosida pada antosianidin petunidin, malvidin dan petunidin. Contoh penelitian NMR1H yang lain dapat dilihat pada Gambar 5a dan 5b. 26 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Tabel 4 Bobot Massa dari Beberapa Antosianidin, Gula dan Gugus Asilasi pada Antosianin (Sumber : Mullen et al., 2010) Teknik Isolasi dan Identifikasi Pigmen Antosianin 27 Gambar 5a. Penentuan Struktur Molekul Sianidin Berdasarkan Analisa NMR1H (Andersen and Fossen, 2003) Gambar 5b. Struktur Molekul Pigmen Antosianin dengan Asilasinya Sumber : Mullen et.al. (2010) 28 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Hasil Identifikasi Pigmen Antosianin Bunga Mawar 29 Bab 4 HASIL IDENTIFIKASI PIGMEN ANTOSIANIN BUNGA MAWAR D alam sistematika tumbuhan (taksonomi), mawar diklasifikasikan sebagai berikut: Kingdom : Plantae Divisi : Spermatophyta Sub-Divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledonea Ordo : Rosanales Famili : Rosaceae Genus : Rosa Species : Rosa damascena Mill, Rosa multiflora Thunb (Hidayah, 2006). Mawar merupakan tanaman bunga hias berupa herba dengan batang berduri. Mawar yang dikenal nama bunga ros atau "Ratu Bunga" merupakan simbol atau lambang kehidupan religi dalam peradaban manusia. Mawar berasal dari dataran Cina, Timur Tengah dan Eropa Timur. Dalam perkembangannya, menyebar luas di daerah-daerah beriklim dingin (sub-tropis) dan panas (tropis) (Hidayah, 2006). Menurut Hembing dkk. (1996), mahkota bunga mawar dapat menyembuhkan berbagai penyakit seperti batuk darah, TBC, disentri, campak, nyeri haid dan lain-lain. 29 30 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Tanaman mawar bisa tumbuh baik di daerah yang mempunyai ketinggian 700-1000 di atas permukaan laut, berudara sejuk dan lembab. Daerah di Jawa Timur yang sesuai untuk ditanami tumbuhan ini adalah daerah Malang Raya (termasuk Batu), Lumajang, Pasuruan, Probolinggo, Mojokerto, dan Magetan. Tanaman mawar tidak mengakibatkan terjadinya erosi seperti tanaman sayur-mayur (Noertjahyo, 2006). Berdasarkan kebiasaan pemeliharannya, dikenal 3 kelompok mawar, yaitu: - Mawar perdu, merupakan sosok tanaman mawar yang seringkali dipangkas cabang, ranting dan akar, sehingga bentuknya menyerupai semak-semak kecil (rendah). - Mawar pohon, merupakan sosok tanaman mawar yang selalu dipangkas sepanjang hidup di pertanamannya. - Mawar mini, merupakan tanaman mawar yang umumnya dibentuk menjadi bonsai, sehingga disebut bonsai mawar (Rukmana, 1995). Di Indonesia banyak dikembangkan jenis mawar hibrida, terutama jenis dan varietas mawar yang berasal dari Belanda. Kelompok mawar yang banyak peminatnya adalah tipe hibrida dan lokal batu. Kelebihan kedua varietas ini adalah memiliki variasi bunga mawar yang cukup banyak, antara lain warna putih, merah muda, merah tua dan kuning. Mawar tipe hibrida tea memiliki tangkai bunga sepanjang 80-120 cm, sedangkan tipe lokal batu antara 40-60 cm. Selain itu tingkat produktivitas mawar tersebut termasuk tinggi, berkisar antara 120-280 kuntum/m2/ tahun (Rukmana, 1995). Keunggulan varietas mawar yang banyak ditanam di daerah Batu adalah berwarna merah tua, bagian pingir petal sedikit kehitaman, memiliki petal bunga yang kompak, sedikit kaku, agak tebal, sedikit mengkilat, jumlah petal sekitar 27-40, bermahkota bunga indah, lama peragaan bunga (fase life) sekitar 7-8 hari, tahan rontok, tahan pengiriman jarak jauh, produksi bunga per tanaman/bulan sekitar 3-6 tangkai dan dapat ditanam tanpa naungan (Purbiyati dkk., 2006). Sentra produksi bunga mawar potong di Indonesia terdapat di beberapa daerah produsen bunga-bungaan seperti Cipanas, Lembang (Jawa Barat), Brastagi (Sumatera Utara), Bandungan (Jawa Tengah), Kecamatan Bumiaji di wilayah Batu dan Kecamatan Pujon (Malang - Jawa Timur). Sementara bunga mawar tabur banyak diusahakan di daerah Ambarawa, Boyolali Hasil Identifikasi Pigmen Antosianin Bunga Mawar 31 (Jawa Tengah), Bangil (Jawa Timur), Kebun Jeruk (Jakarta), Tangerang dan Bogor (Jawa Barat). Mawar pot banyak dikembangkan dan dibudidayakan di Bandung (Jawa Barat) dan Kecamatan Batu serta Kecamatan Pujon (Malang-Jawa Timur). Dari daerah-daerah sentra produksi bunga potong mawar kemudian menular dan ditiru oleh daerah-daerah lain yang cocok kondisi alamnya serta turut pula mengusahakan bisnis bunga potong. Sasaran pemasarannya terutama adalah kota-kota besar dan juga daerahdaerah wisata di Indonesia. Petani mawar khususnya di wilayah Batu banyak yang mengusahakan bunga mawar potong hasil introduksi sejak tahun 1990 terutama di daerah Gunungsari, Punten dan Pujon dengan luas pertanaman kurang lebih 30 Ha. Luas areal ini terlihat bertambah dibandingkan sebelumnya yang hanya mencapai sekitar 10 sampai 15 ha. Pertambahan areal tersebut sebagai akibat banyaknya petani sayur yang beralih komoditi untuk menanam bunga mawar potong setelah krisis moneter pada tahun 1999, disamping itu permintaan pasar untuk bunga mawar potong yang stabil. Luas panen bunga mawar potong tahun 2000 di Kabupaten Malang dengan luasan 1,7 Ha produksi bunga sekitar 94.149 tangkai selama musim kemarau. Saat ini di Jawa Timur tanaman bunga mawar potong juga berkembang di daerah Kecamatan Poncokusumo Kabupaten Malang (Purbiyati dkk., 2006). Wangi bunga mawar disebabkan karena adanya kandungan minyak atsiri di dalamnya. Minyak atsiri ini mengandung zat sitrat, sitronelol, geraniol, linalol, nerol, eugenol, feniletil alkohol, farnesol, dan non alildehida. Berkhasiat untuk mengobati gigitan serangga berbisa, "gabag" (morbili) dan jerawat. Pada beberapa spesies seperti Rosa canina dan Rosa rugosa menghasilkan buah rose hips yang sangat kaya dengan vitamin C bahkan termasuk diantara sumber vitamin C alami yang paling kaya (Anonim, 2006). Komponen terbanyak dalam mahkota bunga mawar segar antara lain air (83-85%), vitamin C, β-karoten, cyanins (antosianin), gula total 8-12%, minyak atsiri sekitar 0,06-1,0% (citronellol, eugenol, asam galat dan linalool) (Saati, dkk., 2003, 2007; Blake, 2004). A. Pelarut Ekstraksi Larutan adalah campuran dua atau lebih yang homogen. Komponen larutan tersebut terdiri dari pelarut (solvent) dan zat terlarut (solute). Pelarut merupakan komponen zat dalam jumlah besar dalam suatu 32 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI larutan dan sifat fisiknya dominan dalam larutan. Pelarut yang baik untuk ekstraksi adalah pelarut yang mempunyai daya melarutkan yang tinggi terhadap zat yang diekstraksi. Daya melarutkan yang tinggi berhubungan dengan kepolaran dari senyawa yang diekstraksi. Adanya kecenderungan kuat bagi senyawa yang polar larut ke dalam pelarut polar dan senyawa non polar larut dalam pelarut non polar (Vogel, 1987). Salah satu ciri penting dari pelarut yang akan digunakan untuk mengekstraksi suatu zat atau senyawa adalah tetapan dielektriknya. Tetapan dielektrik adalah nisbah gaya yang bekerja pada muatan/kutub dalam ruang hampa dengan gaya yang bekerja pada dua muatan tersebut dalam pelarut. Jadi, umumnya pelarutpelarut yang berkutub (polar) dapat melarutkan zat-zat yang berkutub dan pelarut-pelarut yang tidak berkutub (nonpolar) dapat melarutkan zat-zat yang tidak berkutub (Sudarmadji, 1997). Pelarut yang seringkali digunakan untuk mengekstrak antosianin adalah alkohol: etanol dan metanol (Budiarto, 1991), amil alkohol (Robinson, 1991), isopropanol (Saati, 2002), aseton (Eksin, 1990 ), atau dengan air/aquades (Nollet, 1996 ), yang dikombinasi dengan asam, seperti asam khlorida (Nollet, 1996), asam asetat, asam format (Gao and Mazza, 1996), atau asam askorbat (Robinson, 1991). Ekstraksi flavonoid menggunakan pelarut etanol menghasilkan daya antioksidatif lebih tinggi, dibandingkan dengan air dan metanol (Jung et al., 2006). Contoh Paten pada Oktober 2004 oleh Golc Wondra No. SI2004000016 dari Institut Hajdrihova 19,1000 Ljubljana SI, bahan ekstrak tiga macam buah yaitu anggur, blackcurrant dan redcurrant (masing-masing 2 kg) yang diekstrak dengan etanol : air = 70 : 30 (4 liter), mengandung antosianin yang sekaligus dapat difungsikan sebagai antioksidan pada produk makanan. Fox, Gregory J. (2009) dalam patennya United States Patent 6132791 menemukan bahwa pigmen antosianin dari ruby merah dapat diekstraksi menggunakan larutan diasamkan dapat stabil dalam range pH cukup luas dan suhu relatif tinggi. Beberapa jenis asam yang dapat digunakan antara lain asam asetat, asam sitrat, asam malat, asam laktat dan asam karboksilat. Yokoyama and Ono (2006, US Patent. No 4302200) menggunakan ion sulfit 1-1,5% pada suhu 85 oC selama 30 menit dalam mengekstraksi pigmen antosianin untuk jus buah (anggur, cherry), dengan suhu evaporasi 30-35oC. Hasil Identifikasi Pigmen Antosianin Bunga Mawar 33 Menurut Strack dan Wray (1993), penambahan asam sebagai pelarut tidak selalu diperlukan. Metode ekstraksi yang digunakan untuk analisis kuantitatif harus diperiksa secara menyeluruh pada tanaman dan jenis pigmen tertentu. Jika terdapat gugus asil pada antosianin misalnya di dalam kubis ungu, maka penggunaan asam sebagai campuran pelarut harus dihindarkan. Hal ini disebabkan ikatan asil ini mudah terhidrolisis (Markakis 1982). Produksi jus wortel hitam menggunakan pelarut asam yang hangat, karena menurut Gizir (2007), ketika asam organik digunakan untuk mengasamkan air, efisiensi ekstraksi antosianin lebih tinggi, disertai dengan polimerisasi yang relatif rendah, dengan asam laktat memberikan hasil yang terbaik. Faktor-faktor yang mempengaruhi kecepatan atau efisiensi ekstraksi adalah: 1) luas permukaan singgung zat pelarut dengan bahan yang diekstrak; 2) lama proses ekstraksi; 3) jumlah tingkat ekstraksi yang dilakukan; 4) suhu ekstraksi dan 5) sifat zat pelarut maupun bahan (Chan et.al, 2009). Polaritas berbanding lurus dengan konstanta dielektrik, sedangkan konstanta dielektrik berbanding terbalik dengan suhu, misalnya pada suhu 25oC konstanta dielektrik air adalah 78,30, pada suhu 100oC menjadi 55,33 (Ricter et al. (2007). 1. Pelarut Air dan Alkohol Air merupakan bahan yang sangat penting bagi kehidupan umat manusia dan fungsinya tidak dapat digantikan oleh senyawa lain. Air juga merupakan komponen penting dalam bahan makanan karena air dapat mempengaruhi penampakan tekstur, dan citarasa dari makanan. Dibandingkan dengan cairan lain, air adalah pelarut yang paling baik. Air melarutkan atau mendispersi berbagai zat berdasarkan sifat dwi kutub yang dimilikinya. Berbagai zat berupa kristal mudah larut dalam air tetapi tidak larut dalam pelarut non polar seperti kloroform atau benzena (Aisjah, 1986). Karena pemisahan daya tarik antara molekul air lebih tinggi dari molekul normal lainnya yang memiliki gaya van der Waals. Air dapat mempengaruhi konformasi makromolekul, yang memiliki efek pada setiap ikatan nonkovalen yang menstabilkan konformasi molekul besar tersebut. Ada tiga macam kemungkinan ikatan nonkovalen yaitu ikatan hidrogen, ikatan ionik atau ikatan apolar (deMan, 1999). 34 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Beberapa contoh ekstraksi yang tidak menggunakan asam adalah pada ekstraksi capulin (Prunus serotina Ehrn), sirup blueberry, sorgum hitam, dan kacang polong ungu (Pisum spp). Pelarut yang digunakan pada ekstraksi Capulin adalah aseton, pada ekstraksi sirup blueberry pelarut yang digunakan adalah etanol, pada sorgum hitam pelarut yang digunakan adalah air:aseton (70:30) dan pada kacang polong ungu pelarut yang digunakan adalah 15% aseton (Galindo et al. 1999; Terahara et al. 2000). Salinas et al (2005) menemukan ekstraksi maserasi anggur pada suhu 15oC menghasilkan kualitas anggur yang terbaik yang ditandai dengan tingginya nilai C sebagai indikasi intensitas warna minuman anggur, dengan pigmen antosianin berjenis Malvidin 3-Glikosida. Etanol, disebut juga etil alkohol, alkohol murni, alkohol absolut, atau alkohol saja, adalah sejenis cairan yang mudah menguap, mudah terbakar, tak berwarna, dan merupakan alkohol yang paling sering digunakan dalam kehidupan sehari-hari. Etanol termasuk ke dalam alkohol rantai tunggal, dengan rumus kimia C2H5OH dan rumus empiris C2H6O. Ia merupakan isomer fungsional dari dimetil eter. Etanol banyak digunakan sebagai pelarut berbagai bahan-bahan kimia yang ditujukan untuk konsumsi dan kegunaan manusia. Contohnya adalah pada parfum, perasa, pewarna makanan, dan obat-obatan. 2. Pelarut Asam Organik Asam sitrat adalah asam organik yang banyak ditemukan pada buah-buahan dan sayuran. Konsentrasi tertinggi terdapat pada buah lemon dan jeruk nipis yaitu sekitar 8 % dari berat kering buah. Keasaman asam sitrat disebabkan karena tiga gugus karboksil (COOH) yang dapat melepaskan proton ke dalam larutan. Jika hal ini terjadi, ion yang dihasilkan disebut ion sitrat. Industri makanan dan minuman banyak menggunakan asam sitrat. Pemilihan jenis asam ini dikarenakan mampu memberikan penggabungan khas dari sifat-sifat yang diinginkan dan di pasaran tersedia dalam jumlah besar. Asam sitrat merupakan bahan tambahan pangan yang mempunyai fungsi bervariasi. Industri makanan dan minuman kebanyakan mengkonsumsinya untuk mempertegas flavor dan warna. Fungsi lainnya adalah mengontrol keasaman. pH yang tepat akan mencegah pertumbuhan mikroorganisme dan bertindak sebagai pengawet dan membantu mencegah terjadinya reaksi pencoklatan (Hui, 1992). Asam laktat (Nama IUPAC: asam 2-hidroksipropanoat (CH3-CHOHCOOH), dikenal juga sebagai asam susu) adalah senyawa kimia penting Hasil Identifikasi Pigmen Antosianin Bunga Mawar 35 dalam beberapa proses biokimia. Menurut Krisno (2002), asam laktat didefinisikan sebagai campuran dari asam laktat dan hibrida asam laktat yang mengandung tidak kurang dari 85% dan tidak lebih dari 92% asam laktat, prinsip utama pembuatan asam laktat dengan proses fermentasi adalah pemecahan laktosa menjadi bentuk monosakaridanya dan dari monosakarida tersebut dengan bantuan enzim yang dihasilkan oleh Lactobacillus sp, akan diubah menjadi asam laktat. Asam laktat (2-hydroxypropanoic acid) adalah asam hidroksi organik yang tersebar secara luas di alam, merupakan asam karboksilat dengan satu gugus hidroksil yang menempel pada rantai karbonnya. Dalam air, ia terlarut lemah dan melepas proton (H+), membentuk ion laktat. Asam ini juga larut dalam alkohol dan bersifat menyerap air (higroskopik). Asam ini memiliki simetri cermin (kiralitas), dengan dua isomer: asam L(+)-laktat atau asam (S)-laktat dan, cerminannya, asam D-(-)-laktat atau asam (R)-laktat. Hanya isomer yang pertama (S) aktif secara biologi. Asam laktat (lactic acid) adalah salah satu asam organik yang penting di industri, terutama di industri makanan. Asam laktat memiliki tingkat keasaman yang sederhana dibandingkan bahan pengasam makanan yang lain, rasa dan baunya tidak tajam dan dinyatakan sebagai bahan pengawet yang aman (GRAS, generally regarded as safe) oleh FDA di US (Vickroy, 1985). Karakteristik tersebut menyebabkan asam laktat sesuai untuk mengawetkan susu, daging, telur dan makanan laut. Industri makanan ternak menggunakan ammonium laktat sebagai supplement nitrogen karena terbukti lebih baik dibandingkan dengan sumber nitrogen non-protein lain (Dominguez et al., 2005). Penggunaan asam laktat sekarang lebih luas karena bisa dipakai sebagai bahan baku pembuatan polylactic acid, biodegradable plastics yang merupakan polimer dari asam laktat (Datta et al., 1995; Hofvendahl dan Hahn-Hagerdal 2000). Asam sulfat, H2SO4, merupakan asam mineral (anorganik) yang kuat. Zat ini larut dalam air pada semua perbandingan. Asam sulfat mempunyai banyak kegunaan dan merupakan salah satu produk utama industri kimia misalnya sintesis kimia, pemrosesan air limbah dan pengilangan minyak. Asam sulfat murni yang tidak diencerkan tidak dapat ditemukan secara alami di bumi oleh karena sifatnya yang higroskopis. H2SO4 anhidrat adalah cairan yang sangat polar. Ia memiliki tetapan dielektrik 36 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI sekitar 100. Konduktivitas listriknya juga tinggi. Hal ini diakibatkan oleh disosiasi yang disebabkan oleh swa-protonasi, disebut sebagai autopirolisis. Walaupun asam ini memiliki viskositas yang cukup tinggi, konduktivitas efektif ion H 3SO4+ dan HSO 4- tinggi dikarenakan mekanisme bolak-balik proton intra molekul, menjadikan asam sulfat sebagai konduktor yang baik. Ia juga merupakan pelarut yang baik untuk banyak reaksi. Reaksi hidrasi asam sulfat sangatlah eksotermik, sehingga apabila air ditambahkan ke dalam asam sulfat pekat, ia akan dapat mendidih dan bereaksi dengan keras. Reaksi yang terjadi adalah pembentukan ion hidronium: H2SO4 + H2O H3O+ + HSO4- HSO4- + H2O H3O+ + SO42- Karena hidrasi asam sulfat secara termodinamika difavoritkan, asam sulfat adalah zat pendehidrasi yang sangat baik dan digunakan untuk mengeringkan buah-buahan. Afinitas asam sulfat terhadap air sedemikian kuatnya sehingga dapat memisahkan atom hidrogen dan oksigen dari suatu senyawa. 3. Asam Klorida (HCl) Asam klorida adalah larutan akuatik dari gas hidrogen klorida (HCl). Ia adalah asam kuat, dan merupakan komponen utama dalam asam lambung. Senyawa ini juga digunakan secara luas dalam industri. Asam klorida harus ditangani dengan wewanti keselamatan yang tepat karena merupakan cairan yang sangat korosif. Hidrogen klorida (HCl) adalah asam monoprotik, yang berarti bahwa ia dapat berdisosiasi melepaskan satu H+ hanya sekali. Dalam larutan asam klorida, H+ ini bergabung dengan molekul air membentuk ion hidronium, H3O+ HCl + H2O H3O+ + Cl- Ion lain yang terbentuk adalah ion klorida, Cl-. Asam klorida oleh karenanya dapat digunakan untuk membuat garam klorida, seperti natrium klorida. Asam klorida adalah asam kuat karena dapat terdisosiasi penuh dalam air. Asam klorida sebagai campuran dua bahan antara HCl dan H2O mempunyai titik didih-konstan azeotrop pada 20,2% HCl dan 108,6°C. Dari tujuh asam mineral kuat dalam kimia, asam klorida merupakan asam monoprotik yang paling sulit menjalani reaksi redoks. Ia juga Hasil Identifikasi Pigmen Antosianin Bunga Mawar 37 merupakan asam kuat yang paling tidak berbahaya untuk ditangani dibandingkan dengan asam kuat lainnya. Walaupun asam, ia mengandung ion klorida yang tidak reaktif dan tidak beracun. Asam klorida dalam konsentrasi menengah cukup stabil untuk disimpan dan terus mempertahankan konsentrasinya. Oleh karena alasan inilah, asam klorida merupakan reagen pengasam yang sangat baik. B. Hasil Isolasi dan Identifikasi Pigmen Antosianin 1. Kandungan Kimia Mahkota bunga mawar (MBM) Mahkota bunga mawar (MBM) merah sebelum diekstrak dilakukan analisa kandungan kimia yang dominan terlebih dahulu. Secara lebih rinci analisa bahan baku mahkota bunga mawar varietas lokal dan hibrida meliputi analisa kadar air, kadar gula total, kadar vitamin C dan kadar minyak atsiri. Nilai reratanya dapat dilihat pada Tabel 5. Tabel 5 Nilai Rerata Kadar Air, Kadar Gula Total, Vitamin C dan Minyak Atsiri MBM Merah Kadar air yang terkandung dalam mahkota bunga mawar merah varietas lokal dan hibrida relatif sama yaitu masing-masing sebesar 83,32% dan 83,51%, sedangkan mahkota bunga mawar (MBM) Rosa chinensis mengandung air berkisar 65.21±0.66 (Ramamoorthy et al., 2010). Kandungan gula total yang dikandung MBM dua varietas sekitar 9,73-12,45%, sesuai pengamatan Saati dan Walyono, gula total MBM Hibrid Belanda sebesar 9,71-12,50 % sedangkan menurut Saat dan Mustofa (2008) gula total MBM Hibrid Belanda sebesar 8,3-8,9%. Terdapatnya kadar gula dalam pengamatan tersebut menunjukkan adanya indikasi ikatan glikosidik, yang menjadi salah satu karakter dari pigmen antosianin yaitu terdiri dari aglikon (sebagai antosianidin) dan 38 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI glikon sebagai senyawa gula yang diikatnya (Li, 2009; Hendry and Houghton, 1996). Hasil tersebut mendekati kandungan gula boysenberry berkisar antara 8,5-14,0%, yang terikat pigmen antosianin juga (Oregon, 2007; Jettanapornsumran, 2009). Varietas lokal Batu memiliki kandungan gula total yang lebih banyak yaitu 12,45±0,63 %, jauh lebih banyak dibanding dengan kadar gula total mahota bunga kana sebesar 3,2% (Saati dan Ragil, 2007), bunga pacar air hanya sebesar 2,75% (Saati, 2002), dan mahkota bunga mawar Rosa chinensis yang diteliti Ramamoorthy et al. (2010) mengandung karbohidrat (mengandung gula total) 6.5±0.22. Berarti mahkota bunga mawar lokal Batu mempunyai indikasi kandungan glikosida dan sumbangan rasa manis lebih banyak dibandingkan mahkota bunga lain tersebut. Kandungan vitamin C pada mahkota bunga mawar varietas hibrida mengandung 17,23 mg dan varietas lokal sebesar 015,69 mg/100g, sesuai dengan hasil pengamatan Blake (2004) bahwa bunga mawar mengandung vitamin C (0,5-2 mg/100g). Pada beberapa spesies seperti Rosa canina dan Rosa rugosa menghasilkan buah Rose hips yang sangat kaya dengan vitamin C (Anonim, 2006)a. Bau harum pada bunga mawar dikarenakan kandungan minyak atsirinya, yang mudah menguap/volatil (Lavid et al., 2002). Minyak atsiri tersebut mengandung zat sitral, sitronelol, geraniol, linalol, nerol, eugenol, feniletil alkohol, farnesol dan nonil aldehid. Pada penelitian ini diketahui bahwa kandungan minyak atsiri dari mahkota bunga mawar lokal Batu adalah sekitar 0,802 (%), sedangkan varietas Hibrid belanda 0,803 (%). Kandungan minyak sebesar 0,4-1% dari mawar varietas Rosa damascena Mill yang diperoleh dari kebun bunga di Iran (Loghmani et al., 2007). Blake (2004) juga menyatakan bahwa minyak atsiri yang terkandung pada bunga mawar sekitar 0,06-1,0% (citronellol, eugenol, asam galat dan linalool). Hasil analisa kimia tersebut sesuai pendapat Blake (2004) dan Saati (2010), bahwa komponen terbanyak dalam mahkota bunga mawar segar adalah kadar air (83-85%), vitamin C (0,5-2 mg), karoten, cyanins (antosianin), gula total 8-12 %, citronellol, eugenol, asam galat dan linalool. Perbedaan kandungan air, gula total, vitamin dan minyak atsiri tersebut disebabkan karena perbedaan jenis mawar, umur panen, kondisi/ umur bunga dan lingkungan/ekosistem, seperti yang dinyatakan Bkaton (2008), Joy et al. (1998) dan deMan (1999). Hasil Identifikasi Pigmen Antosianin Bunga Mawar 2. 39 Kualitas Pigmen Bubuk Analisa bubuk pigmen antara lain kadar air, pH, absorbansi, total padatan terlarut dan intensitas warna. Nilai rerata dapat dilihat pada Tabel 6. Tabel 6 Nilai Rerata Kadar Air, pH, Absorbansi dan Total Padatan Terlarut Pigmen Bubuk dari Ekstrak MBM Kadar air bubuk pigmen mawar varietas hibrida memiliki nilai rerata yang lebih tinggi yaitu sebesar 4,74% dibandingkan nilai rerata bubuk pigmen mawar varietas lokal sebesar 4,43%. Hal ini disebabkan bunga mawar varietas hibrida mempunyai struktur bunga yang lebih tebal dari pada bunga mawar varietas lokal sehingga penguapan kadar air relatif lebih terhambat. Sesuai dengan hasil penelitian (Markakis, 1982; deMan,1999 dan Laleh et al., 2006), yang menyatakan bahwa kandungan air maksimal jaringan tertentu dapat berbeda cukup besar karena adanya perbedaan struktural/molekuler dan kondisi tumbuhan. Penelitian Saati dan Mustofa (2008) menunjukkan bahwa jenis varietas mawar hibrida Belanda memiliki nilai rerata kadar air yang cukup tinggi yaitu 8,931% sedangkan nilai terendah terdapat pada perlakuan jenis varietas lokal dengan nilai sebesar 8,389%, disebabkan karena perbedaan penggunaan prosentase filler (20-30%) sehingga kadar airnya lebih banyak. Pengamatan pH bubuk pigmen mawar varietas lokal memilki nilai rerata pH yang lebih tinggi yaitu sebesar 2,98 dibandingkan nilai rerata pH bubuk pigmen mawar varietas hibrida sebesar 2,73. Nilai pH tersebut lebih asam dibandingkan pengamatan Saati dan Mustofa (2008), yaitu sekitar 3,32. Biolley dan Jay (1993) menyatakan bahwa pH mahkota bunga mawar (bagian epidermis luar) berkisar antara 3,6-5,4. Hal ini 40 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI disebabkan karena adanya penambahan asam sitrat pada saat ekstraksi, yang merupakan asam organik kuat (Mulyono, 2005) dengan konstanta disosiasi pKa 3,14 sehingga mampu mempengaruhi kondisi pelarut air menjadi asam. Pengamatan absorbansi dilakukan untuk mengetahui indikasi keberadaan komponen pigmen antosianin. Rerata absorbansi bubuk pigmen mawar Hibrid Belanda lebih tinggi yaitu sebesar 0,123 dibandingkan bubuk pigmen varietas lokal Batu sebesar 0,084 (pengenceran 100x). Hal ini dipengaruhi oleh tingkat kemerahan MBM bunga mawar Hibrid berwarna merah kehitaman (lebih pekat merahnya) dan lokal Batu berwarna merah. Perbedaan nilai absorbansi tersebut disebabkan adanya perbedaan faktor genetik dari varietas bunga mawar, seperti pendapat Henry dan Houghton (1996) serta Anonim (2006)b. Hal ini juga dipengaruhi nilai pH produk pigmen, semakin rendah nilai pH maka pigmen makin stabil (Nollet, 1996; Rein, 2005), sehingga nilai absorbansi bubuk pigmen varietas Hibrid Holand (Belanda) relatif lebih tinggi. Tabel 7 Nilai Rerata Intensitas Warna (Tingkat Kecerahan, Kemerahan, Kekuningan) Bubuk Pigmen Lokal Batu dan Hibrid Holand Total padatan terlarut (TPT) bubuk pigmen mawar varietas lokal memiliki nilai rerata yang lebih tinggi yaitu sebesar 8,33°Brix dibandingkan mawar varietas hibrida sebesar 7,67°Brix. Hasil analisa tersebut sesuai nilai TPT MBM varietas hibrid (bahan baku) lebih kecil (7,67°Brix) dari pada mawar varietas lokal (8,33°Brix), mendekati total padatan terlarut pada boysenberry yang berkisar antara 8,82-11,2°Brix (Oregon, 2007; Jettanapornsumran, 2009), lebih rendah dari wortel hitam yaitu sebesar 11,9±0,14°Brix (Ersus dan Yurdagel, 2006). Hal ini disebabkan karena perbedaan varietas dan perbedaan tempat tumbuh (Joy et al., 1998; Tranggono, 1990), dan dipengaruhi perbedaan total padatan terlarut (Budiarto, 1991). Sebagaimana hasil penelitian dari Walyono (2007), bahwa kandungan gula total bunga mawar segar varietas hibrid sebesar 9,71%, mawar lokal sebesar 10,99%. Daftar Pustaka 75 DAFTAR PUSTAKA Andersen, Ø. M. , T. Fossen.2003. Characterization of Anthocyanins by NMR Current Protocols in Food Analytical Chemistry. F1. 4.1-F1.4.23 Anonim. 1996. Undang-undang RI Nomor 7 Tahun 1996 Tentang Pangan. PT. Sinar Grafika. Jakarta. Anonymous. Anthocyanin www.charlies.web.com AOAC - Association Of Official Analytical Chemists. Official Methods of Analysis. 65 ed. Washington, 1998. 1070 p Charley, H. 1970. Food Science. New York: John Willey and Sons Inc. __________. Where Does the Color Come from in Purple Cabbage? www.howstuffworks.com Barczak, Anna B. 2005. Acylated anthocyanins as stable, natural food colorants- A Riview. Pol. J. Food Nutr. Sci. Vol. 14/55, No 2 : 107-116 Barnes, Jeremy S, H.P. Nguyen, S. Shen, K.A. Schug. 2009. General method for extraction of blueberry anthocyanins and identification using high performance liquid chromatography–electrospray ionization-ion trap-time of flight-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216: 4728–4735 Biolley, J.P.,M. Jay. 1993. Anthocyanins in Modern Roses: Chemical and Colorimetric Features in Relation to the Colour Range. Journal of Experimental Botany. Volume 44 (11) : 1725-1734 75 76 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Blake, Steve. 2004. Medicinal Plant names, Sample expert, Artikel, http: www.NaturalHealthWizardCom./MedicinalPlantNames, Sample.html.pdf tanggal akses 12 Agustus 2010. Borzelleca, J.F. and Hallagan, J.B.1992. Safety and Regulatory Status of Food, Drug, and Cosmetic Color Additives. American Chemical Society. Chan, S.W., C.Y. Lee, C.F. Yap, W.M. Wan Aida, and C.W. Ho, 2009. Optimation of Extraction Condition for Phenolic Compounds from Limau Purut (Citrus hystrix) Peels. International Food Research Journal 16 : 203-213. Dangles, O. and Brouillard, R.1992. Polyphenol interactions. The copigmentation case: thermodynamic data from temperature variation and relaxation kinetics. Medium effect. Can. J. Chem. Vol. 70 : 2174-2190 De Man, J.M. 1997. Kimia Makanan (terjemahan Kosasih). ITB. Bandung. Depkes Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM). 2006. Laporan Survey Tahun 2002-2005. DEPKES RI. Jakarta Dewanti, T., Widya D.R., Imelda, Yunanto. 2003. Potensi Antosianin Pada Ubi Ungu Jepang Dan Pemanfaatannya Sebagai Bahan Pangan Fungsional. Proseding Seminar Nasional PATPI di Yogyakarta, pada 22-23 Juli 2003. Dewanti. 2006. Pangan Fungsional. Diktat Jurusan THP-FTP Universitas Brawijaya Malang. Dimitri, J.M.Markovi, U.B.Mio, J.Baranac, Z.P. Nedi. 2001. A study of the IR spectra of the copigments of malvin chloride with organic acids. J.Serb.Chem.Soc. 66(7) : 451–462 Duh, P.D. 1998. Antioxidant activity of Burdock (Artium lappa Linne): Its scavenging effect on free-radical and active oxygen. JAOCS Vol 75 (4): 455-461. Eskin, N. A. M. 1979. Plant Pigments, Flavours and Textures. Academic Press. New York Fabre CE, Santerre AL, Loret MO, Baberian RA., Goma G, Blanc PJ. 1993. Production and food application of the red pigments of Monascus rubber. J Food Science;58:1099-1102. Fazeelat. T., W. Afzal, M. Asif, M. Zamer, H. Saleem. 2007. HPLC analysis of strawberry anthocyanins of partially ripe and ripe levels. J Chem soc Park (29) 3 : 243-246. Daftar Pustaka 77 Fox, Gregory J. 2009. United States Patent 6132791: Natural red sunflower anthocyanin colorant with naturally stabilized color qualities, and the process of making. Frank T, Netzel M, Strass G, Bitsch R, Bitsch I. 2003. Bioavailability of anthocyanidin-3-glucosides following consumption of red wine and red grape juice. Can J Physiol Pharmacol.(81):423–35. Freedman, L. & F. J. Francis. 1984. Effect of Ascorbic Acid pada Color of jellies Departemen Ilmu Pangan & Gizi, Univ. Massachusetts, Amherst, MA Heublein Inc, Hartford, CT 06101. Kontribusi No 2646 dari University of Massachusetts Agricultural Experiment Station.Institute of Food Technologists Francis, F.J. 1982. Analysis of Anthocyanins. Di dalam Markakis, P., (ed). Anthocyanin as Food Colors. Academic Press. New York. Francis, F. J. 1999. Analysis of Anthocyanins. Academic Press. New York, pp 67. Harborne, J.B. 1994. The Flavonoids: Advances in Research Since 1986. London: Chapman and Hall. Harborne, J.B. and Williams, C.A. 2000. Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry, 55, 481–504. Garcia, J.A.O., Wall, M.M., and Waddell, C.A., 1997. Natural Antioxidant of Preventing Color Loos in Stored Paprika. J. Food Sci. 62. 1917-1021. Garrote,G., J.M. Cruz, A. Moure, H. Domý´ nguez and J.C. Parajo. 2004. Antioxidant activity of byproducts from the hydrolytic processing of selected lignocellulosic. materials. Int.. J. Food Sci. & Tech. 15 : 191-200 Garz’on, G.A. K.M. Riedi, and S.J. Schwartz. 2009. Determination of Anthocyanins, Total Phenolic Content, and Antioxidant Activity in Andes Berry (Rubus glaucus Benth). J. Food Sci. Vol. 74, Nr. 3, 2009: 227-232 Gizir, A.M., N. Turker, E. Artuvan.2007. Pressurized acidified water extraction of black carrot [Daucus carota ssp. sativus var. atrorubens Alef.] anthocyanins European Food Research and Technology, Volume 226 (3) : 363-370. Published online: 16 January 2007, Springer-Verlag. Guillotin,S, P. Sanoner, C.M.G. C. Renard. 2009. Stabilisation of the colour of anthocyanins in solutions by admixture with phytocomponents from apple. Journal of Horticultural Science & Biotechnology (ISAFRUIT Special Issue): 96-99 78 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Gulcin, Ilham. 2005. The antioxidant and radical scavenging activities of black pepper (Piper nigrum) seeds. Faculty of Science and Arts, Department of Chemistry, Atatu¨rk University, TR-25240, Erzurum, Turkey. International J. Food Sci. and Nutrition, November 2005; 56(7): 491-499 Hatano T., H. Kagawa, Yasuhara, and T. Okuda. 1998. Two new flavonoids and other contituents in licorice root: their relative astringency and radical scavenging effects. Chem Pharm Bull 36:2090-7. Harborne, J.B., and Swain, T., 1969. Perspective in Phytochemistry. Academic Press., London. Hartati, S., Hanafi, M. 2001. Reduksi, Esterifikasi Kalanon dan Uji Aktivitas Biologinya. Proseding Seminar Nasional X “ Kimia dalam Industri dan Lingkungan”. Hotel Santika Yogyakarta, 6-7 November 2001 Hasler, Clare M. 2000. Journal of the American College of Nutrition, Vol. 19, No. 90005, 499S-506S: The Changing Face of Functional Foods. Functional Foods for Health Program, University of Illinois, Urbana, Illinois Henry, G.A.F., and J.D. Houghton. (1996) Natural Food Colorants. Two Edition. Blackie Academic and Profesional. London. Hou, D.X, Fujii, M., Terahara, N., Yoshimoto, M. 2004. Do Anthocyanins Contribute to Cancer Prevention?- Introduction to Molecular Evidence. Proceedings Third International Workshop on Anthocyanins - IWA2004, 27-29 January 2004, Sydney, Australia : Anthocyanins - more than nature's colours. Cooperative Research Centre for Bioproducts. Food Science Australia. Hudson, T.S., D.K.Hartle, S.D Hursting, N.P Nunez, T.T.Y Wang,.H.A.Young, P. Arany, and J.E. Green 2007. Inhibition of prostate cancer growth by muscadine grape skin extract and resveratrol through distinct mechanisms. Cancer Res. 67: 8396-8405. Hui. 2006. Food Biochemistry and Food Processing. Australia: Blackwell Publishing. Hwa Jung, Chang, Ho-Moon Seog,_In-Wook Choi, Mee-Weon Park, Hong-Yon Cho. 2005. Antioxidant properties of various solvent extracts from wild ginseng leaves. LWT 39 (2006) 266–274. html: www.elsevier.com/locate/lwt.pdf Daftar Pustaka 79 Intelisano, J. (USA) Patent No. 6440448. I Additives, Supplements, Antioxidants and Phytochemicals : Food supplement/herbal composition for health enhancement then be combined with an oil-slurried mineral. New Patents /Trends in Food Science & Technology 13 2002:188–189 Ito,D., Y. Shinkai, Y. Kato, T. Kondo, K. Yoshida. 2009. Chemical Studies on Different Color Development in Blie- and Red- Colored Sepal Cells of Hydrangea macrophylla. Biosci. Biotechnol. Biochem 73(5): 1054-1059. Jin-Ming Konga, Lian-Sai Chiaa, Ngoh-Khang Goha, Tet-Fatt Chiaa, R. Brouillard. 2003. Analysis and biological activities of anthocyanins. Phytochemistry 64 : 923–933 Jenie, B.S.L., Helianti dan S. Fardiaz. (1994) Pemanfaatan Ampas Tahu, Onggok dan Dedak untuk Produksi Pigmen Merah oleh Monascus purpureus. Buletin Teknologi dan Industri Pangan (5) : 22-29. Joshi P, CJB Brimelow. 2002. Colour Measurement of Foods by Colour Reflectance. Di dalam: D.B. MacDougall (ed). Colour in Food: Improving Quality. Washington: CRC Press. Karoui, Romdhane & C.Blecker.2010. Fluorescence Spectroscopy Measurement for Quality Assessment of Food Systems-a Review. Food Bioprocess Technol.DOI 10.1007/s11947-010-0370-0.Pp23 Kim, Min-Kyoung, Han-ah K., K.Koh, Hee-Seon K., Y.S.Lee,Yong H. K. 2008. Identification and quantification of anthocyanin pigments in colored rice. Nutrition Research and Practice 2(1) : 46-49 King, J.W., R.D. Grabiel, J.D.Wightman. 2003. Subcritical Water Extraction of Anthocyanins from Fruit Berry Substrates. Supercritical Fluid Facility, Los Alamos National Laboratory, C-ACT Group, Chemistry Division, Mail Stop E-537, Los Alamos, NM 87545 USA. 2Artemis International, Inc. 93 18 Airport Drive, Fort Wayne, IN 46809 USA.pp 10. Kowska-Barczak, A.B. 2005. Acylated Anthocyanins as Stable, Natural Food Colorants-A Review. Pol. J. Food Nutr. Sci. Vol. 14/55, ( 2) : 107–116 Laleh. G.H., H. Frydoonfar, R. Heidary, R. Jameei and S. Zare. 2006. The Effect of Light, Temperature, pH and Species on Stability of Anthocyanin Pigments in Four Berberies Species. Pakistan Journal of Nutrition 5 (1) : 90-92, ISSN 1680-5194. 80 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Lestario, L.N., Suparmo, Sri Raharjo, Tranggono. 2006. Perubahan Aktivitas Antioksidan, kadar Antosianin dan Polifenol pada beberapa Tingkat Kemasakan Buah Duwet (Syzygium cumini). Agritech Vol.25. No.4: 169-172. Lewis, C.E., Walker, J.R.L., dan Lancaster, and J.E. 1997. In Bridle, P. and Timberlake, C.F. Anthocyanin as Natural Food colours - Selected Aspects. Food Chemistry. Vol. 58, pp 103 - 109. Loghmani, H. Khouzani, O. Sabzi Fini1, J. Safari. 2007. i1 Essential Oil Composition of Rosa damascena Mill Cultivated in Central Iran. Scientia Iranica, Vol. 14, No. 4, pp 316-319. Lopes da Silva, Fatima, Mar?´a T.E.B., Jose´ J.P.A.,Julia´,C. R.Gonzalo, C.S. Buelga. 2007. Anthocyanin pigments in strawberry. LWT 40 : 374–382. Lopes, Daise.L., J. Dettmann, C. Nimalaratne, A.Schieber. 2010. Characterization and Quantification of Polyphenols in Amazon Grape (Pourouma cecropiifolia Martius). Molecules (15) : 8543-8552. Li, J. 2009. Total anthocyanin content in blue corn cookies as affected by ingredients and oven types. Disertation. Department of Grain Science and Industry College of Agriculture. Kansas University. Manhattan, Kansas. Maga and Anthony. 1994. Food Additive Toxicology. Universitas Fort Collen Colorado. Maier, Thorsten, M. Fromm, A. Schieber, D.R. Kammerer, R.Carle. 2009. Process and storage stability of anthocyanins and non-anthocyanin phenolics in pectin and gelatin gels enriched with grape pomace extracts. Eur Food Res Technol : 229:949–960. DOI 10.1007/s00217-009-1134-9 Markakis P. 1982. Anthocyanin as Food Colors. New York: Academis Press. Markakis,P.1982. Stability of anthocyanin in foods. In P Markakis (Editor). Anthocyanin as food color. New York: Academic Press. pp. 163-18) Miyake, Y., Yamamoto, K. Tsujihara, N., and Osawa, T., 1998. Protective Effect of Lemon Flavonoids on Oxidative Stress in Diabetic Rats. Lipid, 33 : 689– 695. Mortensen, Alan.2006. Carotenoids and other pigments as natural Colorants. Pure Appl. Chem., Vol. 78, No. 8 : 1477–1491. Daftar Pustaka 81 Moss, B.W. 2002. The Chemistry of Food Colour. Di dalam: D.B. MacDougall (ed). Colour in Food: Improving Quality. Washington: CRC Press. Mulyanto, E. 2006. Ekstraksi, Identifikasi dan Aplikasi Pigmen Arbei (Fragaria vesca) pada Bolu Kukus. Skripsi. Jurusan Teknologi Hasil Pertanian. Fakultas Pertanian. Universitas Muhammadiyah Malang. Malang Mullen, William, S. Larcombe, K. Arnold, H. Welchmanm A. Cozier. 2010. Use of Accurate Mass Full Scan Spectrometry for the Analysis of Anthocyanins in Berries and Berry-Fed Tissues. J.Agric.Food Chen (58) : 3910-3915. Nollet, L.M.L. 1996. Hand Book of Food Analysis. Two Edition. Marcel Dekker, Inc. New York. Nuance. All rights reserved. 2009. What is FT-IR? Northwestern University, 2220 Campus Drive #2036, Evanston, IL 60208-3108 Phone: 847-4672318, Fax: 847-467-6573. Email questions to: [email protected]. tanggal akses 16 September 2010. Nugrahaningsih. 2002. Ekstraksi Pigmen Klorofil dari Daun Suji. Tesis. Program Studi THP Pasca Sarjana, Universitas Brawijaya. Malang Nyman and Kumpulainen. 2001. Extraction Pigment Anthocyanins. J.Agric. Food Chem., Vol.49, No.9. Pramono, B. 2007. Ekstraksi Pigmen Buah Arbei (Fragaria vesca) dan Uji Stabilitasnya Antioksidannya terhadap Pemanasan. Skripsi. Jurusan Teknologi Hasil Pertanian. Fakultas Pertanian. Universitas Muhammadiyah Malang. Malang Prior RL, Cao G, Martin A, Sofic E, McEwen J, O’Brien C, Lischner N, Ehlenfeldt M, Kalt W, Krewer G, Mainland CM. 1998. Antioxidant capacity as influenced by total phenolic and anthocyanin content, maturity, and variety of Vaccinium Species. J Agric Food Chem 46:2686-2693. Prior RL, Cao G.2000. Antioxidant phitochemicals in fruit and vegetables : diet and health implications. Hort Science. 35 (4) ; 588-592. Pryzybiyski R., Lee, Y.C., Eskin, and Nia, M., 1998. Antioxidant and Radical Scavenging Activities of Buckwheat Seed Component. JAOCS. 75 : 1595 – 1601. Raminez-Tortosa, C., Yvind M. A., Peter T. Gardner, Philip C. M.; Sharon G. W., Susan J. D., Andrew R. C., and Garry G. D. 2001. Anthocyanin_Rich Extract decreases indices of lipid peroxidation and 82 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI DNA damage vitamin E-depleted rats. Antioxidants and DNA Damage Group. Jurnal Biology & Medicine, Vol. 31, No. 9 (2001), pp. 1033–1037 Ramamoorthy, K.. S. Bhuvaneswari, G. Sankar and K. Sakkaravarthi. 2010. Proximate Composition and Carotenoid Content of Natural Carotenoid Sources and its Colour Enhancement on Marine Ornamental Fish Amphiprion ocellaris (Cuveir 1880). World Journal of Fish and Marine Sciences 2 (6): 545-550. Rein, Maarit. 2005. Copigmentation reactions and color stability of berry anthocyanins. Food Chemistry Division. Department of Applied Chemistry and Microbiology . University of Helsinki. Helsinki Ricter, P., M.I. Toral, and C. Roledo, 2006. Subcritical Water Extraction and Determination of Nifedipine in Pharmaceutical Formulation. Drugs, Cosmetics, Forensic Sciences. J. Of AOAC Internadtional. Vol. 89, No.2. Rukmana, R. 1995. Mawar. Penerbit Kanisius. Yogyakarta. Saati, E.S. 2005. Pemanfaatan Kekayaan Hayati/Bunga lokal (mawar, kana dan pacar air) sebagai Zat pewarna dan Antioksidan alami pada Makanan. Proseding. Disampaikan pada Seminar Kimia Nasional 3 Pebruari 2005 di Universitas Surabaya (Unesa). Saati, E.S., Moch. Wachid. 2006. Penggunaan Pigmen Antosianin Bunga Mawar Sortiran untuk Pewarna dan Penghambat Kerusakan Lemak pada Pangan Fermentasi. Disampaikan pada Seminar Nasional PATPI 2-3 Agustus 2006, di FTP UGM, Yogyakarta. Saati, E. S., Mujianto, Susestyarini, R.E. 2006; 2007. Optimalisasi Fungsi Ekstrak Bunga Kana (Canna sp) sebagai Zat Pewarna dan Antioksidan Alami melalui Isolasi dan Karakterisasi. Laporan Fundamental Research. DP3M-DIKTI. Saati, E.S. 2006. Pendaftaran Paten No. P00200700089 : Bahan Pewarna Alami dari Bunga Kana Merah Untuk Produk Minuman. Oleh DIKTI –DP2M. Saati, E.A., Ragil. 2007. Uji Stabilitas Antioksidan Pigmen Bunga Kana Merah dan Kuning (Canna coccinea. Makalah dimuat dalam Proseding Semnas Pigmen) “Back to Nature dengan Pigmen Alami” di Salatiga 24 Agustus 2007. Daftar Pustaka 83 Saati, E.A. 2010. The test powder quality of anthocyanins pigments Red Roses (Rosa sp.) from three varieties. Proc. International Seminar "Biotechnology" and Conggres. 20 Agustus 2010. UMM. Malang ________ dan I. R. Agustin. 2010. A study on Making Effervescent Tablets Using The Pigment Exatract of Red Roses (Rosa sp) : A Study on flower colors and Types of Sugars). Proseding : Natural Pigments Conference for South-East Asia (NP-SEA) di Machung University Malang, 20- 22 March 2010. ________, Theovilla, Simon BW., Aulanni'am, Yunianta. Optimali Fungsi Pigmen Bunga Mawar Sortiran sebagai Zat pewarna alami dan Bioaktif pada beberepa Produk Industri. Jurnal Terakreditasi Teknologi Industri UMM. Volume 12 nomor 2 tahun 2011. ________dan R. Aisyah. 2011. Laporan PHB Lanjutan : Formulasi Tablet Effervescent Pigmen Mawar Merah (Rosa sp) Kaya Antioksidan dari Tiga Varietas Bunga. DP2M DIKTI tahun 2011-2012. ________, Simon BW., Yunianta. 2011. Isolation of Red Rose Anthocyanin Pigment and Its Application to inhibit Lipid Oxidation in Yoghurt. Journal of Agricultural Science and Technology A 1: ISSN 1939-1250 ________. 2012. Potensi pigmen antosianin bunga mawar (Rosa sp.) lokal Batu sebagai pewarna alami dan komponen bioaktif produk pangan. Disertasi. Program pasca sarjana/Doktor PPS UB. Ilmu Pertanian, Minat Teknologi Hasil Pertanian. Malang Saati, E.S., Granted Sertifikat No IDP000034662. Invensi: Bahan Pewarna Alami dari Bunga Mawar Merah Untuk Produk Minuman, DP2MDIKTI, 2013. Saati, E.S, Moch.Wachid, Sri WinarsihLaporan Hasil Penelitian PUPT (Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi) Universitas Muhammadiyah Malang, bekerjasama dengan DP2M DIKTI RI,. 2012. Saati, E. S dan R.E. Susestyarini, Peningkatan Stabilitas Pigmen antosianin Bunga Mawar merah lokal Batu melalui Kogmentasi guna mendukung penyediaan Food aditif alami dan pangan fungsional, Laporan Hibah Kompetensi (HIKOM), DP2M-DIKTI, 2014. ________, M. Wachid.. 2012. Laporan PUPT : Identifikasi dan Karakterisasi Pigmen Hasil Eksplorasi Kekayaan Hayati Lokal sebagai Pengganti Pewarna Berbahaya Rodhamin B guna Menunjang Ketersediaan Pangan yang Sehat dan Aman. DP2M DIKTI tahun 2012-2015. 84 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Sari Puspita, A Fitriyah, K Mukhamad, Unus, F Mukhamad, L Triana. 2005. Ekstraksi dan stabilitas antosianin dari kulit buah duwet (Syzigium cumini). Jurnal Teknol dan Industri Pangan Vol.XVI No. 2 Th 2005. Satyatama, D.I. 2008. Pengaruh Kopigmentasi Terhadap Stabilitas Warna Antosianin Buah Duwet (Syzygium cumini). Tesis. Pascasarjana. IPB. Bogor. Silverstein, R.M dan Bassaker, G.C. 1967. Spectromtric identification of organic coumpounds. 2nd Ed. John Wiley & Sons, Inc. Soni, A.,V. Kumar Dwivedi.Kailash Malik, and M. Chaudhary. 2009. Comparative Antioxidant Level in Renal and Liver Tissues of Mice Treated with Fixed Dose Combination of Cefepime-Amikacin Reconstituted in Solvent vs Water for Injection. J Current Drug Therapy 4:174-178 Stanciu, Gabriela, S. Lupsora, C. Sava. 2009. Spectrophotometric characterizations of anthocyans extracted from black grapes skin. Ovidius University Annals of Chemistry Volume 20 (2) : 205-208. Department of Chemistry, Pharmacy, Ovidius University of Constantza, Romania Susanto, T. 2002. Peran perguruan Tinggi dalam Meningkatkan Ketangguhan Industri Pangan Di Era Pasar bebas. Proseding Seminar Nasional dan Konggres PATPI di Batu, Malang 30-31 Juli 2002 S.W. Wu, C. Ford, G. Horn, Patent application number: 20090246343: Stable Natural Color Process, Products and Use Thereof, 2009, p. 58. Taslam, H. 2005. Mengenal Keanekaragaman Hayati. Proseding Seminar Nasional dan Konggres PATPI di FTP Universitas Gajah Mada. Yogyakarta. Tanaka, Yoshikazu, N. Sasaki, A. Ohmiya. 2008. Harnessing plant biomass for biofuels and biomaterials : Biosynthesis of plant pigments: anthocyanins, betalains and Carotenoids. The Plant Journal (54): 733-749 Tanaka, Yoshikazu, Filippa Brugliera and Steve Chandler. 2009. Recent Progress of Flower Colour Modification by Biotechnology. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 5350-5369; doi:10.3390/ijms10125350 html: www.mdpi.com/journal/ijms. International Journal of Molecular Sciences. ISSN 1422-0067. Daftar Pustaka 85 Thermo Nicolet Corp. 2001. Introduction to Fourier Transform Infrared Spectrometry. 5225 Verona Road • Madison, WI 53711-4495 • U.S.A. TEL: 800-201-8132, 608-276-6100. html: www.thermonicolet.com. Tanggal akses 16 September 2010 Tiwari B.K., C.P. O’Donnell and P.J. Cullen. 2009. Effect of non thermal Processing technologies on the anthocyanin content of fruit juices. Biosystems Engineering, UCD School of Agriculture. School of Food Science and Environmental Health, College Dublin Institute of Technology, Dublin 1, Ireland. Food Science and Veterinary Medicine, University. Food Science & Technology 20 (2009) 137e145 Ueyama, Yukiko, Y. Katsumoto, Y. Fukui, M. Fukuchi-Mizutani, H. Ohkawa, T. Kusumi, T. Iwashita, Y. Tanaka. 2006. Molecular characterization of the flavonoid biosynthetic pathway and flower color modification of Nierembergia sp. Plant Biotechnology 23, 19–24 Vankar, P.S., D. Bajpai. 2010. Rose anthocyanins as acid base indicator. Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry/ EJEAFChe, 9(5):875-884. Veigas, J.M, M.S. Narayan, P.M. Laxman,B.Neelwarne.2007. Chemical nature, stability and bioefficacies of anthocyanins from fruit peel of syzygium cumini Skeels. J. Food Chemistry 105 (2007) 619–627 Williams,M. and G. Hrazdina. (1979) Anthocyanin as Food Colorants: Effect of pH on The Formation of Anthocyanin-Rutin Complexes. J. Food Sci. 44 (1): 66-58. Winarno, F.G. 2004. Kimia Pangan dan Gizi. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta Wu, Shaowen, C. Ford and G. Horn. 2009. Patent application number: 20090246343: Stable Natural Color Process, Products and Use Thereof Wu, X., Prior, R.L. 2005. Identification and characterization of anthocyanins by high performance liquid chromatography-electrospray ionizationtandem mass spectrometry in common foods in the United States: vegetables, nuts and grains. J. Agr. Food Chem. (53) : 3101-3113. Wrolstada, R. E., R. W. Dursta, J. Leeb. 2005. Tracking color and pigment changes in anthocyanin products. Department of Food Science and Technology, Oregon State University, Corvallis, USA, and USDAARS, HCRL, Parma Research and Extension Center of I Lane, Parma, USA. Food Science & Technology (16) : 423-428. 86 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI Yokoyama, Isao and Ono, Takeshi. 2006. United States Patent 4302200: Process for extracting anthocyanin-type colors from natural products. Yu, Liping. 1998. Osmotic-Air Dehydration of Chermes Am Blueberries. Thesis. Department of Biosystems Engineering University of Manitoba Winnipeg, Manitoba. Na tional Library ofCanada. pp 124 Yue X. and Z. Xu. 2008. Changes of Anthocyanins, Anthocyanidins, and Antioxidant Activity in Bilberry Extract during Dry Heating. Jurnal: Food Chemistry, Vol. 73, Nr. 6, 2008 Zhang,W., F. Han, J. He and C. Duan. 2008. HPLC-DAD-ESI-MS/MS Analysis and Antioxidant Activities of Nonanthocyanin Phenolics in Mulberry (Morus alba L.). J. Food Sci.Vol. 73, Nr. 6, 2008 : 512-518 Yang, Zhendong, W. Zhai.2010. Identification and antioxidant activity of anthocyanins extracted from the seed and cob of purple corn (Zea mays L.). Innovative Food Science and Emerging Technologies 11: 169-176 Lampiran 87 LAMPIRAN Yogurt Permen Jelly Sari dan Sirup Bunga Mawar Gambar 20. Aplikasi Pigmen Antosianin pada Beberapa Produk Pangan A B ( 2 Ulangan) Gambar 21. Bubuk Pigmen (A) dan Tablet Effervescent (B) dari Pigmen MBM Lokal Batu a. Tablet Effervescent: 3 level dosis (1/4, ½ dan 1 tablet /hari), 1 tablet=5 g 88 PIGMEN ANTOSIANIN: IDENTIFIKASI DAN MANFAATNYA BAGI INDUSTRI MAKANAN DAN FARMASI b. Pigmen Siap Injeksi c. Penandaan Tikus d. Pembedahan Tikus Gambar 22. Tahapan Pengujian SGPT & SGOT pada Tikus Lampiran 89 Gambar 23. Pengamatan Frekuensi Gelombang Gugus Fungsi dalam Pigmen MBM (fraksi I, II, ekstrak, & bubuk pigmen) Analisa FTIR