struktur gen dan fungsinya

STRUKTUR GEN
DAN
FUNGSINYA
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Gradien perkembangan bioteknologi (Doyle dan
Presley, 1996 dimodifikasi Gunadi 2003)
Peningkatan biaya
Bioteknologi moderen
Genomik
Rekayasa genetika hewan
Rekayasa genetika tanaman
Rekayasa genetika mikroba
DNA Rekombinan
Produksi antibodi monoklonal
Transfer embrio pada hewan
Kultur jaringan
Pengendalian hayati
Pupuk hayati
Biodekomposer
Fermentasi mikroba
Bioteknologi tradisional
Peningkatan efisiensi
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Tabel 1.1. Perkembangan bioteknologi tanaman sejak
abad ke 20 (Chawla, 2002, dimodifikasi)
No.
Tahun
Invensi
Inventor
1.
1902
Percobaan pertama kultur jaringan
Haberlandt
2.
1904
Percobaan kultur embrio tanaman kubis-kubisan
(Cruciferae)
Hannig
3.
1922
a. Perkecambahan asimbiotik benih anggrek secara in
vitro
b. Kultur ujung akar secara in vitro
Knudson
Robbins
4.
1925
Penggunaan teknik kultur embrio dalam persilangan
interspesifik tanaman Linum
Laibach
5.
1934
a. Kultur in vitro jaringan kambium beberapa jenis pohon
dan perdu, meskipun gagal dalam pembelahan sel yang
berkelanjutan
b. Keberhasilan kultur akar tomat
Gautheret
White
6.
1939
Keberhasilan penumbuhan kultur kalus
Gautheret,
Nobecourt,
and White
7.
1940
Kultur in vitro jaringan kambium Ulmus untuk mempelajari
pembetukan pucuk tambahan
Gautheret
No.
Tahun
Invensi
Inventor
8.
1941
a. Penggunaan air kelapa pertama kali yang
mengandung faktor pembelahan sel pada Datura
b. Kultur in vitro jaringan crown gall
van Overbeek
Braun
9.
1944
Pembentukan akar tambahan tanaman
tembakau secara in vitro
Skoog
10.
1946
Pembentukan tanaman Lupinus dan
Tropaeolum melalui kultur ujung akar
Ball
11.
1950
Regenerasi organ dari jaringan kalus Sequoia
sempervirens
Ball
12.
1952
a. Penggunaan kultur meristem untuk
memperoleh tanaman dahlia bebas virus
b. Aplikasi pertama cangkokan mikro
(micrografting)
Morel dan Martin
13.
1953
Produksi kalus haploid tanaman gymnospermae
Ginkgo biloba dari serbuk sari (polen)
Tulecke
14.
1954
Tanaman pertama dari sel tunggal
Muir et al
No.
Tahun
Invensi
Inventor
15.
1955
Penemuan kinetin sebagai hormon pembelahan
sel
Miller et al.
16.
1957
Penemuan pengatur pembentukan organ melalui
prubahan perbandingan auksin : sitokinin
Skoog dan Miller
17,
1958
Regenerasi embrio somatik nucellus dari ovul
Citrus secara in vitro
Maneshwari dan
Rangas-wamy
18.
1959
a. Regenerasi embrio dari gumpalan kalus dan
suspensi sel wortel (Daucus carota)
b. Publikasi pertama buku panduan mengenai
kultur jaringan tanaman
Reinert, Steward
19.
1960
a. Keberhasilan pertama fertilisasi Ppapaver rhoeas
dalam test tube
b. Penggunaan metoda mikrokultur untuk
menumbuhkan sel tunggal dalam tetesan bergantung
(hanging drops) dalam medium yang terkondisi
c. Perombakan dinding sel secara enzimatik untuk
memperoleh protoplas dalam jumlah banyak
d. Filtrasi suspensi sel dan isolasi sel tunggal
melalui cawan tuang (plating)
Kanta
Jones et al.
Cocking
Bergmann
20.
1962
Pengembangan medium nutrisi Murashige dan
Skoog
Murashige dan
Skoog
21.
1968
Meslson dan Yuan
Meslson dan Yuan
22.
1970
a. Seleksi mutan biokimia secara in vitro melalui
penggunaan kutur jaringan yang menghasilkan
keragaman
b. Keberhasilan pertama fusi protoplas
c. Penemuan pertama endonuklease restriksi dari
Haemophillus influenzae Rd., kemudian dimurnikan
dan dinamakan HindII
Carlson
Power et al.
Smith
23.
1971
a. Penyiapan peta restriksi pertama menggunakan
enzim HindII untuk memotong DNA sirkular dari SV 40
menjadi 11 fragmen yang spesifik
b. Regenerasi tanaman pertama dari protoplas
Nathans
Takebe et al.
24.
25.
1972
1973
a. Laporan pertama mengenai hibridisasi interspesifik melalui
fusi protoplas dalam 2 spesies Nicotiana
b. Molekul DNA rekombinan pertama pertama menggunakan
enzim restriksi
c. Penggabungan 2 fragmen restriksi tanpa
mempertimbangkan asalnya yang dihasilkan melalui aksi DNA
ligase
d. Pengembangan prosedur enzim yang cocok dapat
ditambahkan untuk mengisi kesenjangan dalam beberapa DNA
untai tunggal dan penggunaan DNA ligase untuk
menggabungkan 2 fragmen sehingga menghasilkan DNA
rekombinan
e. Penemuan enzim reverse transkriptase (bolak balik):
penentuan virus hewan penyebab kanker, alur informasi
genetik dalam bentuk bolak balik (reverse)
Carlson
a. Penggunaan teknik Lobban dan Kaiser untuk
pengembangan plasmid hibrid – insersi fragnen molekul DNA
EcoRl ke dalam DNA plasmid sirkular dari bakteri
menggunakan enzim DNA ligase. Gen dari penyu Afrika
diselipkan ke dalam DNA plasmid bakteri
b. Sitokinin ditemukan mampu memecah dormansi
menggunakan eksplan capitulum dari Gerbera
Herbert Boyer dan Stanley
Cohen
Berg et al.
Mertz dan Davis
Lobban dan Kaiser
Temin
Pierik et al.
26.
1978
Hibridisasi somatik dari tomat dan kentang
menghasilkan pomato
Melchers et al.
27.
1979
Pengembangan prosedur kokultivasi untuk transformasi
protoplas tanaman dengan Agrobacterium
Marton et al
28.
1980
a. Pengembangan teknik restriction fragment length
polymorphism (RFLP)
b. Studi mengenai struktur T-DNA melalui pengklonan
complete EcoRl digest dari DNA crown gall pada
tembakau dalam vektor-fag, sehingga memungkinkan
isolasi dan kajian rinci T-DNA border sequences
Eli Lily and Co
Zambryski et al.
29.
1981
Introduksi istilah variasi somaklonal
Larkin dan Scowcroft
30.
1982
Inkorporasi dari naked DNA oleh protoplas
menghasilkan transformasi dengan isolated DNA
Krens et al.
31
1983
Polymerase chain Reaction (PCR) merupakan ide
dari suatu proses amplifikasi DNA kimia
Kary Mullis
32.
1864
a.Transformasi tembakau dengan Agrobacterium,
pengembangan tanaman transgenik
b. Pengembangan teknik sidik jari genetik (finger
printing) untuk mengidentifikasi individu melalui
analisis polymorphism pada tingkat sekuens DNA
De Block et al.,
Horsch et al.
Jeffreys
33.
1986
Pengembangan tanaman tembakau dan tomat
transgenik cDNA dari gen mantel protein dari TMV
Powell-Abel et al
34.
1987
a. Pengembangan metoda pemindahan gen biolistik
untuk transformasi tanaman
b. Isolasi gen Bt dari bakteri Bacillus thuringiensis
Sanford et al., Klein et
al.
Barton et al
35.
1990
Pengembangan teknik random amplified
polymorphic DNA (RAPD)
Welsh and
McClelland
36
1991
Pengembangan sistim microarray DNA
Fodor
menggunakan cahaya langsung sistim sintesis kimia
37.
1995
a. Pelaporan oleh Institut for Genome Research
mengenai gugus (sequence) DNA dari Haemophilus
influenzae
b. Pengembangan sidik jari (fingerprinting) DNA
melalui teknik amplified length polymorphism
(AFLP)
Fleischmann et al.
Vos et al.
38.
1997
Penggugusan (Sequencing) genom E. coli
Blattner et al
39
1998
Penggugusan (Sequencing) genom organisme
multiseluler (Caenorhabditis elegans)
Sequencing
Consortium C.
elegans
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman
Potensi Bioteknologi dalam Bidang Pertanian
1. Memberikan efisiensi produksi yang lebih tinggi
2.
Pengurangan pencemaran lingkungan
3.
Diperolehnya tanaman yang lebih adaptif pada kondisi
lingkungan marjinal
4.
Peningkatan kualitas produk pertanian
5.
Menjadikan tanaman sebagai pengganti sumber energi
dan bahan baku alternatif
6. Memperoleh tanaman tahan hama dan penyakit tumbuhan
7. Mendapatkan dan meningkatkan kemampuan biopestisida
8. Mendapatkan pupuk-pupuk hayati
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Keuntungan potensial bioteknologi pertanian
Menurut Jones (2003)
• mengurangi penggunaan pupuk dan
pestisida sintetik,
• toleran terhadap cekaman lingkungan,
• pemanfaatan lahan marjinal,
• identifikasi dan eliminasi penyakit di dalam
makanan ternak,
• kualitas makanan dan gizi yang lebih baik
dan
• perbaikan defisiensi mikronutrien
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Peningkatan kualitas tanaman
melalui bioteknologi
Menurut Huttner (2003 dimodifikasi)
• kualitas pangan,
• resistensi terhadap hama atau
penyakit,
• toleransi terhadap cekaman lingkungan
(kekeringan, kemasaman tanah, kadar
Al-dd)
• dan pengelolaan budidaya (gulma,
naungan)
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
GEN
Unit molekul DNA atau RNA dengan panjang minimum
tertentu yang membawa informasi mengenai urutan
asam amino yang lengkap suatu protein.
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman
STRUKTUR HALUS MATERI GENETIK
Panjang rata-rata sebuah
gen ~ 1,2 kb
< 1 kb = 1000 bp
> 32 kb = 10.000 bp
Prokaryot: tidak mengandung intron
Eukaryot : Mengandung Intron
Dr. Jamsari, Prog. Studi Dr.
Pemuliaan
Tanaman
Jurusan
BDP-FPUA
Jumsu Trisno;
Jur.
HPT Faperta
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
DNA
RNA
transkripsi
replikasi
replikasi
PROTEIN
translasi
Struktur lengkap Gen:
1. Promotor: pengatur proses ekspresi genetik
2. Struktural (coding rgion): bagian yang membawa kode genetik
3. Terminator: penghentian transkripsi
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman
2. Struktur Halus Materi Genetik
Gen A
5‘
3‘
Exon
E
Intron Exon Intron
Exon
P
Titik stop
Titik start
5‘
3‘
Sekuens DNA
Transkripsi
m-RNA sementara
Pemisahan intron
Nukleus
m-RNA matang
Translasi
Protein
Sitoplasma
Dr. Jamsari, Prog. Studi
Tanaman
Jurusan
BDP-FPUA
Dr.Pemuliaan
Jumsu Trisno;
Jur. HPT
Faperta
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta Unand
Identifikasi Penyakit Virus
(Berdasarkan Karakter Molekuler)
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
I. Identifikasi dan karakterisasi patogen : VIRUS
1. Isolasi DNA

1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
B
A
2. Amplifikasi PCR
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
M
11
1600 bp
1500 bp
1000 bp
500 bp
250 bp
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
1
2
3
4
5
6
560 bp
Primer yang digunakan adalah:
1). PAL1v 1978 (5’-GCATCTGCAGGCCCACATYGTCTTYCCNGT-3’) dan
PAR1c 715 (5’-GATTTCTGCAGTTDATRTTYTCRTCCATCCA-3’) yang
dirancang untuk mengamplifikasi gen yang menyandikan protein untuk
replikasi, common region dan protein selubung.
2). PAV494 [5’-GCC(C/T)AT(G/A)TA(T/C)AG(A/G) AAGCC(A/C)AG-3’] dan
PAC1048 [GG(A/G)TT(A/G/T)GA(G/A)GCATG (T/A/C)GTACATG-3’] yang
didesain untuk mengamplifikasi target gen coat protein (CP) dari
kelompok geminivirus (Wyatt dan Brown, 1996).
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Sekuensing
>PYK 1
GAATTATATATGTATGGGATGGACGAAAGATCAACTGCGGAGATCAGCGG
CTTCCTTCACATTTTCACTAGCCCATTGTCGTAGTTCCTCTGGAACTTGG
TCAAACGACGACGACGGATATGGTGAAGCAAATGTATCTACAGGTTTAGC
AAATATTTTATCGAAATTAACACTTAAATTGTGGTACTGTAGAACGTAGT
CTTTTGGAGCAAGCTCTTTAATCAATTGAAGAGCATCGGACTTACTTCCA
CAATTTAGGGCCTGCGCGTAAACATCGTTTACGGCGTGCTGACCACCTCG
TGCAGATCGGCCATCTATCTGAAATTCTCCCCATTCGGTGGTATCACCGT
CTTTGTCCATGTACGCCTTGACATCGGAACTTGATTTAGCTCCCTGAATG
TTCGGATGGAAATGTGCTGACCTGGTTGGGGATACCAGGTCGAAGAATCT
GTTGTTCGTGCAGACGTATTTCCCTTCGAATTGTATGAGCACATGGAGAT
GAGGGCTCCCATCTTCGTGAAGTTCTCTACAGATCTTGACAAACAGCTTG
TTGACAGGAGTGATGAGGGATTTTAATTGTTCGAGGGCCTCTTCTTTGGT
TAGAGAACAATGTGGGGTATGTTAAGAAATAGTTTTTGCTCTGTAACTTA
AAACGACGTGGGGGGAGGCATTTGGAGTGTCGTTTTGTATTGGAGACAAT
CACTTCTATCCCTATGTATTGGAGACAGGAGACAATATATATAACTCCTA
TATGGGCCTTACTACTTATTGGGCCTATCCCCGGGGTAAAGCGGCACTCG
TATAATATTACCGAGTGCCGCGAAAAATTTTTGAGAAGGGGGGCCCAGAA
ACCAAAACTTTGGACTGACCAATCCCGTTGGCATCTCCAAAGCTTAAANT
TATGGGGGCGCCCAATTAAAAAGAAAAGGGGACCACCCCTCCCCCT
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Karakterisasi
A
A
T
A
A–T
T
A
1: PYK1, Ag2-1, Ag2-4,
PYLCIV
T
T
A
C
T
A
T
A
T
T
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
C–G
5’-G – C-3’
A
T
C
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
C–G
5’-G – C-3’
1
2
T
Common Region
A
2: So2-1; 3: So3-5
A
T
A
A
T
A
T
T
A
C
T
A
T
A
A
T
A
T
T
A
C
T
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
C–G
G–C
5’-C – G-3’
G–C
C–G
T–A
C–G
C–G
G–C
G–C
5’-C – G-3’
4
3
8: PSBT1 ; 9: Ag 1-4
A
A
T
A
A
T
A
T
T
A
C
T
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
5’-G – C-3’
6
A
T
A
A–T
A
A
T
T
A
C
T
T
A
C
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
5’-G – C-3’
7
T
A
A
T
T
C–G
C–G
C–G
C–G
T–A
G–C
T–A
T–A
C–G
T–A
T–A
5’-G – C-3’
8
A
T
A
A
T
A
T
T
A
C
T
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
C–G
G–C
5’-G – C-3’
9
Gambar 6: Hairpin loop region Geminivirus Isolat Sumatera Barat
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
A
A–T
A
T
T
A
T
C
G–C
C–G
T–A
C–G
C–G
C–G
G–C
G–C
5’-C – G-3’
5
4: TD1-3; 5: TD2-1
6: PSS1-1; 7:PSS2-3
A
T
A
A
T
A
A
A–T
A
A
T
T
T
A
A
A
T
C
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
5’-G – C-3’
(a)
A
T
A
A
T
T
T
A
T
C
G–C
C–G
T–A
T–A
A–T
C–G
C–G
G–C
G–C
C–G
5’-G – C-3’
(b)
PSS
A
T
T
A
C
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
C–G
G–C
5’-G – C-3’
(a)
T
A
T
A
T
T- A
T
T
A
C
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
C–G
5’-G – C-3’
A
T
A
T
A
A
T
A
T
A
T
A
C
T
A
T
A
A
T
T
T
A
C
T
(b)
(a)
T- A
A
T
A
T
T
A
C
T
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
C–G
5’-G – C-3’
(b)
AG
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
T
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
C–G
5’-G – C-3’
TD
A
A
T
A
C
T
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
C–G
G–C
5’-C – G-3’
(a)
T
A
G–C
C–G
T–A
C–G
A–T
C–G
G–C
G–C
C–G
5’-G – C-3’
PYK
(b)
Tabel 3. Perbandingan iteron gen C1 dari 11 isolat geminivirus Sumatera Barat dengan
PepYLCIDV dan ToLCIDV
Isolat
Iteron (5’ – 3’)
Posisi*
PepYLCIDV1)
GGAGACA
-86 s/d -80, -93 s/d-87, -122 s/d-116
ToLCIDV1)
GGAGACA
-134 s/d -128, -196 s/d -190
TLCJAV1)
GGGTCTCAA
-102 s/d -94, -137 s/d -129
Isolat musim tanam 2007
PYK1
GGAGACA
-82 s/d -76, -89 s/d-83, -118 s/d-112
So2-1
GGAGACA
-89 s/d -83, -97 s/d-91, -125 s/d-119
So3-5
GGAGACA
-84 s/d -78, -91 s/d-85, -119 s/d-113
TD1-3
GGAGACA
-87 s/d -81, -94 s/d-88, -123 s/d-117
TD2-1
GGAGACA
-83 s/d -77, -90 s/d-84, -117 s/d-111
PSS1-1
GGAGACA
-88 s/d -82, -95 s/d-89, -122 s/d-116
PSS2-3
GGAGACA
-85 s/d -79, -93 s/d-87, -121 s/d-115
PBST2-3
GGAGACA
-125 s/d -119
Ag1-4
GGAGACA
-90 s/d -84, -97 s/d-91, -125 s/d-119
Ag2-1, Ag2-4
GGAGACA
-89 s/d -83, -96 s/d-90, -124 s/d-118
Isolat musim tanam 2008
PSS1-1(08)
GGCGTC
-99 s/d -94, -106 s/d -101, -133 s/d -128
TD1-2(08)
GGAGACA
-85 s/d -80, -92 s/d -86, -119 s/d -114
Ag1-3(08)
GGAGACA
-85 s/d -80, -92 s/d -86, -119 s/d -114
PYK1-1(08)
Dr. Jumsu Trisno;-88
Jur.
Faperta
GGAGACA
s/dHPT
-82, -95
s/d 89, -125 s/d -119
Unand
Sequence Characterization of Begomoviruses
PBST2-3
AG2-4
PYK1
TD2-1
PSS2-3
TD1-3
PSS1-1
AG2-1
AG1-4
SO3-5
SO2-1
PYLCVI-Co
GGTATTGGGAGACAATCCCTTCTTGTCCCCCATATAATTGGGGACAAGAAGACCACGATT
-GTAT-AGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATA--TGGGAGACAGGAGACAA----T
-GTAT-TGGAGACAATCACTTCTA--TCCCTATGTA-TTGGAGAC-AGGAGACAA-----GTAT-TGGAGACA-TCCTTCTAT---CCCCATATATTGG-AGACAGG-AGACA-----T
-GTAT-TGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATATTGG-AGACAGGGAGACAA----T
-GTAT-TGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATATTGGGAGACAGG-AGACAA----T
-GTAT-TGGAGACA-TCCTTCTAT---CCC-ATATATTGGGAGACAGG-AGACAA----T
-GTAT-TGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATATTGG-AGACAGG-AGACAA----T
-GTAT-TGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATATTGG-AGACAGG-AGACAA----T
-GTAT-TGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATATTGG-AGACAGG-AGACA-----T
-GTAT-TGGAGACAATCCTTCTAT---CCCCATATATTGG-AGACAGGGAGACAA----T
-GTAT-TGGAGACAATCACTTCTA--TCCCTATGTATTGG-AGACAGG-AGACAA----T
**** ******* ** *
*** ** **
*
* ****
iteron
iteron
iteron
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
767
743
735
730
655
732
739
731
730
736
735
2673
PBST2-3
AG2-4
PYK1
TD2-1
PSS2-3
TD1-3
PSS1-1
AG2-1
AG1-4
SO3-5
SO2-1
PYLCVI-Co
ATTCATTCAGG-TTCTTTAAGAGGGCGTTCTAGGGAAATTTTGGTCCACCCTCTGAAAGG
ATATACATAAG-TTCTATAA--GGGCTTTCTAGGTAATTTT--GTAC-CCCCCTGGAATG
-TATATATAAC-TCCTATATG-GGCCTTACTACTTA---TTGGGCCTATCCCC-----GG
ATATACTTAAG-TTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTAATTTT---TAC-CCCCTTGAATGA
ATATACATAAG-TTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTAATTTT--GTAC-ACCCTTGAATGA
ATATACATAAG-TTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTAATTTT--GTAC-ACCCTTGAATGA
ATATACATAAG-TTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTAATTTT--GTACCCCCCTTGAATGA
ATATACATAAG-TTCTATAAA-GGGC-TTCTAGGTAATTTTT-GTACACCCCTTGAATGA
ATATACCTAAGGTTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTTATTTTT-GTAC-CCCCTTGAATGA
ATATACTTAGN-TTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTAATTTT--GTAC-NCCCTTGAATGA
ATATACATAGG-TTCTATAAA-GGGC-TTCTAGGTAATTTT--GTAC-ACCCTTGAATGA
ATATAGATAAG-TTCTATAA--GGGC-TTCTAGGTAATTTT--GTAC-ACCCTTGAATGA
* *
*
* ** **
** * * ***
**
**
826
797
784
782
708
785
793
787
785
789
789
2726
TATA Box
PBST2-3
AG2-4
PYK1
TD2-1
PSS2-3
TD1-3
PSS1-1
AG2-1
AG1-4
SO3-5
SO2-1
PYLCVI-Co
AAGAAAGGGGGGCACTTCGTAATAATAATAGCCCGAGGGGCCCCGCAAAATTTTTTAGGA
ATTAAAGCGGCAC---TCGTA-TAATATTA--CCGAGTGCCGCCGAAAAATTTT----GG
GGTAAAGCGGCAC---TCGTA-TAATATTA--CCGAGTG-CCGCGAAAAATTTTT---GA
TAAA--GCGGCCC---TCGTA-TAA-ATTA--CCGAGGG-CC-CGAAAATTTTGA---AA
TTAA--AGGGCAC---TCGTA-TAA-ATTA--CCGAGTG-CC-CNAAAATTTTGA---GT
TTAAC-GCGGCAC---TCGTA-TAATATTA--CCGAGTG-CCGCGAAAAATTTTA---GA
TAAAA-GGGGCAC---TCGTA-TAATATTA--CCGAGTG-CC-CGAAAATTTTTT---GA
TTAAA-GCGGCAC---TCGTA-TAATATTA--CCGAGTG-CCGCGAAAATTTTTG---GA
TTAAAGGCGGCAC---TCGTA-TAATATTA--CCGAGTG-CCGCCNAAAATTTTG---GA
TNAA--GCGGCCT----CGTA-TAATATTA--CCGAGG--CCGCGAAAATTTT------TTAAA-GCGGCAC---TCGTTATAATATTA--CCGAGTG-CCGCGAAAATTTTT----GA
TTAAA-GCGGCAC---TCGTA-TAATATT------------------------------*
**
*** *** * *
Nanonucleotide
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
886
847
834
828
754
834
841
836
835
831
838
2750
Phylogeny Analysis of Begomovirus : “Common Region”
Langkah kerja:
1. Data sekuen yang didapatkan dianalisis
2. BANDINGKAN DENGAN DATA GENE BANK: BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), : DIDAPAT HUBUNGAN HOMOLOGI
DNA
3. Analis kekerabatan : ClustalW (www.ebi.ac.uk), Phylip
(www.biowec.pasteur.fr/seqanal/phylogeny/philip-uk.htm),
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Phylogeny Analysis of Begomovirus : “Common Region”
Group 1
Group 2
Group 3
Gambar 5. Filogenetik kekerabatan 11 isolat gemenivirus Sumatera Barat terhadap strainstrain dari daerah dan negara lain yang ada pada GeneBank.
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
AYLCV-To
PYLCVI-To
PYLCVI-Ca
Java Begomoviruses
PYLCVI-Ag
TYLCV-Lbg
PBST2-3(07)
SO2-1(07)
SO3-2(07)
AG2-4(07)
AG2-1(07)
West Sumatra,
Isolates 2007
AG1-4(07)
TD1-3(07)
PYK1(07)
PSS1-1(07)
TD1-2(08)
AG1-3(08)
West Sumatra,
Isolates 2008
SO1-3(08)
TD2-1(07)
PSS2-3(07)
PSS1-8(08)
West Sumatra,
Isolates 2007
West Sumatra,
Isolates 2008
Figure 1. Phylogeny of Begomovirus isolates from West Sumatera compare to Begomovirus isolates from
Java (from GeneBank data). Number at cladogram branch showed bootstrap value in 100
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
replication.
Unand
PSS2-3(07)
TD2-1(07)
PYK1(07)
AG2-1(07)
AG1-4(07)
SO3-5(07)
TD1-3(07)
TD1-2(08)
AG1-3(08)
SO1-3(08)
PSS1-1(07)
AG2-4(07)
SO2-1(07)
PBST2-3(07)
AYLCV-To
PYLCVI-To1
PYLCVI-To2
PYLCVI-Co
TLCPaksV
TYLCVetA
TYLCVVit
AYLTaiV
AYLCVIsh
AYVV
TLCVJava
TLCVMal
AYVChiV
PLCYuV
TYLCVThaiA
TYLCVThai
TLCPhiV
PYLCMaliV
TYLCV
TYLCV
TYLCMaliV
PYLCV-Bgr
PYLCVI-Ag
PYLCV-Co
TYLCV-Lbg
TYLCV-LbgA
PSS1-8(08)
West Sumatra, Indonesia
Begomoviruses
Java, Indonesia
Begomoviruses
Asian Begomoviruses
Java, Indonesia
Begomoviruses
Painan-West Sumatra,
Indonesia Begomoviruses
Figure 2. Phylogeny of Begomovirus isolates from West Sumatera compare to Begomovirus isolates from
Indonesia and Asia (from GeneBank data). Number at cladogram branch showed bootstrap value
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
in 100 replication.
Unand
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Karakterisasi Gen AV1 (Coat Protein): ASAM AMINO
.....+.+.+++++*+++++++.++.+++++.+*.++++++++++*+.++++*++.+++.
GRRTSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDVTHTGKVLCVSDVTRGNGITHRVGKRFCVKSVYII
GRRTSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDVTHTGKVLCVSDVTRGNGITHRVGKRFCVKSVYII
GRRSSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDITHTGKALCVSDVTRGSGITHRVGKRFCVKSVYII
GRRTSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDITHTGKALCVSDVTRGNGITHRVGKRFCVKSVYII
GRRTSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDVTHTGKVLCVSDVTRGNGITHRVGKRFCVKSVYII
WRRSSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDITHTGKVLCVSDVTRGNGITHRIGKRFCVKSVYVM
WRRSSDVPRGCEGPCKVQSFEQRHDITHTGKVLCVSDVTRGNGITHRIGKRFCVKSVYVM
WRRSSDVPRGCEGPCEVQSFEQRHDITHTGKVLCVSDVTRGNGITHRIGKRFCVKSVYVM
MYRSPDVPYGCEGPCKVQSFEKKHDVSHTGTLLCVSDVTRGNGITHRVGKRFCIKSIYIL
--------AGCEGPCKVQSFEQRHDITHTGKALCVSDVTRGNGITHRVGKRFCVKSVYII
AKFGWTKTSSRRTTLTMSCSGWFVTGDLLLRRMASESCSTCMIMNPVQQLSRTIFVIVCR
LDGRKHQVEEPHQCHVLVGSPATCYYAVWLRRVVQHVTQYSNYQERSSSCAGVTPFFSYS
-------PRGCEGPCKVQSFEQRHDITHTGKALCVSDVTRGNGITHRVGKRFCVKSVYII
LDGRKHQVEEPHQCHVLAGSPATCYYAVWLRRVVQHVTQYSNYQERSSSCAGVTPFFSYS
AKFGWTKTSSRRTTLTMSCSGWFVTGDLLLRRMASESCSTCMIMNPVQQLSRTIFVIVCR
AKFGWTKTSSRRTTLTMSCSGWCVTGDLLLRRMASESCSTCMIMNPVQQLSRTIFVIVCR
+++*++++.+.++*++..++*++**++++**+++*++++++++*+++*+++++++.++++
PYLCIV
120) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ
PYLVIV-2
120) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ
PYLCIV-3
120) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPFGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ
PYLCIV-to
120) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPYCFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ
PYLCIV-4
120) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ
TYLCKAnV
120) GKIWMDENIKLKNHTNTVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ
TYLCKANV1
120) GKIWMDENIKLKNHTNTVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATVKNDLRDRVQ
TYLCVTai
120) GKIWMDENIKLKNHTNTVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ
AlYLCV
118) GKIWMDENIKSKNHTNTVMFWLVRDRRPVTTPYGFGEAFNMYDNEPSTATIKNDLRDRLQ
PepSO1-3(08)
62) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ
PepAg1-3(08)
120) CYTVFQLQSLVVSTQARNK--QSRDFLELTTML-F-IIIRKQQNMKITLKMHYCC-----PepPYK1-9(08)
120) HWWSVRKQGTSNREEIFSQLCCLSSGSSKIKSHKCIIVVYGMYSSSQTQNSALQIFSFFL
PepPDG-III(08)
64) GKVWMDENIKSKNHTNNVMFWLVRDRRPVTTPYGFGELFNMYDNEPSTATIKNDLRDRVQ
PepTD1-2(08)
119) HWWSVRKQGTSNREEIFSQLCCLSSGSSKIKSHKCIIVVYGMYSCLPTPTTIRRSPLFSF
PepPDG-I(08)
120) CYTVFQLQSLVVSTQARNK--QSRDFLELTTML-F-IIIRKQQNMKITLKMHYCCIWHVL
PepPDG-II(08)
120) CYIVFQLQSLVVSTQARNK--QSRDFLELTTML-F-IIIRKQQNMKITLKMHYCCIWHVH
PYLCIV
PYLVIV-2
PYLCIV-3
PYLCIV-to
PYLCIV-4
TYLCKAnV
TYLCKANV1
TYLCVTai
AlYLCV
PepSO1-3(08)
PepAg1-3(08)
PepPYK1-9(08)
PepPDG-III(08)
PepTD1-2(08)
PepPDG-I(08)
PepPDG-II(08)
60)
60)
60)
60)
60)
60)
60)
60)
58)
10)
60)
60)
11)
59)
60)
60)
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Tabel 4.3. Persentase kesamaan runutan nukleotida (NT) dan Asam Amino (AA), serta distance matrices dari
gene Coat Protein (CP) isolate Padang (PYLCIV-Padang) dan tujuh isolat Begomovirus dari
database GeneBank. Pepper yellow leaf curl Indonesia virus –asal cabai (PYLCIV-Ca:
BAF02735.1 ), PYLCIV-asal Ageratum conyzoides (BAF02749.1 ), PYLCIV-asal Tomat
(BAF02742.1), Tomato yellow leaf cur virus-Kanchanaburi Thailan isolate 1 (TYLCV-Kan1:
NP_995303.1 ), TYLCV-Kan2(AAO15928.1), Alternanthera yellow veinal virus (AlYVV:
ACH88349.1), Tomato yellow leaf curl Indonesia Virus-Lembang (TYLCIV-Lbg: AF189018.3)
PYLCIV-Padang
Begomovirus database GeneBank
NT(%)
AA(%)
Distance Matrices (%)
PYLCIV-Ca
95
93
6,78
PYLCIV-Age
94
93
7,10
PYLCIV-To
95
94
6,67
TYLCV-Kan1
74
88
10,68
TYLCV-Kan2
73
87
10,26
AlYVV
77
83
18,10
TYLCIV-Lbg
75
74
24,12
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Phylogeny Analysis of Begomovirus : “Gen AV1 (CP)”
TYLCIV-Lbg
PYLCVI-Ag
PYLCVI
PepSo1-3
PepPDG-III
PYLCIV-2
PYLCIV-3
PYLCIV-To
PYLCIV-4
TYLCKanV
TYLCKanV-1
TLCVTai
AlYLCV
TYLCIV-Lbg
PepAg1-3
PepPDG-I
PepPDG-II
PepPYK1-9
PepTD1-2
Dr. Jumsu Trisno; Jur. HPT Faperta
Unand
Identifikasi & Deteksi Dini
Patogen (Bakteri)
Dr. Jumsu Trisno, SP., M.Si
Virologis and Bioteknologis
Jurusan HPT Faperta Unand
E-mail [email protected]
HP. 085274050113
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Identifikasi & Karakterisasi
Bakteri

Berdasarkan Gejala dan Tanamannya
Morfologi dan Histopatologi Tanaman

Berdasarkan organisme penyebab
Morfologi dan Fisiologis
Serologi ( ELISA: Antigen-Antibodi)
Molekuler (Karakter DNA)
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
ISOLASI DAN PURIFIKASI
DNA
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
PENDAHULUAN

DNA: polimer untai ganda yg tersusun dari
dioksiribonukleotida (dari basa purin atau
pirimidin, gula pentosa,dan fosfat).

Basa purin: A,G
Basa pirimidin: C,T


DNA merupakan komponen penyusun
kromosom ( materi penyimpan informasi
genetik)
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Komponen DNA
Pasangan
A-T
G-C
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
DNA berada dalam sel
sehingga untuk
mendapatkanya harus merusak
dinding dan membran sel
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
TAHAPAN ISOLASI DAN PURIFIKASI DNA
1. Perusakan dinding dan membran sel
2. Inactivasi Enzim DNA-se
3. Purifikasi DNA dari komponen lain
• Ekstraksi/presipitasi
• Kromatografi Adsorpsi
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Perusakan dinding dan membran sel
Tahap 1:
Merusak dinding sel:
-mekanik (digerus) atau mesin micro smash
-enzimatik (bakteri: lisozim), (kapang:kitinase &
selulase)
mesin micro smash
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Tahap 2:
Ekstraksi dengan buffer ekstraksi/lisis
Buffer ekstraksi/lisis berfungsi:
1. Merusak membran sel
2. Menginaktivasi enzim DNA-se
3. Menghilangkan kontaminan lain
Contoh Buffer ekstraksi/lisis:
-Buffer TES ( Tris-HCl pH 8, EDTA 10 mM, NaCl 0,5M , SDS
1%)
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Tahap 3: Purifikasi dg Ekstraksi/Presipitasi
Tahap 1: Ekstraksi dg pelarut organik
Campur sama
banyak dg pel.
organik
Aqueous
sentrifugasi
e.g. phenol, chloroform,
or phenol:chloroform
Fasa air dipisah
Interphase
Organic
Hasil sentrifugasi dari
ekstrak buffer lisis
supernatan :mengandung
DNA dan kontaminan
Fasa air mengandung DNA, fasa pel.
Organik mengandung protein dan
lemak, debris sel mengendap
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Larutan DNA
Tahap 3: Purifikasi dg Ekstraksi/Presipitasi
Tahap 2: Pengendapan DNA
After
Supernatant
Sentrigugasi
70% EtOH
Wash
Centrifuge
Pellet
+ alkohol dan garam
(NaOAc &EDTA) untuk
mengendapkan DNA
• Pellet DNA
• Cuci dg etanol 70% untuk
menghilangkan garam dan kontaminan lain
• Keringkan
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Larut pelet (H2O,
Buffer TE
Tahap 3: Purifikasi dg Kromatografi adsorpsi
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Tahapan kromatografi adsorpsi
DNA dan kontaminan
akan berikatan dengan
silika
Silika dicuci untuk
menghilangkan kontaminan
Silika dielusi untuk mendapatkan DNA
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Penentuan kualitas dan kuantitas DNA
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Nucleic Acid Analysis via UV Spectrophotometry
DNA Absorption Spectra
DNA mempunyai puncak absorpsi pada panjang
gelombang 260nm.
Absorban 1,0 pada 260 nm sebanding dg 50 µg DNA/ml
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Kemurnian DNA
Perbandingan A260/A280 ratio is ~1.8 DNA murni
Kurang dari1,8 terkontaminasi
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Elektroforesis Untuk Visualisasi
DNA
Elektroforesis: Perpindahan DNA bermuatan negatif terhadap
medium agarosa atau polakrilamid sebagai aksi dari arus
listrik
Komponen:

Gel agarosa 0.8-1% untuk mencek genom, 1,5-2%
untuk fragmen DNA berukuran 200bp, poliakrilamid
40% untuk 1-300 pb

buffer (TAE= Tris-Borat-EDTA;TBE=Tris-AcetatEDTA; TPE=Tris-Fosfat-EDTA)

Loading dye (sukrosa/gliserol dan bromofenol biru)

dan sampel DNA
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Elektroforesis Untuk Visualisasi
DNA
• Aliran listrik untuk elektroforesis 50-100 V dg
arah dari – ke + selama sekitar 30 menit.
• DNA akan bermigrasi berdasarkan ukuran, yg
paling kecil akan lebih cepat bermigrasi.
• Ukuran fragmen DNA ditentukan dg standar yg
sudah diketahui ukurannya.
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Visualisasi DNA dg etidium bromida yg
akan berpendar di bawah sinar UV.
EtBr
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Isolasi DNA Total (Contoh: Metode
Lazo dan Gabriel 1987)
1.
2.
3.
Isolat Bakteri (koloni tunggal) ditumbuhkan
dalam medium LB/NB, diinkubasi suhu
ruang sambil dishaker 80 rpm selama 24
jam
Dipanen, pindahkan ke mikrotupe 2 ml dan
disentrifus 10.000 rpm selama 3 menit
Pellet diresuspensi dengan 1 ml buffer TE
(1M Tris HCl, 0,5 M EDTA pH 8), disentrifus
12.000 rpm, 5 menit
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Supernatan dibuang, pellet di resuspensi dg 200 l TE,
tambahkan 40 l SDS 10%, dibolak-balik dan inkubasi 65 0C
selama 30 Menit dan tambah 20 l Proteinase K (2 mg/ml)
Campuran diinkubasi suhu 37 oC selama 3-4 jam
Tambahkan 200 l Fenol:klorofor (3:5), dibolak-balik 5 menit,
disentrifus 12.000 rpm selama 5 menit
Supernatan dipindah ke mikrotupe baru, tambahkan
kloroform 200 l, disentrifus 12.000 rpm selama 5 menit
Supernatan dipindah ke tupe baru ditambah 1 ml etanol
absolut dingin dan 50 l NaOAc 3 M, dibolak-balik,
diinkubasi suhu -20 oC
Supernatan dibuang ambil pellet, dan diresuspensi
aquades steril
DNA disimpan suhu -20 oC sampai digunakan
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Amplifikasi gen 16Sr-RNA
dengan PCR
16Sr-RNA, urutan DNA yang digunakan untuk
identifikasi Bakteri
Komposisi reaksi PCR (reaksi total 25 l)
1.
DNA template (hasil Isolasi) 1 l (± 200 ng)
2.
dNTPs (masing-masing 200 mM)
3.
Enzim Taq polimerase 1,5 unit
4.
Primer (masing-masing 10 pMol)
5.
Ditambahkan aquabides steril sampai vol 25 l
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Amplifikasi gen 16Sr-RNA
dengan PCR
16Sr-RNA, urutan DNA yang digunakan untuk
identifikasi Bakteri
Komposisi reaksi PCR (reaksi total 25 l)
Dapat menggunakan kit spt Ready -To-Go PCR bead,
hanya menambahakn
1.
DNA template (hasil Isolasi) 1 l (± 200 ng)
2.
Primer (masing-masing 10 pMol)
3.
Ditambahkan aquabides steril sampai vol 25 l
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Amplifikasi gen 16Sr-RNA
dengan PCR
Protokol PCR yg digunakan:

Predenaturasi 94 oC, 2 menit

Denaturasi 94 oC, 30 detik

Annealing 55 oC, 30 detik

Elongation 72 oC, 1 menit

Post PCR 72 oC, 5 menit
Dengan jumlah siklus 30 – 35 kali
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
1.500 bp
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Bioteknologi Untuk Perlindungan Tanaman
Sekuensing
Teknik identifikasi urutan nukleotida-nukleotida dari
susunan DNA
Diperkenalkan pada tahun 70-an oleh
Maxam dan Gilbert, kemudian disusul oleh Sanger
et al (Nobel, 80-an)
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Sekuensing
5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3‘
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘
+
TGCATTG
5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3‘
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘
TGCATTG
+ Polymerase; dA, dC, dG, dT, ddT
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘
TGCATTGAAT
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘
TGCATTGAATAT
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘
TGCATTGAATAAGACGT
… dst …
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘
TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACT
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Bioteknologi Tanaman
Sekuensing
Elektrophoregram hasil pembacaan Megabace yang diolah dengan software
DNAstar. DNA template berasal beet gula
Sumber: Jamsari
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Sequensing: di kirim kelembaga-lembaga
lain : PT. Charoon Pohpan, Egkman RSCM
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND


Hasil perunutan DNA dianalisis
menggunakan program NCBI BLAS
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) untuk
melihat kesamaan genetiknya dibandingkan
dengan runutan asam nukleat (DNA) yang
ada di GeneBank
Analisis keragaman berdasarkan runutan
DNA daerah 16Sr-RNA menggunakan
program ClustalW program versi 1.83
European Bioinformatics Institute (EMBLEBI: www.ebi.ac.uk/serve/clustalW).
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Deteksi Cepat Penyakit Bakteri dg PCR
menggunakan Primer Spesifik
1.
2.
3.
4.
Rancang primer dari sequen spesifik (spt
gen patogenesitas), ini dapat juga dari
informasi jurnal
Pesan primer spesifik
Optimasi kondisi PCR ( kondisi optimum
suhu annealing)
Setelah dapat kondisi optimal PCR, dpt
digunakan untuk deteksi penyakit bakteri
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Deteksi dari kultur murni bakteri/DNA
Komposisi reaksi PCR (reaksi total 25 l)
Dapat menggunakan kit spt Ready -To-Go PCR bead,
hanya menambahakn

DNA template (hasil Isolasi) 1 l (± 200 ng)

Primer (masing-masing 10 pMol)

Ditambahkan aquabides steril sampai vol 25 l
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Protokol PCR yg digunakan:
 Predenaturasi 94 oC, 2 menit
 Denaturasi 94 oC, 30 detik
 Annealing 55 oC, 30 detik
 Elongation 72 oC, 1 menit
 Post PCR 72 oC, 5 menit
Dengan jumlah siklus 30 – 35 kali
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Deteksi in situ (Xag pd Kedelai)
Metode Zhao et al (2002)








0,5 gram daun kedelai yg bergejala disterilkan dg 0,25%
sodium hiperklorit 30 detik
Digunting kecil dan dimasukkan ke dlm erlenmeyer 100 ml yg
berisi 10 ml Phosfat Buffer Saline (PBS)
Sampel digoyang dlm waterbath suhu 30 0C selama 6 jam
Supernatan disaring disentrifus selama 10 menit 10.000 rpm
Pellert diresuspensi dalam 500 l 0,5 M NaCl disentrifus
10.000 rpm, 5 menit
Peller ditambahkan 20 l aquades dipanaskan pada air
mendidih 5 menit
Ambil 2 l untuk dijadikan DNA template
Reaksi PCR dan komposisi sama yang sudah dijelaskan
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta UNAND