tugas dasar bioteknologi

NAMA : RAHMAWANTI OCTAVIANA PUTRI
NIM
: 125100601111002
KELAS : H-TEKNIK BIOPROSES
Tugas Sekuensing DNA
1. ) Jelaskan pengertian DNA sekuensing!
DNA sekuensing adalah metode penentuan urutan basa nukleutida sutu fragmen DNA.
Metode ini menenyukan urutan basa nukleutida suatu gen atau fragmen DNA lainnya yang
digunakan untuk mengetahui urutan huruf-hirif nukleutida informasi total genim dalam
satu sel atau organisme. Sekuens DNA dapat dilakukan dengan dua metode yaitu metode
Maxam-Gilbert dan metode Sanger
2. ) Jelaskan pengertian hibridisasi!
Hibridisasi adalah pemuliaan tanaman yang dibentuk dengan proses perpasangan antara
DNA yang menjadi sasaran dan DNA pelacak. Hibridisasi biasa digunakan untuk melacak
adanya DNA yang sesuai dengan pelacak, misalnya untuk mengetahui integrasi transgen
di dalam organisme transgenik.
3.) Jelaskan prinsip kerja southern blot, northern blot dan western blot! Sebutkan
persamaan dan perbedaannya!
> Southern Blot adalah teknik yang mampu untuk mendeteksi fragmen restriksi tunggal
yang spesifik dalam campuran asam nukleat yang sangat kompleks yang dihasilkan dari
pemotongan genom dengan menggunakan enzim restriksi. Kompleks dalam campuran
tersebut, banyak fragmen yang akan mempunyai panjang yang sama dengan yang lain dan
bermigrasi atau berpindah bersama-sama selama proses elektroforesis. Meskipun semua
fragmen tidak secara sempurna terpisah oleh proses elektroforesis gel agarose, fragmen
tunggal dalam pita hasil elektroforesis dapat diidentifikasi dengan hibridisasi
menggunakan DNA probe yang spesifik. Sehingga untuk menyelesaikan masalah tersebut,
fragmen restriksi yang ada dalam gel didenaturasi dengan alkali dan ditransfer pada filter
nitroselulosa atau membran nilon dengan teknik blotting.
Berdasarkan prinsipnya, southern blot dapat dibagi ke dalam 4 tahap yaitu:
(1) fiksasi DNA di membran (nitroselulosa atau nilon)
(2) pelabelan pelacak
(3) prehibridisasi dan hibridisasi
(4) deteksi hasil hibridisasi
Fiksasi DNA di membran dapat dilakukan melalui beberapa cara yaitu:
(1) penetesan DNA (dot blot) langsung di membran
(2) fiksasi DNA bakteri di membran
(3) fiksasi DNA fage rekombinan dari satu replika plak di membran
(4) transfer DNA dari gel agarose ke membran. Membran yang dipergunakan untuk
memfiksasi DNA biasanya menggunakan membran nilon karena lebih kuat daripada
membran nitroselulosa. Replika terhadap DNA yang difiksasi ke membran dengan cara
transfer melalui metode southern (southern blotting) dapat diketahui ukuran DNA
targetnya.
> Northern Blot adalah teknik dasar hibridisasi asam nukleat, perbedaannya pada RNA
sebagai target. Probe sama dengan southern blot dengan target adalah mRNA. Didalam
eukariot pemilihan mRNA lebih efisien karena genomic DNA tidak mempunyai intron
yang mungkin interference yang mengikat probe untuk mengoreksi sekuen. Dasarnya,
teknik ini menggunakan mRNA sehingga pada agarose gel tidak menggunakan perlakuan
denaturasi dengan asam kuat. Tahapan yang digunakan dalam metode ini yaitu: pemisahan
mRNA dengan elektroforesis, dipindahkan kedalam membrane nylon dan diinkubasi
dengan probe yang utas tunggal. Probe yang sebelumnya dilabel dengan biotin atau
digoxigenin atau radioaktif. Membran kemudian diperlihatkan difilem atau substrad
kromegenik.Variasi dari hibridisasi nortnblot adalah dengan teknik blot titik dimana
sampel tidak diseparasi berdasarkan ukuran. Melalui teknik ini mudah dilakukan hanya
dengan membrane ditetesi dengn mRNA dan probe. Seperti halnya sourthern blot DNA
harus dibuat utas tuggal sebelum diblot.
Sebelum ditetesi dengan DNA sampel maka probe terlebih dahulu untuk menghibridisasi
probe. Kemudian membrane difisualisasikan di filem. Jika probe dan DNA atau RNA
target mirip maka filem akan berwarna hitam. Dot blot sangat mudah dan cepat untuk
menentukan sampel target yang berhubungan dengan sekuen sebelum dilakukan percobaan
sesungguhnya.
 Western Blot memiliki prinsip kerja yang menggunakan RNA dan protein. Setelah
electrophoresis, gel pada RNA dan protein tersebut diperlakukan dengan suatu alkali
yang menyebabkan DNA terdenaturasi dan terpisah menjadi rantai tunggal. Suatu
membran seperti selaput ditempatkan pada gel dan diberi tekanan melalui pengisapan
atau metoda mundane dalam kertas handuk (paper towels) dengan suatu berat. DNA
berpindah tempat ke membran dan stick. Membran DNA-impregnanted dibakar atau
menyebar secara permanen dengan menyertakan DNA tersebut. Molekul yang
kemudian diperlakukan dengan suatu pemeriksaan hibridisasi yang mana hanya suatu
molekul DNA dengan urutan dikenali yang akan dipasangkan dengan urutan DNA
yang telah ditandai (diblot). Pemeriksaan DNA berlabel dengan fluorescents atau
chromogenic berpijar sehingga dapat teridentifikasi. Dengan pengujian pola dari
hybridisasi dengan sinar X atau Autoradiografi, peneliti dapat menentukan fragmen
yang berisi DNA sequence spesifik atau gen
Tugas PCR
1.) Apa kepanjangan PCR?jelaskan pengertiannya!
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu reaksi in vitro untuk menggandakan
molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesa molekul DNA baru yang
berkomplemen dengan molekul DNA tersebutdengan enzim polymerase dan
oligonukleotida pendek sebagai primer dalam mesin Thermal Cycler. Teknik ini
berjalansecara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu. Proses yang terjadi
dalam mesin PCR meliputi tiga tahap utama yaitu denaturasi (pemisahan untai
gandaDNA), annealing (penempelan primer)dan ekstensi (pemanjangan primer).
Proses dari mulai denaturasi, penempelanhingga pemanjangan disebut sebagai satu
siklus. Produk PCR dapat langsung divisualisasikan melalui proses elektroforesis dan
dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut.
2.) Apa saja macam2 PCR, apa perbedaannya?
Macam- macam dari PCR adalah sebagai berikut :
 Reverse
Transcription
Polymerase
Chain
Reaction
(RT-PCR)
merupakan
singkatan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction. Seperti namanya, proses
RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaanya dengan PCR yang
biasa, pada proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA
menjadi cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse
Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa
molekul DNA secara in vitro menggunakan template RNA. Seperti halnya PCR biasa,
pada pengerjaan RT-PCR ini juga diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan
dNTP. Namun berbeda dengan PCR, templat yang digunakan pada RT-PCR adalah
RNA murni. Oleh karena primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA,
maka DNA yang mengkontaminasi proses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi
mRNA yang mempunyai poly(A) tail pada ujung 3′, maka oligo dT, random heksamer,
maupun primer spesifik untuk gen tertentu dapat dimanfaatkan untuk memulai sintesa
cDNA.
 Real Time PCR (qPCR) adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi
PCR. Dalam
ilmu
biologi
molekular,
Real
Time
PCR
(juga
dikenal
sebagai quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic
polymerase chain reaction), adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk
mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target
molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Real Time PCR memungkinkan dilakukannya
deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah
relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang
ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa.
Real Time PCR (qPCR) atau dapat pula disebut kuantitatif PCR real time (qPCR) atau
PCR kinetik adalah teknik laboratorium berdasarkan PCR, yang digunakan untuk
mengamplifikasi dan secara simultan mengukur molekul DNA target.
Untuk satu atau lebih urutan tertentu dalam sampel DNA, Real Time-PCR
memungkinkan deteksi dan kuantifikasi secara bersamaan. Kuantitas yang didapat
berupa jumlah salinan mutlak atau jumlah relatif ketika dinormalisasi untuk DNA yang
dimasukkan atau gen normalisasi tambahan.
 Nested PCR
Merupakan suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan bantuan
enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi
fragmen. Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah
diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya
oleh primer yang kedua. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yang sangat
spesifik dalam melakukan amplifikasi. Nested PCR dan PCR biasa berguna untuk
memperbanyak fragmen DNA tertentu dalam jumlah banyak. Dimana pada nested
PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan pada PCR biasa hanya menggunakan 1
pasang primer. Oleh karena itu hasil fragmen DNA dari nested PCR lebih spesifik
(lebih pendek) dibandingkan dengan PCR biasa. Waktu yang diperlukan dalam
reaksinested PCR lebih lama daripada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2
kali reaksi PCR sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR. Selain itu,
keuntungan nested PCR adalah meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan
menggunakan 2 pasang primer.
 Multiplex PCR
Multiplex PCR digunakan untuk mendeteksi beberapa target DNA sekaligus.
Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk
menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang
berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari
lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak
waktu untuk melakukan. Temperatur Annealing untuk masing-masing set primer harus
dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon.
Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band yang
berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel .
 ELISA PCR
PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat yang
meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam sebuah
pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini.
Dengan metode inilah dapat dilakukan pengukuran sequen internal pada produk PCR.
Metode ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan metode Real Time PCR.
PCR-ELISA telah digunakan sejak akhir 1980-an dan telah berkembang untuk
mendeteksi sequen tertentu dalam produk PCR. Meskipun banyak metode yang
tersedia untuk mendeteksi sequen tersebut, ELISA PCR berguna untuk mendeteksi dan
membedakan antara beberapa sasaran dari sequen yang diinginkan. ELISA PCR ini
juga berguna untuk screening beberapa sampel, terutama bila jumlah sampel tidak
menjamin. Salah satu aspek yang paling berguna dari PCR-ELISA adalah
kemampuannya dalam membedakan antara produk reaksi perubahan polimerase yang
dihasilkan dari seperangkat primer yang mengandung variasi sequen, yaitu sequen
yang bervariasi antar primer.
3.) Jelaskan prinsip kerja real time PCR!
Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR; utamanya adalah
DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara
real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Terdapat 2 (dua) metode
kuantifikasi yang umum digunakan antara lain :
(1)
Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA
rantai ganda (dsDNA) misalnya SyBr Green
(2) Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang
akan berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya
probe FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR,
sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap siklus
PCR telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil
amplifikasi) yang dihasilkan.
4.) Jelaskan prinsip kerja reverse transkriptase PCR!
Reverse Transkriptase-PCR menggunakan sepasang primer, yang berkomplemen
dengan sequens yang jelas dari masing-masing dua untai cDNA. Primer tersebut
kemudian diperpanjang dengan bantuan enzim DNA polymerase dan akan
menghasilkan sebuah untai gandaan pada setiap siklusnya dan seterusnya mengikuti
amplifikasi logaritmik. Tahap – tahap RT-PCR meliputi tiga tahap utama antara lain :
a. Tahap reverse transcription
Tahap reverse transcription (RT) atau transkripsi balik adalah dimana RNA
ditranskrip balik menjadi cDNA menggunakan enzim reverse transcriptase dan
primer. Tahap ini sangat penting dalam kaitannya dengan performa PCR untuk
amplifikasi cDNA dengan bantuan DNA polymerase sebab DNA polymerase
hanya dapat bekerja pada templet yang berupa DNA. Tahapan RT (Reverse
Transcripsion) dapat dilakukan dalam tabung yang sama dengan PCR (one-step
PCR) atau pada tabung yang terpisah (two-step PCR) menggunakan suhu berkisar
40°C sampai 50°C, tergantung pada karakteristik reverse transcriptase yang
digunakan.
b. Tahap denaturasi dsDNA at 95°C,
Pada tahap ini dua untai DNA akan terpisah dan primer dapat mengikat pada untai
tersebut jika temperaturnya diturunkan kemudian yang selanjutnya akan dimulai
rantai reaksi baru. Kemudian suhu diturunkan hingga mencapai suhu anealing yang
bervariasi
tergantung
primer
yang
digunakan,
konsentrasi,
probe
dan
konsentrasinya jika digunakan, dan juga konsentrasi kation. Perhatian utama saat
memilih temperatur anealing optimal adalah melting temperatur ™ dari primer dan
probe (jika digunakan). Temperatur annealing dipilih untuk PCR tergantung
langsung pada panjang dan komposisi dari primer tersebut. Hal ini merupakan hasil
dari perbedaan ikatan hidrokarbon antara A-T (2 ikatan) dan G-C (3 ikatan).
Temperatur annealing biasanyaberkisar 5 derajat di bawah Tm terendah dari
pasangan primer yang digunakan.
c. Amplifikasi PCR
Amplifikasi PCR yang merupakan proses dimana dilakukannya perpanjangan DNA
menggunakan Primer yang memerlukan Taq DNA polymerase yang termostabil,
biasanya pada suhu 72°C, yang merupakan suhu optimal untuk aktivitas enzim
polymerase. Lamanya masa inkubasi tiap temperatur, perubahan suhu dan jumlah
siklus dikontrol secara terprogram menggunakan programmable thermal cycler.
Analaisa produk PCR tergantung pada kebutuhann PCR. Jika menggunakan PCR
konvensional,
maka
produk
PCR
dapat
dideteksi
dengan
agarose
gel
electrophoresis dan ethidium bromide (atau dye nukleotida lainnya).
5.) Jelaskan prinsip kerja ELISA!
ELISA adalah metode untuk mendeteksi sekuen tertentu dalam produk PCR. Meskipun
banyak metode yang tersedia untuk mendeteksi sekuen tersebut, ELISA PCR berguna
untuk mendeteksi dan membedakan antara beberapa sasaran dari sequen yang
diinginkan. ELISA PCR ini juga berguna untuk screening beberapa sampel, terutama
bila jumlah sampel tidak menjamin. Salah satu prinsip kerjanya PCR-ELISA adalah
membedakan antara produk reaksi perubahan polimerase yang dihasilkan dari
seperangkat primer yang mengandung variasi