PENEKANAN EKSPRESI ENZIM COX

PENEKANAN EKSPRESI ENZIM COX-2 PADA KULTUR SEL RAJI OLEH
EKSTRAK KLOROFORM DAUN CANGKRING (Erythrina fusca Lour.)
Zullies Ikawati, Agung Endro Nugroho, Widyah Astutiningsih
Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada
ABSTRAK
Prostaglandin, salah satu mediator yang bertanggung jawab terhadap proses inflamasi dan
perkembangan kanker, disintesis dari asam arakidonat dengan katalisasi enzim siklooksigenase (COX).
Enzim COX terdiri dari 2 isoform, yaitu COX-1 dan COX-2. Enzim COX-2 diketahui meningkat
ekspresinya pada inflamasi dan kanker. Daun cangkring (E. fusca) telah dilaporkan memiliki efek
antiinflamasi dan antiproliferatif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan ekstrak kloroform
daun E. fusca dalam menekan ekspresi enzim COX-2 pada kultur sel Raji.
Penelitian diawali dengan uji sitotoksik ekstrak kloroform daun E. fusca dengan kadar masingmasing: 2, 4, 8, 16, 32, dan 64 µg/ml, untuk menentukan harga LC50 yang akan digunakan uji penekanan
ekspresi enzim COX-2. Selanjutnya dilakukan uji penekanan ekspresi enzim COX-2 dengan metode
immunositokimia. Kemampuan penekanan dinyatakan dalam % dibandingkan dengan kontrol.
Hasil uji sitotoksik menunjukkan bahwa harga LC50 adalah sebesar 4,05 µg/ml. Hasil uji
penekanan ekspresi enzim COX-2 menunjukkan bahwa kenaikan kadar ekstrak uji berbanding lurus dengan
peningkatan kemampuan ekstrak dalam menekan ekspresi enzim COX-2. Penekanan ekspresi enzim COX2 pada kadar ekstrak uji 2, 4, dan 8 µg/ml berturut-turut adalah sebesar (dalam %) 45,54 ± 0,16; 53,88 ±
1,47; dan 73,35 ± 1,06.
Kata kunci: E. fusca, enzim COX-2, kultur sel Raji, imunositokimia
ABSTRACT
Prostaglandin, one of the mediators responsible for inflammation process and development of
cancer, is synthesized from arachidonic acid with catalization of cyclooxygenase (COX). COX exists in 2
isoforms, i.e. COX-1 and COX-2. COX-2 is highly expressed in inflammation process and cancer
development. The leaves of E. fusca has been reported to have antiinflammation and antiproliferation
activities. The research aims to study whether the chloroform extract of E. fusca Lour leaves could suppress
the expression of COX-2 enzyme that is exposed in Raji cell line.
The expression of COX-2 was observed using immunocytochemistry method. The concentration
of extract used was determined from LC50 in cytotoxicity study. The LC50 of the extract was 4,05 µg/ml.
Results shows that the extract with the concentration of 2, 4, and 8 µg/ml were able to suppress the
expression of COX-2 in Raji cell line, with the suppression activity of (in %) 45,54 ± 0,16; 53,88 ± 1,47;
and 73,35 ± 1,06, respectively.
Key words : E. fusca leaves, COX-2 expression, Raji cell line, immunocytochemistry.
PENDAHULUAN
Tanaman E. fusca (cangkring) telah
dilaporkan memiliki aktivitas antiinflamasi
pada model kaki tikus terinduksi karagenin
(Nurliani, 2003; Ikawati, et al, 20061) dan
antiproliferatif pada kultur sel kanker HeLa
(Puspitasari, 2004). Tanaman ini juga terbukti
mengandung terpenoid, fenol, dan flavonoid
dalam ekstrak kloroform daun cangkring
(Wahyuningsih, 2004), dimana flavonoid dan
terpenoid berperan dalam regulasi enzim
siklooksigenase (COX) (Perera et al., 2001).
Enzim siklooksigenase merupakan
enzim yang mengkatalisis pembentukan
prostaglandin, suatu mediator inflamasi,
produk metabolisme asam arakidonat. Enzim
COX terdiri dari 2 isoenzim yaitu: COX-1 dan
COX-2. Enzim COX-1 bersifat konstitutif
untuk memelihara fisiologi normal dan
homeostasis, sedangkan COX-2 merupakan
enzim yang terinduksi pada sel yang
mengalami inflamasi (Leahy et al., 2000).
COX-2 juga berperan dalam proliferasi sel
kanker. Overekspresi COX-2 ditemukan pada
kebanyakan tumor (Simmons and Moore,
2000).
Mengingat besarnya peran COX-2
dalam proses inflamasi dan kanker, maka
perlu dilakukan pencarian agen yang dapat
mempengaruhi regulasi enzim COX-2,
misalnya melalui penekanan ekspresi enzim
COX-2. Tanaman E. fusca merupakan salah
satu
tanaman yang berpotensi untuk
dikembangkan sebagai agen penghambat
COX-2
dengan
aktivitasnya
sebagai
antiinflamasi dan antiproliferasi sel kanker.
Ekstrak etanolnya telah dilaporkan dapat
menekan ekspresi enzim COX-2 (Ikawati, et
al., 20062). Untuk itu, perlu diteliti apakah
ekstrak kloroform daun E. fusca Lour juga
dapat mempengaruhi regulasi COX-2 melalui
mekanisme penekanan ekspresi COX-2.
Kultur sel Raji dipilih sebagai media karena
memiliki ekspresi COX-2 yang tinggi. Sel Raji
merupakan ‘continous cell line’ yang
diturunkan dari sel ß-Limfoma manusia
(Anonim, 2001). Penelitian oleh Wun
melaporkan bahwa sel Raji terbukti
mengekspresikan COX-2 dalam jumlah yang
cukup besar yaitu 2,2 - 4,3 kali lebih besar
daripada sel B normal (Wun, dkk., 2004).
METODOLOGI
1. Bahan
Daun E. fusca Lour, kloroform
(Brataco), RPMI (Rosewell Park Memorial
Institute) 1640 (Sigma), Hepes (Sigma),
Fetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v)
(Gibco), penisilin-streptomisin 1% (v/v)
(Gibco), fungison 0,5% (v/v) (Gibco),
kultur sel Raji, DMSO 100%, COX-2mouse monoclonal antibody (Novo Castra),
biotinylated Goat Anti-Polyvalent (Lab
Vision), Streptavidin-Peroxidase (Lab
Vision), DAB (3,3’ Diaminobenzinidine)
(Lab Vision).
2. Alat
Alat-alat gelas, mikroskop cahaya,
tissue culture flask (Nunclon), tabung
conical (Nunclon), plate 96 wheel
(Nunclon), coverslip, poly-l-lysine slide,
plate 24 (Nunclon).
3. Jalannya Penelitian
Pembuatan ekstrak kloroform daun E
fusca Lour
Ekstraksi
dilakukan
dengan
maserasi serbuk daun E. fusca 500 gram
menggunakan
kloroform.
Serbuk
direndam sempurna dengan penyari
berada 2 cm di atas serbuk sebanyak 3 x
sampai sisa ampas jernih, masing-masing
maserasi dilakukan selama 2 x 24 jam
sambil sesekali digojog. Sari yang
diperoleh kemudian dihilangkan dari
penyarinya
dengan
menggunakan
evaporator. Sari yang diperoleh disebut
sari kloroform. Sari kloroform diuapkan
hingga diperoleh ekstrak kental sebanyak
42,04 gram.
Uji
sitotoksik
dengan
metode
penghiungan langsung
Ke dalam 100,0 µl suspensi sel pada
setiap sumuran yang berbeda (kepadatan
sel 2 x 104 sel /sumuran) masing-masing
ditambahkan 100,0 µl sampel dalam
media kultur RPMI 1640 hingga dicapai
seri kadar akhir dalam sumuran yaitu 64;
32; 16; 8; 4; dan 2µg/ ml. Pada kontrol
media, 100,0 µl senyawa uji diganti
dengan 100,0 µl media kultur, sedang
pada kontrol pelarut, diganti dengan 5,0 µl
DMSO 0,25 % dan 95,0 µl media kultur.
Selanjutnya plate diinkubasikan dalam
inkubator 5% CO2 selama 24 jam pada
suhu 370C, lalu ditambahkan 50,0 µl
larutan biru triptan 0,5 % dalam akuades.
Setelah itu larutan dalam tiap sumuran
diresuspensi kuat dan diambil 10,0 µl
untuk
penghitungan
sitotoksistas
menggunakan
metoda
penghitungan
langsung dengan bantuan biru tripan.
Uji penekanan ekspresi enzim COX-2
dengan media sel Raji
Ke dalam suspensi sel pada setiap
sumuran yang berbeda (kepadatan sel 5 x
105 sel/ sumuran) ditambahkan 1000 µl
sampel dalam media kultur RPMI 1640
hingga dicapai seri kadar akhir dalam
sumuran yaitu 8; 4; dan 2 µg/ml. Pada
kelompok kontrol, 1000 µl sampel diganti
dengan 1000 µl media kultur. Selanjutnya
plate diinkubasikan dalam inkubator 5%
CO2 selama 24 jam pada suhu 370C. Sel
yang telah diinkubasi kemudian dipanen
dan dibuat apusan pada gelas obyek (polyl-lysine slide) untuk diuji secara
imunositokimia menggunakan antibodi
(IgG) primer monoklonal mencit anti
COX-2, dan divisualisasikan dengan
reaksi warna. Ekspresi COX-2 diamati
menggunakan mikroskop cahaya. Sel yang
mengekspresikan protein COX-2 akan
memberikan
warna
coklat/gelap,
sedangkan yang tidak akan memberikan
warna ungu/ biru. Jumlah sel dihitung
pada luasan tertentu, baik yang berwarna
coklat/gelap maupun yang berwarna biru,
kemudian dianalisis seperti tertera di
bawah ini.
dengan metode probit untuk menentukan
persamaan garis regresi dan harga LC50.
Uji immunositokimia
Persen penekanan ekspresi COX-2
dihitung dengan rumus:
%
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Uji Sitotoksisitas
Uji sitotoksisitas dilakukan untuk
memberikan gambaran kemampuan ekstrak
kloroform daun E. fusca dalam memberikan
efek toksik terhadap sel Raji yang dinyatakan
dengan harga LC50 (konsentrasi senyawa uji
yang dapat menghambat 50% pertumbuhan
sel). Uji sitotoksisitas ini dilakukan dengan
metode
perhitungan
langsung
(direct
counting)
dengan
bantuan
neubauer
haemocytometer.
Ekstrak kloroform daun E. fusca larut
dengan baik dalam DMSO sehingga sebagai
pelarut digunakan DMSO. Penggunaan
DMSO sampai kadar 1,25% v/v pada sel Hela
dan sel Raji relatif tidak berpengaruh terhadap
proliferasi sel (Da’i, 2003). Pada percobaan
yang dilakukan untuk konsentrasi ekstrak
kloroform daun E. fusca tertinggi, konsentrasi
pelarut DMSO yang digunakan adalah 0,64%
v/v sehingga pengaruh pelarut kemungkinan
sangat kecil.
jml sel hidup kontrol – jmlh sel hidup sampel
x 100 %
jumlah
sel
hidup
Selanjutnya dibuat grafik hubungan
antara kadar sampel terhadap persentase
kematian sel dan dilakukan uji korelasi
jml sel yang mengekspresikan COX-2
total sel terhitung
Persen penekanan ekspresi enzim COX-2
dianalisis secara statistik dengan metode
ANOVA satu jalan, dilanjutkan dengan
uji LSD dengan taraf kepercayaan 95%.
Analisis hasil
Uji sitotoksisitas
Persentase kematian sel dengan rumus
sebagai berikut:.
% kematian =
penekanan 100 %
x100
Tabel 1. Prosentase kematian dan nilai probit pada uji sitotoksisitas dengan perlakuan
seri konsentrasi ekstrak kloroform daun E. fusca pada kultur sel Raji
pemberian
Kadar (µg/ml)
Log Kadar
% kematian sel
probit
2
4
8
16
32
64
0,3010
0,6021
0,9031
12,041
15,051
18,062
42,70
50,52
57,81
62,50
72,39
81,25
4,82
5,02
5,20
5,30
5,58
5,88
Tabel 2. Purata penekanan ekspresi enzim COX-2 oleh ekstrak kloroform daun E. fusca pada kultur sel
Raji, dibandingkan dengan kontrol negatif. Percobaan dilakukan 3 kali secara duplikat.
Perlakuan
Purata penekanan ekspresi enzim COX-2
(dalam %) ± SEM
Kontrol negatif
0.11 ± 0.11
Kadar 2 µg/ml
45.54 ± 0.16
Kadar 4 µg/ml
53.88 ± 1.47
Kadar 8 µg/ml
73.35 ± 1.06
A
C
B
D
E
Gambar 1. Hasil pengecatan immunositokimia terhadap COX-2 dengan media sel Raji pada pengamatan di
bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 40 X. A. kontrol negatif, yaitu kelompok tanpa larutan uji dengan
pengecatan antibodi spesifik COX-2. Terlihat semua sel tercat coklat, menunjukkan hasil positif terhadap enzim
COX-2. B. blangko; kelompok tanpa senyawa uji dan tanpa pengecatan antibodi spesifik COX-2. C s/d E :
Perlakuan ekstrak kloroform daun E. fusca dengan kadar 2 µg/ml (C), 4 µg/ml (D), dan kadar 8 µg/ml (E).
Tanda panah hitam menunjukkan hasil positif COX-2, tanda panah kuning menunjukkan hasil negatif COX-2.
Perhitungan sel pada uji sitotoksik dilakukan
dengan mengamati sel hidup dan mati akibat
perlakuan. Sel mati ditampilkan dengan warna
biru oleh biru tripan, sedangkan sel yang
hidup akan berwarna terang jelas. Hasil uji
sitotoksisitas dapat dilihat pada tabel 1.
Terlihat bahwa terjadi hubungan yang linier
antara kenaikan kadar ekstrak uji dengan
persen kematian sel Raji. Dari hasil analisis
probit diperoleh bahwa harga LC50 ekstrak
kloroform daun E. fusca adalah sebesar 4,05
µg/ml. Dari hasil uji sitotoksisitas ini
ditetapkan kadar untuk uji penekanan ekspresi
enzim COX-2 adalah dengan kisaran kadar 2,
4, dan 8 µg/ml.
B. Uji penekanan ekspresi enzim COX-2
dengan metode immunositokimia
Dalam penelitian ini pengamatan uji
penekanan ekspresi enzim COX-2 dilakukan
dengan cara imunnositokimia metode Labeled
Streptavidin Biotin (LSAB) yang kemudian
dianalisa secara kualitatif dan kuantitatif.
Dari analisis secara kualitatif dapat
terlihat bahwa dengan peningkatan kadar
ekstrak uji, sel-sel yang mengekspresikan
COX-2 positif semakin sedikit, menunjukkan
bahwa telah terjadi penurunan ekpresi enzim
COX-2 pada sel Raji. Hasil pengecatan
immunositokimia dapat dilihat pada gambar 1.
Selanjutnya,
dilakukan
analisis
kuantitatif untuk mengetahui % penekanan
ekspresi enzim COX-2 oleh ekstrak uji
Kuantifikasi % penekanan ekspresi enzim
COX-2 dilakukan dengan terlebih dahulu
menghitung % ekspresi protein COX-2. Hasil
perhitungannya dapat dilihat pada tabel 2.
Pada tabel 2 terlihat bahwa kenaikan
konsentrasi ekstrak kloroform 2; 4; 8 (µg/ml)
memberikan rata-rata % penekanan ekspresi
COX-2 yang semakin meningkat, yaitu
masing-masing
sebesar
45,54±0,16%;
53,88±1,47%; dan 73,35±1,06%. Sedangkan
pada kontrol rata-rata penekanan enzim adalah
sebesar 0,11±0,11%.
Selanjutnya data % penekanan
ekspresi enzim COX-2 pada masing-masing
kelompok perlakuan dan kontrol dianalisis
secara statistik menggunakan analisis statistik
parametrik ANOVA satu jalan dilanjutkan
dengan
uji
LSD.
Analisis
statistik
menunjukkan % penekanan ekspresi enzim
COX-2 pada berbagai kelompok perlakuan
dan kontrol memberikan perbedaan yang
bermakna (p < 0,05). Kenaikan kadar ekstrak
uji yang diberikan mampu memberikan
peningkatan % penekanan ekspresi enzim
COX-2 secara signifikan bila dibandingkan
dengan kontrol. Dengan demikian maka
ekstrak kloroform daun E. fusca dikatakan
mempunyai kemampuan dalam penekanan
ekspresi enzim COX-2 secara tergantung
dosis.
Hasil penelitian ini mendukung
penelitian sebelumnya mengenai aktivitas
ekstrak kloroform daun E. fusca sebagai
antiinflamasi (Nurliani, 2003; Ikawati, et al,
20061), dan antiproliferasi sel kanker
(Puspitasari, 2004). Enzim COX-2 merupakan
enzim yang bertanggung jawab terhadap
respon inflamasi dan produksi prostaglandin
(Leahy et al., 2000) dan terekspresi tinggi
dalam sel tumor (Abukhalaf, 2004).
Prostaglandin dilaporkan berperan dalam
upregulasi
VEGF
dan
menginduksi
angiogenesis pada sel tumor (Akarasereenont
et
al.,
2002).
Penekanan
produksi
prostagandin PGE2 akan menurunkan ekspresi
bcl-2, suatu antiapoptosis (Shacter and
Weitzman, 2002). Dengan demikian diduga,
aktivitas ekstrak uji sebagai antiinflamasi dan
antikanker diperantarai oleh penghambatan
COX-2 sebagai salah satu mekanismenya.
Ekstrak kloroform nampaknya memiliki
potensi yang lebih besar dalam penekanan
ekspresi COX-2 dibandingkan dengan ekstrak
etanol. Jika ekstrak etanol memerlukan
konsentrasi 250 µg/ml untuk memberikan
penekanan ekspresi COX-2 pada sel Raji
sebesar 70,19 % (Ikawati, et al, 20062),
ekstrak kloroform dapat menekan ekspresi
COX-2 sebesar 75.35% pada konsentrasi
hanya 8 µg/ml. Karena itu, ekstrak kloroform
ini lebih potensial untuk dikembangkan
sebagai obat, penekan ekspresi COX-2.
Senyawa aktif apa yang terutama
bertanggungjawab terhadap semua efek ini
belum diteliti lebih lanjut, namun ada dugaan
bahwa senyawa aktifnya adalah flavonoid dan
terpenoid, karena Perera et al (2001)
melaporkan bahwa flavonoid dan terpenoid
pberperan dalam regulasi enzim COX-2.
Namun demikian, Perlu dilakukan penelitian
lebih lanjut untuk mengetahui fraksi aktif apa
dari ekstrak uji yang memiliki efek penekanan
ekspresi COX-2. Hal ini diharapkan dapat
memperkaya bukti-bukti ilmiah akan aktivitas
ekstrak tersebut sebagai antiinflamasi dan
antikanker.
KESIMPULAN
Dari penelitian dengan menggunakan
ekstrak kloroform daun E. fusca Lour dapat
ditarik kesimpulan bahwa ekstrak kloroform
daun E. fusca Lour dengan kadar 2; 4; dan 8
µg/ml mampu menekan ekspresi enzim COX2 secara bermakna dibandingkan kelompok
kontrol pada media sel Raji, berturut-turut
sebesar (dalam %) 45,54 ± 0,16; 53,88 ± 1,47;
dan 73,35 ± 1,06.
DAFTAR PUSTAKA
Abukhalaf, I.K., von Deutsch, D.A., Bayorh, M.A.,
2004,
Cyclooxygenase
Inhibitors,
Disease-Modifying Antirheumatic Agents,
and Drugs Used in Gout, dalam Handbook
of Drug Interaction A Clinical and
Forensic Guide, 2004, 337-365, Homana
Press, New Jersey
Akarasereenont, P.C., Techatraisak, K., Thaworn,
A., and Chotewuttakorn, S., 2002, The
expression of COX-2 in VEGF-treated
endothelial cells is mediated through
protein tyrosine kinase, Mediators
Inflamm., 11 (1), 17-24
Anonima, 2001, Raji, http://www.biowhittaker.be.,
Juni 2005
Ikawati, Z., Sismindari, Nugroho, A.E., 20061,
Efek ekstrak daun Erythrina fusca Lour
terhadap edema dan rekrutmen neutrofil
pada respon inflamasi akut pada tikus,
MOT, 11(36), 37-41
Ikawati Z., Nugroho, A.E., Windha, W., 20062,
Efek ekstrak etanol daun Erythrina fusca
Lour terhadap penekanan ekspresi enzim
siklooksigenase-2 pada kultur sel Raji,
MFI, accepted, in press
Leahy, K.M., Ornberg, R.L., Wang, Y., Zweifel,
B.S., Koki, A.T., dan Masferrer, J.L.,
2002, Cyclooxygenase-2 Inhibition by
Celecoxib Reduces Proliferation and
Induces Apoptosis in Angiogenic
Endothelial Cells in Vivo, Cancer Res.,
62, 625–631
Nurliani, M., 2003, Uji Antiinflamasi Ekstrak
Metanol Daun Cangkring (Erythrina fusca
Lour.) terhadap Inflamasi Akibat Reaksi
Anafilaksi Kutaneus Aktif pada Tikus
Wistar Jantan, Skripsi, Fakultas Farmasi
Universitas Gadjah Mada, Yoyakarta
Perera, P., Ringbom, T., Huss, U., Vasage, M., and
Bohlin, L., 2001, Search for Natural
Product which Affect Cyclooxygenase-2,
in
Tringali, C., (Ed.), Bioactive
Compounds from Natural Sources:
Isolation,
Characterisation,
and
Biological Properties, 434-465, Taylor
and Francis, London.
Puspitasari, E., 2004, Efek Antiproliferatif Ekstrak
Kloroform Daun Tumbuhan E. fusca Lour
(Erythrina fusca Lour.) dan Beberapa
Isolatnya terhadap Sel HeLa, Skripsi,
Fakultas Farmasi Universitas Gadjah
Mada, Yogyakarta
Shacter, E., and Weitzman, S.A., 2002, Chronic
Inflammation and Cancer, Oncology, 16
(2), 217-232.
Simmons, D.L., Moore, B.C., 2000, COX-2
Inhibition,
Apoptosis,
and
Chemoprevention by Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs, Curr Med Chem, 7,
1131-1144
Wahyuningsih, P., 2004, Isolasi dan Identifikasi
Senyawa yang Terkandung dalam Ekstrak
Kloroform Daun Cangkring (Erythrina
fusca Lour.), Skripsi, Fakultas Farmasi
Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
Wun T, Mc Knight H, Tuscano JM., 2004,
Increased cyclooxygenase-2 (COX-2): a
potential role in pathogenesis of
lymphoma, Leuk Res. 28(2):179-90.