KOMPOSISI KIMIA DAN IDENTIFIKASI SENYAWA
advertisement
KOMPOSISI KIMIA DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK TAMBELO (Bactronophorus thoracites) JULIANA LEIWAKABESSY Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Teknologi Hasil Perairan SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Dra. Purwantiningsih S,MS Judul Tesis Nama NRP : Komposisi Kimia dan Identifikasi Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Tambelo (Bactronophorus thoracites) : Juliana Leiwakabessy : C351070051 Disetujui, Komisi Pembimbing Dr. Ir. Linawati Hardjito, M.Sc Ketua Dr. Ir. Sri Purwaningsih, M.Si Anggota Diketahui, Ketua Program Studi Teknologi Hasil Perairan Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, MSi NIP: 19700807 1996 032002 Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr NIP: 19650814 1990 021001 Tanggal Ujian: 28 September 2011 Tanggal Lulus: KOMPOSISI KIMIA DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK TAMBELO (Bactronophorus thoracites) JULIANA LEIWAKABESSY SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul “ Komposisi Kimia dan Identifikasi Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Tambelo (Bactronophorus thoracitesi)” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini Bogor, September 2011 Juliana Leiwakabessy NRP C351070051 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Ambon pada tanggal 24 November 1969 dari ayah Melkias Leiwakabessy dan Ibu Maria Tapilatu. Penulis merupakan putri keenam dari tujuh bersaudara. Tahun 1989 penulis lulus dari SMU Negeri 2 Ambon dan pada tahun 1997 penulis lulus dari Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Jurusan Pengolahan Hasil Perikanan Universitas Pattimura. Pada tahun 2007, penulis melanjutkan pendidikan sekolah Pascasarjana (S2) di Teknologi Hasil Perairan IPB dengan sponsor BPPS. Penulis bekerja sebagai staf dosen di Jurusan Perikanan, Fakultas Peternakan Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Negeri Papua sejak tahun 2003 hingga sekarang. @ Hak Cipta milik Institut Pertanian Bogor Tahun 2011 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulisan ini tanpa mencantumkan atau menyebut sumber. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan atau memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB. DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL .............................................................................................. xii DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xiv 1 PENDAHULUAN .......................................................................................... 1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1,2 Perumusan Masalah ................................................................................. 1.3 Tujuan Penelitian ..................................................................................... 1.4 Manfaat Penelitian ................................................................................... 1.5 Kerangka Pemikiran ................................................................................ 1 1 2 3 3 3 2 TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................. 5 2.1 Tambelo .................................................................................................. 5 2.2 Potensi Tambelo Bagi Masyarakat ......................................................... 6 2.3 Komposisi Kimia .................................................................................... 7 2.3.1 Asam amino .................................................................................. 9 2.3.2 Asam lemak .................................................................................. 11 2.3.3 Mineral ......................................................................................... 13 2.4 Komponen Bioakif dari Moluska ........................................................... 16 2.5 Antioksidan dan Pengukurannya ............................................................ 17 3 METODOLOGI PENELITIAN ..................................................................... 21 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................. 21 3.2 Bahan dan Alat ........................................................................................ 22 3.3 Prosedur Penelitian .................................................................................. 22 3.3.1 Penelitian tahap pertama ................................................................ 22 3.3.3.1 Rendemen (Hustiany 2005) ............................................... 23 3.3.3.2 Uji proksimat (AOAC 2005) ............................................. 23 3.3.3.3 Analisis asam amino (AOAC 1994) ................................... 26 3.3.3.4 Analisis asam lemak (AOAC 1984) ................................... 27 3.3.3.5 Analisis mineral ................................................................. 30 3.3.2 Penelitian tahap kedua ................................................................... 32 3.3.2.1 Ekstraksi bahan aktif ......................................................... 32 3.3.2.2 Uji fitokimia (Departemen Kesehatan RI 1995)................. 34 3.3.2.3 Uji aktivitas antioksidan (Yeh dan Cen 1995).................... 35 3.3.2.4 Fraksinasi senyawa antioksidan ......................................... 35 3.3.2.5 Identifikasi senyawa antioksidan (Willard et al. 1988) ..... 38 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................... 39 4.1 Penelitian Tahap Pertama ........................................................................ 39 4.1.1 Rendemen daging tambelo ............................................................ 39 4.1.2 Kandungan proksimat tambelo ..................................................... 39 4.1.3 Kandungan asam amino tambelo .................................................. 42 4.1.4 Kandungan asam lemak tambelo .................................................. 47 viii 4.1.5 Kandungan mineral tambelo ......................................................... 49 4.2 Penelitian Tahap Kedua .......................................................................... 52 4.2.1 Rendemen ekstrak tambelo ........................................................... 52 4.2.2 Kandungan fitokimia ekstrak tambelo .......................................... 52 4.2.3 Aktivitas antioksidan ekstrak tambelo .......................................... 54 4.2.4 Fraksi ekstrak terpilih ................................................................... 56 4.2.5 Kandungan fitokimia fraksi tambelo ............................................ 57 4.2.6 Aktivitas antioksidan fraksi tambelo ............................................ 58 4.2.7 Identifikasi senyawa fraksi terpilih ............................................... 60 5 SIMPULAN DAN SARAN ........................................................................... 63 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 64 LAMPIRAN ....................................................................................................... 71 ix DAFTAR TABEL Halaman 1 Beberapa fungsi asam amino dalam tubuh ................................................... 11 2 Rendemen daging tambelo ............................................................................ 39 3 Kandungan proksimat daging tambelo ......................................................... 39 4 Klasifikasi asam amino berdasarkan sifat fisik dan kimia tambelo .............. 43 5 Skor kimia asam amino esensial tambelo ..................................................... 47 6 Komposisi asam lemak ekstrak kasar tambelo .............................................. 48 7 Kandungan mineral yang terdapat pada tambelo ......................................... 50 8 Kandungan fitokimia ekstrak tambelo ......................................................... 52 9 Aktivitas antioksidan ekstrak tambelo .......................................................... 55 10 Kandungan fitokimia fraksi tambelo ............................................................ 61 x DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Kerangka pemikiran .................................................................................... 3 2 Tambelo (Bactronophorus thoracites) .......................................................... 6 3 Masyarakat Kamoro mengkonsumsi tambelo metah (Muller 2004) ............. 7 4 Mekanisme reaksi oksidasi lemak (Gordon 1990) ...................................... 18 5 Reaksi pengujian aktivitas antioksidan dengan DPPH (Munifah 2007) ....... 20 6 Diagram alir penelitian komposisi kimia dan identifikasi senyawa antioksidan dari ekstrak tambelo (Bactronophorus thoracites) ................... 21 7 Prosedur analisis asam amino menggunakan HPLC .................................... 28 8 Diagram alir ekstraksi bahan aktif tambelo (Ebada et al. 2008) .................. 33 9 Diagram alir fraksinasi dengan menggunakan KLT ..................................... 36 10 Diagram alir fraksinasi dengan kromatografi kolom .................................... 37 11 Histogram kandungan asam amino dari tambelo ......................................... 42 12 Nilai IC50 dari ekstrak, BHT, dan vitamin super ester C .............................. 55 13 Profil pemisahan senyawa dengan eluen kloroform : metanol (9 : 1) .......... 57 14 Aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi-fraksi tambelo .............................. 59 15 Mekanisme penghambatan radikal DPPH ........................................................ 63 16 Komponen fraksi teraktif dari tambelo dengan mass 352 m/z yang terdeteksi sebagai kelompok senyawa terpenoid ..................................65 xi DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Nilai rata-rata hasil analisis proksimat tambelo segar dan kering .................................................................................................... 75 2 Nilai rata-rata asam amino tambelo ............................................................. 75 3 Kromatogram standar asam amino pada HPLC ........................................... 76 4 Kromatogram asam amino daging tambelo pada HPLC .............................. 77 5 Kromatogram standar asam lemak pada GC ............................................... 78 6 Kromatogram asam lemak daging tambelo pada GC ................................... 80 7 Perubahan warna yang mengindikasikan reaksi peredaman DPPH dari ekstrak tambelo ...................................................................................... 81 8 Perhitungan persen inhibisi dan IC50 pada BHT, vitamin super ester C dan ekstrak kasar tambelo ............................................................................. 82 9 Profil pola pemisahan senyawa .................................................................... 87 10 Rendamen fraksi tambelo ............................................................................. 88 11 Perhitungan persen inhibisi (IC50) hasil fraksinasi tambelo ......................... 88 12 Hasil identifikasi senyawa terpenoid tambelo pada LC-MS ........................ 89 xii ABSTRACT JULIANA LEIWAKABESSY. Chemical Composition and Identification of Antioxidant Compounds from the Extracts of Tambelo (Bactronophorus thoracites). Supervised by LINAWATI HARDJITO and SRI PURWANINGSIH Tambelo (Teredinidae) is consumed freshly by local people in Papua without removing the digestive tracts. This study aimed to investigate the chemical composition of fresh tambelo, to conduct antioxidant and phytochemistry tests, and to identify the compound of active antioxidant obtained from selected fractionated extract. The research consisted of two stages. The first stage involved the analyses of proximate, fatty acid, amino acid and mineral. The second stage was the extraction of active materials by means of maceration. The maceration result was evaporated and partitioned with a solvent of n-hexane and ethyl acetate. Next, the extract underwent phytochemical and antioxidant tests (20, 40. 60, and 80 ppm) with DPPH method applying BHT and vitamin super ester C as the standard with a concentration of 4, 6, 8 and 10 ppm. Finally, the identification of fresh antioxidant compound was carried out using LC-MS. The composition of fresh tambelo divided into moisture 82,72±0,01%, protein 7,21±0,31%, fat 0,28±0,04%, ash 2,07±0,27%, and carbohydrate (by difference) 7,72±0,62%. The composition of dried tambelo was moisture 6,63±0,01%, protein 42,77±2,01%, fat 14,27±0,22%, ash 5,88±1,04%, carbohydrate (by difference) 30,45±2,83%. The protein of tambelo contained nine essential amino acids and eight non essensial amino acids. It had seven saturated fatty acids and eight unsaturated fatty acids. It contained calcium of 3532,46 ppm and phosfor of 2363,06 ppm. The highest antioxidant activity was found in the crude extract of ethyl acetate with IC50 of 15 ppm. The highest antioxidant activity obtained by column fractionation was the 9th fraction with IC50 of 8.87 ppm. Phytochemical test, described the crude extract of tambelo contained a group of alkaloid, flavonoid, steroid and triterpenoid. MarinLit database (Blunt and Blunt 2008), 9th fraction was similar to farnesic acid glyceride, sesquiterpenoic acid glyceride and labdane diterpenoid. Keywords: Activity antioxidants, Teredinidae, shipworm, chemical, compound RINGKASAN JULIANA LEIWAKABESSY. Komposisi Kimia dan Identifikasi Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Tambelo (Bactronophorus thoracites). Dibimbing oleh LINAWATI HARDJITO dan SRI PURWANINGSIH. Di Papua masyarakat mengkonsumsi tambelo dalam keadaan mentah tanpa harus dibuang isi pencernaannya terlebih dahulu. Mereka percaya bahwa isi pencernaan tambelo berkhasiat untuk mengobati beberapa penyakit diantaranya, flu, malaria, sakit pinggang, rematik, meningkatkan air susu ibu, nafsu makan dan vitalitas pria. Organisme ini mempunyai potensi ekonomis yang perlu diteliti tentang keberadaan kandungan komponen bioaktif yang terdapat di dalamnya. Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan komposisi kimia tambelo segar, mendapatkan antioksidan dan fitokimia, serta mengidentifikasi senyawa aktif antioksidan hasil fraksinasi ekstrak terpilih. Penelitian ini terdiri dari dua tahap. Tahap pertama adalah analisis rendemen, uji proksimat, asam lemak, asam amino, dan mineral dalam tambelo. Tahap kedua meliputi ekstraksi bahan aktif tambelo dengan cara maserasi, pengujian aktivitas antioksidan, analisis fitokimia, dan identifikasi senyawa antioksidan menggunakan LC-MS. Tambelo segar (Bactronophorus thoraites) yang berasal dari perairan Andai, Kabupaten Manokwari memiliki kadar air 82,72±0,01%, protein 7,21±0,31% lemak 0,28±0,04%, abu 2,07±0,27%, dan karbohidrat (by difference) 7,72±0,62%. Tambelo kering memiliki kadar air 6,63±0,01%, protein 42,77±2,01%, lemak 14,27±0,22%, abu 5,88±1,04%, dan karbohidrat 30,45±2,83%. Tambelo mengandung 9 asam amino esensial dan 8 asam amino non esensial. Asam amino esensial yang terdapat pada tambelo, yaitu treonin 0,37%, valin 1,29%, metionin 0,56%, isoleusin 0,34%, leusin 1,25%, fenilalanin 1,19%, lisin 1,81%, histidin 1,01%, arginin 1,80% dari berat protein. Asam amino non esensial pada tambelo, yaitu asam aspartat 2,85%, asam glutamat 3,55%, serin 1,26%, glisin 1,74%, alanin 1,63%, prolin 0,41%, tirosin 0,72%, dan sistein 0,41% dari berat protein. Tambelo memiliki 7 asam lemak jenuh (saturated fatty acid/SAFA) yang terdiri atas miristat (C14:0) 5,80%, pentadekanoat (C15:0) 0,10%, palmitat (C16:0) 13,69%, heptadekanoat (C17:0) 0,66%, stearat (C18:0) 3,04%, arakidat (C20:0) 0,22%, heneikosanoat acid (C21:0) 0,80%, dan 8 asam lemak tidak jenuh yang terdiri dari miristoleat (C14:1) 0,33%, palmitoleat (C16:1) 14,55%, Cis-10Heptadekanoat (C17:1) 0,24%, EPA (C20:4ω3) 0,13%, dan arakidonat (20:4ω6) 0,29% dari berat minyak. Kandungan mineral pada tambelo yaitu kalsium 3532,46 ppm, kalium 626,4 ppm, natrium 435,42 ppm, fosfor 2363,06 ppm, dan besi 1373,45 ppm. Hasil uji fitokimia menunjukkan ekstrak kasar tambelo mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, steroid dan triterpenoid (n-heksana, etil asetat, dan metanol). Rendemen ekstrak kasar tambelo kering yang terbesar adalah ekstrak kasar metanol 5,72%. Ekstrak kasar etil asetat memiliki aktivitas antioksidan dengan IC50 sebesar 15 ppm. Aktivitas antioksidan yang tertinggi hasil fraksinasi kolom terdapat pada fraksi 9 dengan IC50 sebesar 8,87 ppm. Berdasarkan database MarinLit (Blunt and Blunt 2008),fraksi 9 menyerupai senyawa asam gliserida farnesik, asam gliserida sesquiterpenoid, dan diterpenoid labdan. 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Indonesia sebagai negara kepulauan memiliki garis pantai lebih kurang 81000 km dan wilayah laut yang sangat luas. Hal ini menjadikan perairan Indonesia memiliki potensi kekayaan alam laut yang besar dengan tingkat keragaman hayati yang tinggi, dimana di dalamnya terdapat berbagai jenis organisme laut. Pemanfaatan organisme laut ini tidak hanya terbatas sebagai bahan makanan, tapi juga sebagai sumber bahan alami yang berpotensi sebagai bahan baku obat (Handayani et al. 2008). Beberapa organisme laut mampu memproduksi senyawa kimia tersebut untuk mempertahankan dirinya dari serangan predator. Hasil penelitian menunjukkan banyak dari senyawa kimia tersebut berpotensi menghambat pertumbuhan bakteri dan aktif menghambat pertumbuhan sel kanker serta bioaktivitas lainnya (Edrada et al. 2000). Senyawa kimia dengan bioaktivitas ini diduga dapat dimanfaatkan manusia sebagai bahan obat alami. Organisme laut yang sudah dimanfaatkan sebagai bahan obat alami diantaranya spons, rumput laut, cacing laut, teripang, dan moluska. Salah satu moluska yang telah dimanfaatkan selain sebagai bahan pangan juga digunakan sebagai obat alami adalah tambelo. Tambelo (Teredinidae) merupakan salah satu jenis hewan penggerek kayu yang hidup di dalam batang kayu bakau yang sudah lapuk dan membusuk yang dikelompokkan ke dalam filum bivalvia, kelas Myoida, ordo Teredinidae. Berdasarkan literatur, tambelo dikonsumsi oleh sebagian masyarakat Bangka yang disebut temilok brubus (Syaputra et al. 2007). Di Papua, masyarakat menyebutnya tambelo ”koo” (Hardinsyah et al. 2006). Di Philipina masyarakat menyebutnya tamilok (Betia 2011). Tambelo dipercaya dapat menyembuhkan penyakit, seperti di Brasil Utara ”turu” (Teredinidae) sangat populer digunakan dalam pengobatan penyakit menular (Trindade-Silva et al. 2009). Di Papua, suku Kamoro Kabupaten Mimika berpendapat bahwa tambelo berkhasiat menyembuhkan penyakit, antara lain: sakit pinggang, rematik, batuk, flu, malaria, serta meningkatkan air susu ibu, nafsu makan, dan vitalitas pria (Hardinsyah et al. 2006). 2 Masyarakat Kamoro menggunakan tambelo diberbagai acara pesta adat misalnya acara pesta perkawinan, proses mengantar mas kawin, acara peminangan dan lain – lain. Pada saat pesta adat dilaksanakan, tambelo disajikan sebagai makanan pembuka baik dalam keadaan mentah maupun dimasak/digoreng, karena merupakan suatu kebiasaan yang sudah turun temurun dilakukan sejak nenek moyang mereka (Hardinsyah et al. 2006). Informasi yang dapat diperoleh dari penelitian terdahulu seperti Trindade-Silva et al. (2009) menunjukkan bahwa bakteri yang diisolasi dari insang tambelo Neo teredo reynei (Teredinidae) dapat menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif (Sphingomonas, Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus dan Staphylococcus sciuri). Griffin et al. (1994) melaporkan bahwa enzim protease yang diisolasi dari bakteri yang terdapat dalam kelenjar dari tambelo Psiloteredo healdi (Teredinidae) bersifat sebagai piring maupun lensa kaca. deterjen pembersih lantai, Informasi mengenai aktivitas antioksidan pada tambelo sampai saat ini belum ada. Organisme ini mempunyai potensi ekonomis yang perlu diteliti tentang keberadaan kandungan komponen bioaktif yang terdapat di dalamnya. Kenyataan bahwa tambelo mampu memberikan efek menyehatkan bila dikonsumsi, memberikan dugaan bahwa di dalam tubuh tambelo terdapat suatu komponen yang bersifat antioksidan. Antioksidan adalah suatu zat yang dapat menangkal pengaruh radikal bebas yang bila masuk ke dalam tubuh dapat menyebabkan kerusakan. Kerusakan yang diakibatkan oleh radikal bebas di antaranya penuaan dini, jantung koroner, kanker (Muchtadi 2000). 1.2 Perumusan Masalah Tambelo (Bactronophorus thoracites) termasuk di dalam famili Teredinidae dan kelas bivalvia. Tambelo adalah salah satu obat tradisional yang telah lama digunakan oleh masyarakat Papua, namun komposisi kimia dan senyawa antioksidan dari tambelo belum banyak diketahui, sehingga perlu dilakukan penelitian senyawa antioksidan dari bahan tambelo (Bactronophorus thoracites). 3 1.3 Tujuan Penelitian Penelitian bertujuan untuk memperoleh komposisi kimia tambelo segar dan kering, mendapatkan aktivitas antioksidan dan fitokimia ekstrak tambelo, serta mengidentifikasi fraksi aktif senyawa antioksidan. 1.4 Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kandungan kimia dan bahan aktif yang dikandung dalam tubuh tambelo sebagai senyawa antioksidan sehingga dapat dimanfaatkan dalam bidang pangan fungsional atau nutraceutical. 1.5 Kerangka Pemikiran Berdasarkan latar belakang, perumusan masalah dan tujuan penelitian maka kerangka pemikiran yang disajikan pada Gambar 1. Tambelo (Bactronophorus thoracites) Pesta Adat Dikonsumsi oleh masyarakat Papua dimasak Direbus Sakit pinggang/rematik, batuk, flu malaria, meningkatkan air susu ibu , nafsu makan, dan vitalis pria. Analisis kimia : -. analisis proksimat -. analisis asam amino -. analisis asam lemak -. analisis mineral Makan mentah Obat tradisional Ekstraksi tambelo - Uji fitokimia Uji aktivitas antioksidan Fraksinasi ekstrak terpilih Uji antioksidan hasil fraksinasi Identifikasi senyawa dengan LC-MS Penelitian yg dilakukan oleh Hardinsyah et al. 2006 Penelitian yg dilakukan oleh Juliana Gambar 1 Kerangka pemikiran. 4 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tambelo Tambelo atau shipworm adalah hewan jenis moluska yang hidup di dalam pohon bakau yang telah membusuk. Keberadaan dan sifat tambelo sangat dipengaruhi oleh tipe habitat. Kepadatan tambelo tertinggi pada bulan Januari sampai April dan kepadatannya rendah pada bulan Juli (Filho et al. 2008). Tambelo dapat bertahan hidup antara satu hingga beberapa tahun, tergantung pada jenisnya. Tambelo berkembang normal di air dengan salinitas antara 10-30 ppm dan lebih banyak dijumpai di daerah tropis (Muslich et al. 1988). Ciri-ciri fisik tambelo adalah tubuhnya lunak, memanjang seperti cacing, kepalanya berbentuk bulan sabit yang dilengkapi dengan parut dan kikir yang berguna untuk membuat lubang. Lubang pada kayu biasanya dibuat tegak lurus terhadap serat kayu, kemudian membelok sejajar dengan arah serat kayu. Dinding lubang pada kayu tersebut dilapisi dengan suatu subtansi yang mengandung kapur. Terbentuknya lapisan yang mengandung kapur dihasilkan dari mantel shipworm (Ginuk 1987). Tambelo mampu menggali lubang sepanjang 18 cm hingga 2 m (Waterbury et al. 1983). Panjang tubuh tambelo berkisar antara 30 hingga 100 cm dengan diameter antara 1 sampai 1,5 cm. Apabila populasinya terlalu tinggi, perkembangan tubuhnya akan terbatas, sehingga panjangnya akan beberapa sentimeter saja dan diameternya kurang lebih dari 0,5 cm (Muslich et al. 1988). Bentuk morfologi tambelo disajikan pada Gambar 2. Klasifikasi tambelo (Turner 1971) adalah sebagai berikut : Filum : Mollusca kelas : Bivalvia Ordo : Myoida Family : Teredinidae Genus : Bactronophorus Spesies : Bactronophorus thoracites 6 Gambar 2 Tambelo (Bactronophorus thoracites) Hewan ini memanfaatkan serbuk kayu makanan. Perut tambelo terdiri dari dua bagian usus. Bagian pertama adalah usus besar yang berfungsi untuk menampung serbuk kayu. Bagian kedua adalah kelenjar pencernaan yang difungsikan untuk mencerna partikel-partikel kayu (Waterbury et al. 1983). Identifikasi tambelo didasarkan kepada bentuk cangkangnya yang berwarna putih (panjang ± 1 cm) digunakan untuk menutup mulut terowongan. Pallet yang terletak pada bagian tubuh depan yang digunakan untuk memarut kayu. Menurut Mayabubun (2003), ada 4 spesies mangrove yang digunakan sebagai habitat dari tambelo yaitu 2 spesies dari genus Rhizophora, 1 spesies genus Sonneratia dan 1 spesies termasuk dalam genus Bruguiera. Tambelo yang tumbuh di mangrove Sonneratia sp dan Bruguiera sp. tidak dikonsumsi oleh masyarakat suku Kamoro, sebab rasanya pahit dan tidak enak untuk dimakan. 2.2 Potensi Tambelo Bagi Masyarakat Tambelo yang dimakan mentah dipercaya oleh masyarakat Papua lebih berkhasiat daripada direbus atau digoreng. Cara masyarakat Papua mengkonsumsikan tambelo yaitu setelah tambelo diambil dari pohon bakau yang sudah membusuk, cangkang dan giginya dilepas dan langsung dimakan tanpa dibersihkan isi pencernaannya terlebih dahulu, seperti disajikan pada Gambar 3. Masyarakat Papua percaya bahwa sisa pencernaan dalam perut tambelo sangat berkhasiat untuk mengobati beberapa penyakit di antaranya sakit pinggang, batuk, rematik flu, malaria, meningkatkan air susu ibu, nafsu makan, dan kejantanan bagi kaum lelaki. Pada masyarakat Kamoro, tambelo dijadikan sebagai makanan utama di berbagai acara pesta adat seperti pesta budaya Karapao Suku Kamoro. 7 Gambar 3 Masyarakat Kamoro mengkonsumsi tambelo mentah (Sumber: Muller 2004) 2.3 Komposisi Kimia Zat gizi dibagi menjadi 5 kelas utama, yaitu protein, lemak, karbohidrat, mineral, dan air (Harper et al. 1988). Protein berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung unsurunsur C,H,O, dan N. Fungsi protein bagi tubuh adalah untuk membentuk jaringan baru dan mempertahankan jaringan yang telah ada, berperan sebagai enzim, alat pengangkut dan alat penyimpanan, pengatur pergerakan, penunjang mekanis, pertahanan tubuh atau imunisasi, media perambatan impuls syaraf, dan pengendalian pertumbuhan (Winarno 1992). Protein memiliki peranan penting dalam pembentukkan biomolekul daripada sebagai sumber energi. Protein akan dipakai sebagai sumber energi, bila organisme sedang kekurangan energi. Kandungan energi protein rata-rata 4 kkal/g atau setara dengan kandungan energi karbohidrat (Sudarmadji et al. 1989). Kekurangan protein pada anak saat lahir (kwashiorkor), defisiensi energi protein (marasmus), atau gabungan keduanya dapat mengakibatkan kegagalan pertumbuhan ringan sampai sindrom klinis berat yang spesifik. Keadaan tersebut tidak hanya dipengaruhi oleh asupan makanan, tetapi juga oleh keadaan lingkungan, seperti pemukiman, sanitasi dan higiene, serta infeksi berulang yang pernah dialami tubuh (Effendi 2002). 8 Pembatasan konsumsi protein pada penderita hati dilakukan apabila pasien mengalami intoleransi protein. koma hepatik. Kondisi ini biasanya ditemukan pada pasien Konsumsi sumber protein selain daging, seperti sayuran dan produk susu, sangat dianjurkan. Sayuran dan produk susu mengandung metionin, dan asam amino aromatik (AAA) yang lebih rendah serta asam amino rantai cabang (BCAA) yang lebih tinggi dibandingkan dengan daging (Nelson et al. 1994). Karbohidrat merupakan sumber kalori utama bagi hampir seluruh penduduk dunia, khususnya bagi penduduk negara yang sedang berkembang. Karbohidrat mempunyai peranan penting dalam menentukan karakteristik bahan makanan, misalnya rasa, warna, tekstur. Dalam tubuh, karbohidrat berguna untuk mencegah timbulnya ketosisi, pemecahan protein tubuh yang berlebihan, kehilangan mineral, dan beguna untuk membantu metabolisme lemak dan protein (Winarno 2008). Karbohidrat merupakan sumber kalori yang murah, selain itu beberapa golongan karbohidrat menghasilkan serat (dietary fiber) yang berguna bagi pencernaan. Serat pangan atau dietary fiber adalah karbohidrat yang tidak dapat dihidrolisis (dicerna) oleh enzim pencernaan manusia, dan akan sampai di usus besar (kolon) dalam keadaan utuh sehigga akan menjadi subtrat untuk fermentasi bakteri yang hidup di kolon. Serat pangan dapat diklasifikasikan berdasarkan struktur molekul dan kelarutannya. Kebanyakan jenis karbohidrat yang sampai ke kolon tanpa terhidrolisis, meliputi polisakarida yang bukan pati (non-starch polysacharides/NSP), pati yang resisten (resisten starch/RS), dan karbohidrat rantai pendek (short chain carbohydrates/SC). Serat pangan yang larut sangat mudah difermentasikan dan mempengaruhi metabolisme karbohidrat serta lipida, sedangkan serat pangan yang tidak larut akan memperbesar volume feses dan akan mengurangi waktu transitnya (bersifat laksatif lemah). Monomer dari serat pangan adalah gula netral dan gula asam. Gula yang membentuk serat pangan adalah glukosa, galaktosa, xylosa, mannose, arabinosa, rhamnosa, dan gula asam seperti mannurinat, (Muir 1999). galakturonat, glukoronat, serta 4-o-metil-glukoronat 9 Minyak atau lemak berfungsi sebagai sumber energi dan pelarut vitamin A,D,E, dan K serta merupakan sumber asam-asam lemak tak jenuh yang esensial, yaitu linoleat dan linolenat (Sudarmadji et al. 1989). Perubahan-perubahan kimia atau penguraian lemak dan minyak dapat mempengaruhi bau dan rasa suatu bahan makanan, baik yang menguntungkan maupun tidak. Pada umumnya penguraian lemak dan minyak menghasilkan zat-zat yang tidak dapat dimakan. Kerusakan lemak dan minyak menurunkan nilai gizi serta menyebabkan penyimpanan rasa dan bau yang bersangkutan. Mineral digolongkan sebagai zat gizi anorganik atau disebut sebagai abu dalam pangan karena ternyata jika bahan pangan dibakar, unsur organik akan menghilang dan bahan anorganik (abu) yang tersisa terdiri dari unsur-unsur mineral (Harper et al. 1988). Abu adalah zat anorganik sisa hasil pembakaran suatu bahan organik. Kandungan abu dan komponennya tergantung pada macam bahan dan cara pengabuannya. Kadar abu ada hubungannya dengan mineral suatu bahan. Komponen mineral dalam suatu bahan sangat bervariasi baik macam dan jumlahnya (Sudarmadji et al. 1989). 2.3.1 Asam amino Protein merupakan molekul yang sangat besar, terbentuk dari asam amino yang terikat bersama. Susunan kimia asam amino bervariasi, tetapi terdapat dua hal yang sama, yaitu setiap asam mempunyai sedikitnya satu kelompok amino dan satu kelompok karboksil (Sudarmadji et al. 1989). Protein yang masuk dalam tubuh akan diubah menjadi asam amino. Asam amino tersebut akan diabsorpsi melalui dinding usus, kemudian dilanjutkan sampai ke dalam pembuluh darah. Proses absorpsi asam diamino lebih lambat dari pada asam amino netral (Poedjadi dan Supriyanti 2006). Tingkat penyerapan relatif masing-masing asam amino adalah asam amino rantai cabang (valin, leusin, isoleusin) dan metionin lebih mudah diserap dari asam amino esensial lainnya. Asam amino esensial lebih mudah diserap dari asam amino non esensial. Asam amino glutamat dan aspartat paling lambat terserap (Linder 2006). Asam amino merupakan komponen utama penyusunan protein, dan dibagi dalam dua kelompok, yaitu asam amino esensial dan nonesensial. Asam amino esensial tidak dapat diproduksi dalam tubuh sehingga sering harus ditambahkan 10 dalam bentuk makanan, sedangkan asam amino nonesensial dapat diproduksi dalam tubuh. Asam amino umumnya berbentuk serbuk dan mudah larut dalam air, namun tidak larut dalam pelarut organik nonpolar (Sitompul 2004). Asam amino esensial merupakan pembangun protein tubuh yang harus berasal dari makanan atau tidak dapat dibentuk di dalam tubuh. Kelengkapan komposisi asam amino esensial merupakan parameter penting penciri kualitas protein (Astawan 2007). Asam amino esensial yang dibutuhkan oleh tubuh manusia ialah histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, arginin, fenilalanin, treonin, triptofan, valin. Kebutuhan asam amino esensial bagi anak-anak relatif besar daripada orang dewasa (Poedjiadi dan Supriyanti 2006). Kebutuhan metionin dapat disubtitusi dengan tirosin atau gabungan sistin dan fenilalanin (Linder 2006). Beberapa fungsi asam amino dalam tubuh disajikan pada Tabel 1. Asam amino merupakan unit pembangun protein, di dalam tubuh, asam amino atau protein berfungsi sebagai zat pembangun, yaitu menyediakan bahanbahan yang sangat berperan dalam proses pertumbuhan dan pemeliharaan jaringan tubuh. Protein bekerja sebagai pengatur semua proses yang berlangsung di dalam tubuh dan sebagai sumber energi jika karbohidrat dan lemak tidak dapat mencukupi keperluan tubuh. Selain fungsi tersebut hampir semua asam amino memiliki fungsi khusus, contohnya tirosin merupakan prekursor yang membentuk pigmen kulit dan rambut. Arginin terlibat dalam sintesis ureum dalam hati. Glutamin dan asparagin merupakan simpanan asam amino dalam tubuh. Metionin dan serin merupakan prekursor sintesis dan histidin yang diperlukan untuk sintesis histamin 11 Tabel 1 Beberapa fungsi asam amino dalam tubuh Jenis asam amino Triptofan Fenilalanin Glisin Histidin Aspartat Glutamat Glisin Lisin Metionin Triptofan Tirosin Peranan Sebagai pemula vitamin niasin, dan serotoninmetionin donor gugus metil untuk sintesis beberapa senyawa seperti kolin dan kreatin Sebagai pemula tirosin dan keduanya membentuk tiroksin dan epinefrin, arginin, ornitin, sitrulin yang ikut berperan dalam sinstesis urea dalam hati serta berfungsi sebagai prekursor tirosin katekolamin, melanin dan tiroksin Berperan pada sintesis profirin dari hemoglobin dan juga merupakan konstituen asam glikolat Bagi manusia, histidin merupakan asam amino esesnsial bagi anak-anak. Berfungsi untuk biosintesis urea, prekursor glikogenik dan pirimidin Sebagai produk antara dalam reaksi interkonversi asam amino, prekusor prolin, ornitin, arginin, poliamin, neurotransmiter α-aminobutirat (GABA), sumber NH3 Sebagai prekusor biosintesis purin dan neurotransmiteri Berfungsi untuk crosslinking protein (seperti dalam kolagen dan elastin) biosintesis karnitin merupakan donor grup metil untuk banyak proses sintetik Sebagai prekusor serotonin dan nikotinamid (vitamin B) Sebagai prekusor tirosin katekolamin, melanin dan tiroksin. Sumber: Poedjiadi dan Supriyanti (2006). 2.3.2 Asam lemak Asam lemak merupakan komponen unit pembangunan yang sifatnya khas untuk setiap lipid. Asam lemak adalah asam organik berantai panjang yang mempunyai 4-24atom. Asam lemak memiliki gugus karboksil tunggal dan ujung hidrokarbon nonpolar yang panjang, sehingga hampir semua lipid bersifat tidak larut di dalam air dan tampak berminyak atau berlemak. Asam lemak tidak terdapat secara bebas atau berbentuk tunggal di dalam sel atau jaringan, tetapi terdapat dalam bentuk terikat secara kovalen pada berbagai kelas lipid berbeda, yang dapat dibebaskan dari ikatan tersebut melalui hidrolisis kimia atau enzimatik. 12 Asam lemak dibedakan menurut jumlah karbon yang dikandungnya, yaitu asam lemak rantai pendek (6 atom karbon atau kurang), rantai sedang (8 hingga 12 karbon), rantai panjang (14-18 karbon), dan rantai sangat panjang (20 atom karbon atau lebih). Semua lemak bahan makanan hewani dan sebagian besar minyak nabati mengandung asam lemak rantai panjang, asam lemak rantai sangat panjang terdapat dalam minyak ikan. Titik cair asam lemak meningkat dengan bertambah panjangnya rantai karbon. Asam lemak yang terdiri dari rantai karbon yang mengikat semua hidrogen yang dapat diikatnya dinamakan asam lemak jenuh. Asam lemak yang mengandung satu atau lebih ikatan rangkap di mana sebetulnya dapat diikat tambahan atom hidrogen dinamakan asam lemak tidak jenuh. Asam lemak tidak jenuh tunggal mengandung satu ikatan rangkap pada rantai karbonnya (monounsaturates fatty acid=MUFA), sedangkan asam lemak tidak jenuh ganda mengandung dua atau lebih ikatan rangkap (polyunsaturated fatty acid=PUFA). Lemak yang tersusun oleh asam lemak tidak jenuh akan bersifat cair pada suhu kamar, sedangkan yang tersusun oleh lemak jenuh berbentuk padat (Almatsier 2009). Asam lemak tak jenuh tunggal (MUFA) tergolong dalam asam lemak rantai panjang, yang kebanyakan ditemukan dalam minyak zaitun, minyak kedelai, minyak kacang tanah, minyak biji kapas, dan canola. Secara umum, lemak tak jenuh tunggal memiliki efek yang mengutungkan terhadap kolesterol dalam darah, terutama bila digunakan sebagai pengganti asam lemak jenuh. Dalam hal penurunan kadar kolesterol darah, asam lemak tak jenuh (MUFA) lebih efektif bila dibandingkan dengan asam lemak tak jenuh jamak (PUFA) sehingga pemanfaatan asam oleat untuk formulasi makanan olahan menjadi populer. Salah satu jenis MUFA adalah omega-9 (oleat) yang memilki sifat lebih stabil dan lebih perannya dibandingkan PUFA. Polysaturated fatty acid (PUFA) dapat menurunkan low density lipoprotein (LDL) dan juga menurunkan high density lipoprotein (HDL). Sementara itu, MUFA mampu menurunkan LDL dan meningkatkan HDL. Penelitian yang dilakukan Mensink (1987) menyatakan bahwa MUFA dapat menurunkan LDL,dan meningkatkan K-HDL yang lebih besar dibandingkan dengan omega-3 dan omega-6. 13 Polyunsaturated fatty acid (PUFA) adalah asam lemak yang mengandung dua atau lebih ikatan rangkap, bersifat cair pada suhu kamar, bahkan tetap cair pada suhu dingin karena titik lelehnya lebih rendah dibandingkan dengan MUFA. Asam lemak ini banyak ditemukan pada ikan dan bahan nabati, seperti bunga matahari, jagung, dan biji matahari. Sumber alami PUFA yang penting bagi kesehatan adalah kacang-kacangan dan biji-bijian. Contoh PUFA adalah asam linoleat (omega-6), dan omega-3, tergolong dalam asam lemak rantai panjang (LCFA) yang banyak ditemukan pada minyak nabati atau sayur dan minyak ikan. Manfaat PUFA (asam lemak arakhidonat, linoleat, dan linolenat) antara lain berperan dalam transpor dan metabolisme lemak, fungsi imun, mempertahankan fungsi dan integritas membran sel. Asam lemak omega-3 dapat membersihkan plasma dari lipoprotein kilomikron serta menurunkan produksi trigliserida dan poliprotein β (beta) di dalam hati. Selain peranannya dalam pencegahan penyakit jantung koroner dan artritis, asam lemak omega-3 penting untuk berfungsinya otak dan retina dengan baik. Asam lemak esensial adalah asam lemak yang dibutuhkan oleh tubuh untuk pertumbuhan dan fungsi normal semua jaringan, sedangkan tubuh tidak dapat mensintesisnya. Kelompok asam lemak yang termasuk dalam jenis ini adalah asam alfa linoleat (omega-6) dan asam alfa linolenat (omega-3). Turunan asam lemak arakidonat dari asam linoleat, eikosapentaenoat (EPA), dan dokosaheksaenoat (DHA) dari asam linolenat. Asam lemak esensial merupakan prekursor sekelompok senyawa eikosanoid yang prostaglandin, prostasiklin, tromboksan, dan leukotien. mirip hormon, yaitu Senyawa-senyawa ini mengatur tekanan darah, denyut jantung, fungsi kekebalan, rangsangan sistem saraf, kontraksi otot serta penyembuhan luka (Achadi 2010). 2.3.3 Mineral Mineral termasuk ke dalam golongan nutrisi mikro dalam tubuh yang diperlukan dalam jumlah kecil, tetapi ketersediaan mineral harus tercukupi setiap harinya. Berdasarkan jumlahnya dalam tubuh manusia dibedakan menjadi dua, yaitu makromineral dan mikromineral. Mineral yang terdapat dalam tubuh dalam jumlah yang cukup banyak, sedikitnya 0,05% dari bobot tubuh dikenal sebagai makromineral. Makromineral terdiri dari kalsium, klorin, magnesium, fosfor, 14 kalium, natrium, dan belerang. Mineral yang diketahui dibutuhkan oleh tubuh dan terdapat dalam jumlah yang lebih sedikit dari 0,05% dari bobot tubuh disebut sebagai mikromineral, yang terdiri dari kobalt, tembaga, flourin, besi, iodin, mangan, dan seng (Harper et al. 1988; Winarno 1992). Secara umum fungsi mineral bagi tubuh adalah sebagai berikut: 1) mempertahankan keseimbangan asam – basa dalam tubuh, 2) sebagai katalis untuk reaksi biologis, 3) komponen senyawa tubuh yang esensial adalah hormon, enzim, hemoglobin, asam lambung, 4) memelihara keseimbangan air dalam tubuh, 5) transmisi impuls saraf, 6) mengatur kontraktilitas otot, dan 7). pertumbuhan jaringan tubuh. a) Kalsium (Ca) Kalsium diperlukan untuk pembentukan dan perkembangan tulang dan gigi. Kalsium merupakan salah satu faktor yang terpenting dalam pembekuan darah. Kalsium diperlukan untuk memelihara otot dan syaraf dalam tubuh agar berfungsi normal dan membantu penyerapan vitamin B12 (Harper et al. 1988; Gaman dan Sherrington 1992). Kalsium berfungsi untuk mengatur transpor ion-ion menembus membran seluler dan diperlukan untuk aktivitas aktomiosin dan miosin ATP-ase, lipase, kolinesterase, dan suksinildehidrogenase. Kalsium juga berperan dalam pembentukan tulang dan gigi, serta mengaktifkan reaksi enzim dan sekresi hormon termasuk insulin oleh pankreas. Kalsium bersama dengan natrium, kalium, dan magnesium berperan dalam transmisi impuls-impuls serta kontraksi dan relaksasi otot (Muchtadi 1989). b) Kalium (K) Hampir seluruh kegiatan di dalam tubuh dipengaruhi oleh perubahan kosentrasi kalium di dalam plasma. Kalium adalah basa utama yang terdapat di dalam jaringan dan sel-sel darah yang memegang peranan penting dalam pengaturan keseimbangan asam basa tubuh. Kalium juga berperan dalam penyampaian impuls-impuls saraf ke serat-serat otot dan juga dalam kemampuan otot untuk berkontraksi (Fregly 1988). Sebanyak 98% kalium dalam tubuh berada di dalam intraseluler. Sekitar 270 mg kalium berada di dalam sel yang 15 merupakan cairan kation yang mendominasi di dalam intrseluler (Groff dan Gropper 1990). c) Fosfor (P) Fosfor dan kalsium secara bersama-sama adalah penyusun tulang dan gigi yang sangat penting. Fosfor juga terdapat dalam semua sel hidup dan diperlukan untuk pelepasan energi. Fosfor terdapat dalam kebanyakan makanan dan defisiensi fosfor dalam susunan makanan belum pernah terjadi (Gaman dan Sherrington 1992). d) Besi (Fe) Sebagian besar besi terdapat dalam hemoglobin (pigmen darah merah yang terdapat dalam sel darah merah). Bila sel-sel darah merah melepaskan besi, besi tidak hilang dari tubuh, tetapi digunakan lagi untuk membuat sel-sel darah merah yang baru, di dalam sumsum tulang. Beberapa besi juga disimpan di dalam tubuh seperti dalam sumsum tulang, hati, dan limpa sebagai senyawa kompleks dengan protein yang dikenal sebagai feritin (Harper et al. 1988; Gaman dan Sherrington 1992). e) Seng (Zn) Seng memegang peranan esensial dalam banyak fungsi tubuh, sebagai bagian dari enzim atau sebagai kofaktor pada kegiatan lebih dari dua ratus enzim. Enzim superoksida dismutase di dalam sitosol semua sel, terutama eritrosit diduga berperan dalam memusnahkan anion superoksida yang merusak. Seng juga berperan dalam pengembangan fungsi reproduksi laki-laki dan pembentukkan sperma serta berperan dalam fungsi kekebalan, yaitu dalam fungsi sel T dan dalam pembentukan antibodi oleh sel B (Almatsier 2009). f) Tembaga (Cu) Fungsi tembaga dalam tubuh antara lain mencegah terjadinya anemia, dengan cara membantu penyerapan Fe, menstimulir sintesis fraksi heme atau globin, serta melepaskan Fe simpanan dari ferritin dan hati. Diperlukan untuk sintesis fosfolipida untuk pembentukan myelin yang menyelimuti serat syaraf. Sebagai bagian dari enzim-enzim pernafasan misalnya sitokrom oksidase, dan untuk proses pelepasan energi. Bersama vitamin C dapat mempertahankan aktivitas enzim-enzim yang tersangkut dalam sintesis elastin (protein dinding 16 aorta) dan kolagen, sebagai bagian dari enzim tirosinase yang mengkatalisis konversi tirosin menjadi melanin. Tembaga bersifat toksik bila terdapat sebagai ion bebas. Konsumsi garam Cu dalam jumlah sepuluh kali lebih besar daripada yang terdapat dalam bahan pangan secara normal, dapat menyebabkan pusing dan muntah (Muchtadi 2009). g) Selenium (Se) Selenium adalah mineral penting yang sangat dibutuhkan oleh tubuh sebagai antioksidan untuk meredam aktivitas radikal bebas. Selenium tidak diproduksi oleh tubuh, tetapi diperoleh dari konsumsi makanan sehari-hari. Orang dewasa dianjurkan untuk mengkonsumsi sebanyak 55 µg per berat badan selenium setiap hari, namun perempuan dewasa yang sedang hamil dianjurkan meningkatkan asupan selenium menjadi 60 µg per berat badan setiap hari. Kebutuhan tersebut akan meningkat saat seorang ibu harus menyusui, yaitu 70 µg per berat badan setiap hari. Tubuh setiap orang memiliki kemampuan untuk melawan radikal bebas yang bisa menghancurkan sel dan menimbulkan berbagai penyakit kronis, seperti kanker, penyakit jantung, dan penuaan dini. Di dalam tubuh, selenium bekerja sama dengan vitamin E sebagai zat antioksidan untuk memperlambat oksidasi asam lemak tak jenuh. Selenium diketahui memperbaiki sistem imunitas (kekebalan tubuh) dan fungsi kelenjar tiroid. Hasil penelitian belakangan ini yang memastikan bahwa selenium dapat mencegah kanker (termasuk kanker kulit akibat paparan matahari), menambah pamornya sebagai mineral yang bermanfaat besar untuk meningkatkan fungsi kekebalan tubuh manusia. Bersama vitamin E, selenium berfungsi mempertahankan elastisitas jaringan dan bila kadar selenium berkurang maka tubuh akan mengalami penuaan dini, yaitu kondisi sel yang rusak sebelum waktunya. Sumber utama selenium adalah tumbuh-tumbuhan dan makanan laut (Conectique 2011). 2.4 Komponen Bioaktif dari Moluska Invertebrata laut merupakan produsen senyawa bioaktif terbesar di antara biota lainnya. Beberapa metabolit sekunder yang diproduksi oleh invertebrata laut dan mikroorganisme simbion, mempunyai prospek sebagai zat aktif dalam obat 17 untuk pengobatan penyakit, seperti infeksi, neurologi (parkinson, alzheimer’s), penyakit jantung, immunologi, anti-inflammatory, antivirus, dan antikanker. Moluska merupakan salah satu dari invertebrata laut yang diketahui menghasilkan metabolit sekunder dan sekaligus mempunyai peranan penting dalam ekologinya sehingga menjadi target bagi sumber senyawa bioaktif yang bermanfaat dalam dunia farmasi bahari. Penelitian mengenai metabolit sekunder dari moluska telah banyak dilakukan. Hamman et al. (1996) melaporkan telah mengisolasi kahalaide F dari kerang jenis Elysia rubefescens yang memiliki aktivitas sebagai antikanker usus dan prostat. Hasil penelitian Salamah et al. (2008) diketahui bahwa ekstrak metanol kijing Taiwan yang berpotensi sebagai antioksidan, yaitu nilai IC50 sebesar 201,52 ppm. Senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak kijing Taiwan adalah kelompok alkaloid dan flavonoid. 2.5 Antioksidan dan Metode Pengukurannya Senyawa antioksidan secara umum didefinisikan oleh Schuler (1990) sebagai suatu senyawa kimia yang dapat menunda, memperlambat atau mencegah terjadinya proses oksidasi. Proses oksidasi tersebut biasanya terjadi dalam produk terutama yang berlemak dengan kandungan asam lemak tidak jenuh sehingga dapat menyebabkan kerusakan produk atau ketengikan. Mekanisme oksidasi asam lemak tidak jenuh menurut Hamilton (1983) dan Gordon (1990) terdiri dari 3 tahap, yaitu : a) inisiasi, b) propagasi dan c) terminasi. Pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal bebas (R●) akibat reaksi antara asam lemak (RH) dengan beberapa katalisator, misalnya oksigen, panas, ion logam, dan cahaya. Tahap propagasi terjadi akibat reaksi antara radikal bebas (R●) yang terbentuk pada tahap inisiasi dengan oksigen menghasilkan radikal peroksida (ROO●). Radikal peroksida yang terbentuk akan mengikat ion hidrogen dari molekul lemak yang lain membentuk hidroperoksida (ROOH) dan radikal lemak lain (R1), selanjutnya tahap terakhir adalah tahap terminasi ditandai dengan terbentuknya produk-produk non radikal seperti aldehida, keton, alkohol dan asam-asam dengan karakteristik dan cita rasa tengik (Winarno 1984). Ranney (1979) mengklasifikasikan antioksidan atas tiga golongan berdasarkan prinsip kerjanya dalam mencegah terjadinya proses oksidasi. Pertama adalah antioksidan yang mempunyai gugus fenol dan amina aromatik 18 seperti butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), metilen bisfenol dan difenilamin. Antioksidan-antioksidan tersebut bekerja dengan cara berinteraksi dengan radikal bebas yang terdapat di dalam sistem dan membentuk produk subtrat non radikal dan suatu radikal antioksidan. Jika radikal antioksidan yang dihasilkan cukup stabil mencegah reaksi berikutnya, maka radikal antioksidan tersebut tidak akan berperan sebagai inisiator dari berikutnya. Kedua produk yang dihasilkan pada kenyataannya mungkin bereaksi dengan radikal bebas kedua dalam sistem Mekanisme reaksi oksidasi lemak dapat dilihat sebagai berikut : Tahap inisiasi : Tahap propagasi Tahap terminasi : : ROOH ROO● + H● ROOH RO● + OH 2ROOH RO● + OH R● ROO● + O2 ROO● + R1 H R1● + ROOH ROO● + R1 OO● ROOH1 + O2 R● ROR1 + RO● Gambar 4 Mekanisme reaksi oksidasi lemak (Gordon 1990). Kedua adalah antioksidan yang berfungsi dengan cara menghilangkan molekul-molekul hidroperoksida dari sistem, tetapi tanpa melibatkan radikal bebas. Contoh antioksidan ini adalah dilauril tiodipropionat (DLTP). Molekul ini mengandung atom sulfur teroksidasi yang mampu bereaksi dengan molekul hidroperoksida berikutnya. Ketiga adalah antioksidan yang dapat menginaktivasi logam yang bisa mempercepat terjadinya oksidasi. Penggolongan ketiga ini sama dengan antioksidan sekunder menurut Winarno (1984) dan Gordon (1990). Jenis penggolongan antioksidan yang lain berdasarkan sumber diperolehnya senyawa tersebut. Penggolongan ini terdiri atas dua yaitu antioksidan sintetik dan antioksidan alami. Beberapa antioksidan sintetik yang sering digunakan dalam industri pangan antara lain butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), Propil galat, tertiarybutyl hydroquinon (TBHQ) dan tokoferol (Buck 1991). Antioksidan sintetik sangat efektif dalam menghambat reaksi oksidasi lemak akan, tetapi penggunaan antioksidan sintetik banyak menimbulkan kekuatiran akan efek sampingnya karena telah banyak 19 penelitian tentang efek patologis yang ditimbulkannya. Antioksidan alami diperoleh dari hasil ekstrak bahan alami. Antioksidan alami dalam bahan pangan diperoleh dari: a) antioksidan berupa senyawa endogen yang terdiri dari satu atau lebih senyawa yang terdapat dalam bahan pangan, b) antioksidan yang terbentuk akibat reaksi selama pengolahan, c) antioksidan yang merupakan senyawa eksogen yaitu dengan penambahan antioksidan yang diisolasi dari sumber alami (Pratt 1992). Adapun antioksidan yang terdapat di dalam bahan alami meliputi golongan senyawa turunan fenolat, turunan senyawa hidroksinat, kumarin, tokoferol (Sidik 1997). Penggunaan bahan antioksidan baik alami maupun sintetik dalam bahan pangan, harus memenuhi persyaratan tertentu yaitu: a) tidak beracun dan tidak mempunyai efek fisiologis, b) tidak menimbulkan flavor yang tidak enak, rasa dan warna pada lemak atau bahan pangan, c) larut sempurna dalam lemak dan minyak, d) efektif dalam jumlah yang relatif kecil menurut rekomendasi Food and Drug Administration dosis yang diizinkan dalam bahan pangan adalah 0,01-0,1% dan e) tidak mahal serta selalu tersedia (Coppen 1983; Ketaren 1986). Ada beberapa metode pengukuran aktivitas antioksidan yang dapat digunakan salah satunya adalah metode 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (DPPH). Senyawa DPPH dalam metode ini digunakan sebagai model radikal bebas, yang memiliki rumus molekul C18H12N5O6 dan Mr=394,33 (Molyneux 2004; Vattem dan Shetty 2006). Jika senyawa ini masuk dalam tubuh manusia dan tidak terkendalikan dapat menyebabkan kerusakan fungsi sel. Pada uji ini metanol digunakan sebagai pelarut, dan inkubasi pada suhu kamar dimaksudkan untuk mengoptimumkan aktivitas DPPH. Radial bebas DPPH merupakan radikal sintetik yang stabil pada suhu kamar dan larut dalam pelarut seperti metanol atau etanol (Molyneux 2004; Suratmo 2009). Ketika sebuah antioksidan mampu mendonorkan hidrogen yang beraksi dengan radikal DPPH, reaksi ini akan memberikan peningkatan kompleks non radikal dan menurunkan radikal DPPH yang ditandai dengan terbentuknya warna kuning. Penurunan pada absorbsi dapat diukur secara spektrofotometrikal dan dibandingkan dengan sebuah kontrol etanol atau metanol untuk mengkakulasikan aktivitas scavenging radikal DPPH (Vattem dan Shetty 2006). 20 Ketika DPPH menerima elektron atau radikal hidrogen, maka akan terbentuk molekul diamagnetik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen, akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH, jika semua elektron pada radikal bebas DPPH berpasangan, maka warna larutan berubah dari ungu tua menjadi kuning terang dan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm akan hilang. Reaksi pengujian aktivitas antioksidan dengan DPPH disajikan pada Gambar 5. DPPH* + Free radical AH DPPH-H antioksidan + A* neutral Puplish color new radical Yellowish color Gambar 5 Reaksi pengujian aktivitas antioksidan dengan DPPH (Munifah 2007). Parameter yang digunakan untuk menginterpretasikan hasil pengujian dengan metode DPPH adalah EC50 (efficient concentration) atau biasa disebut IC50 (inhibition concentration). Inhibition concentration (IC50) dapat didefinisikan sebagai kosentrasi larutan sampel yang akan menyebabkan reduksi terhadap aktivitas DPPH sebesar 50%. Semakin kecil nilai IC50 berarti aktivitas antioksidannya semakin tinggi. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat apabila nilai IC50 kurang dari 0,05 mg/mL, kuat apabila nilai IC50 antara 0,05-0,10 mg/mL, sedang apabila nilai IC50 berkisar antara 0,10-0,15 mg/mL, dan lemah apabila nilai IC50 berkisar antara 0,15-0,20 mg/mL (Blois 1958 diacu dalam Molyneux 2004). 21 3 METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Sampel diambil dari perairan Andai, Kabupaten Manokwari, Provinsi Papua Barat. Ekstraksi dan uji aktivitas antioksidan dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Kimia Analitik, FMIPA, Institut Pertanian Bogor, dan Pusat Laboratorium Terpadu IPB-Bogor. Identifikasi senyawa antioksidan dilakukan di Balai Pengkajian Bioteknologi (Biotech Center-BPPT), Serpong. Penelitian dilaksanakan dari bulan Agustus 2010 – Maret 2011. Gambar 6 menunjukkan diagram alir penelitian komposisi kimia dan senyawa antiokksidan dari ekstrak tambelo (Bactronophorus thoracites). Tambelo kering Analisis kimia : - uji proksimat - uji asam amino - uji asam lemak - uji mineral Maserasi dengan MeOH Ekstraksi dengan MeOH Partisi dengan pelarut n-heksan, dan etil asetat Ekstrak n-heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol Uji Fitokima Uji antioksidan Ekstrak terplilih Kromatografi kolom Uji Fitokima KLT Eluen terbaik Uji antioksidan Fraksi terpilih Identifikasi dengan LC-MC Gambar 6 Diagram alir penelitian komposisi kimia dan senyawa dari ekstrak tambelo (Bactronophorus thoracites). antioksidan 22 3.2 Bahan dan Alat Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah tambelo yang berasal dari perairan Andai, Kabupaten Manokwari, Propinsi Papua Barat. Tambelo diperoleh dari batang pohon mangrove Rhizopora yang sudah lapuk. Tambelo dibersihkan dengan melepaskan cangkang dan pallet kemudian dikeringkan dengan menggunakan freezer dry. Tambelo kering selanjutnya digiling dengan menggunakan mortar dan disimpan pada suhu rendah (5-10 oC) sampai siap untuk dianalisis. Bahan kimia yang digunakan untuk ekstraksi adalah n-heksana, etil asetat, metanol, dan kertas saring Whatman 40. Bahan kimia yang digunakan untuk uji antioksidan adalah DPPH (1,1-diphenyl-2-picrlhylhydrazyl), BHT dan vitamin super ester C sebagai standar. Bahan untuk uji fitokimia adalah H2SO4, akuades, kloroform p.a (pengenceran), anhidra asetat, asam sulfat pekat, HCl 2N, pereaksi Dregendorff, pereaksi Wagner, pereaksi Meyer, serbuk magnesium, alkohol, HCl 37%, etanol 70%, FeCl3 5%, pereaksi Molish, pereaksi benedict, pereaksi biuret, dan larutan ninhidrin 0,1%. Peralatan utama yang digunakan adalah kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi kolom (KK), spektrofotometer UV-Vis JENWAY 6305, kromatografi cair (LC-MS) AGILENT TECHNOLOGIES, vacum rotary evaporator Buchi Rotavapor R-205, dan Spektrofotometer serapan atom (SSA) Shimazu-7000. 3.3 Prosedur Penelitian Penelitian ini terbagi atas dua tahap, yaitu 1) analisis komponen kimia tambelo, dan 2) Ekstraksi bahan aktif tambelo. Penelitian tahap pertama meliputi analisis rendemen, uji proksimat, asam lemak, asam amino, dan mineral. Tahap kedua meliputi ekstraksi bahan aktif dengan metode maserasi, partisi cair-cair, uji fitokimia, uji antioksidan dengan metode DPPH, dan identifikasi senyawa antioksidan dari bahan aktif yang dihasilkan. 3.3.1 Penelitian tahap pertama Penelitian tahap pertama ini bertujuan untuk mendapatkan presentase bagian tubuh yang dapat dimanfaatkan dan memperoleh nilai kandungan gizi atau komposisi kimia dari tambelo. Analisis kandungan gizi terdiri dari analisis 23 proksimat yang meliputi kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan karbohidrat, analisis asam amino, serta asam lemak. 3.3.1.1 Rendemen (Hustiany 2005) Tambelo dikeluarkan dari freezer, dicairkan kemudian ditimbang beratnya selanjutnya dikeringkan dengan menggunakan freezer dry. Daging tembelo yang sudah kering ditimbang kembali untuk mengetahui penurunan berat setelah dikeringkan. Rendemen merupakan presentase perbandingan antara bagian yang digunakan dengan berat utuh tambelo segar, dengan rumus : 3.3.1.2 Uji proksimat (AOAC 2005) Analisis proksimat yang dilakukan meliputi uji kadar air dan abu dengan metode oven, uji kadar lemak menggunakan metode sokhlet, dan uji kadar protein menggunakan metode kjedahl. a) Analisis kadar air (AOAC 2005) Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 102-105 o C selama 30 menit. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator (kurang lebih 30 menit) hingga dingin kemudian ditimbang hingga beratnya konstan (A). Tambelo ditimbang sebanyak 1-2 g (B), kemudian dimasukan kedalam cawan. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 102-105 oC selama 6 jam. Cawan tersebut kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang bobotnya (C). Kadar air ditentukan dengan rumus: Keterangan: A = berat cawan kosong (gram) B = berat sampel sebelum dioven (gram) C = berat cawan berisi sampel setelah dioven (gram) b) Analisis kadar abu (AOAC 2005) Analisis kadar abu dilakukan menggunakan metode oven. Prinsipnya adalah pembakaran atau pengabuan bahan-bahan organik yang diuraikan menjadi 24 air (H2O) dan karbondioksida (CO2) tetapi zat anorganik tidak terbakar. Zat anorganik ini disebut abu. Prosedur analisis kadar abu dalam bahan pangan adalah sebagai berikut: cawan abu porselin yang kosong dimasukkan ke dalam oven. Cawan abu porselin dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit, kemudian cawan abu porselin kosong ditimbang untuk mengetahui bobot cawan kosong (A). Sampel yang telah dihomogenkan ditimbang 2 gram dan dimasukan ke dalam cawan abu porselin ditimbang (B), kemudian masukan ke dalam oven bersuhu 550-600 oC selama 24 jam atau sampai pengabuan sempurna, sehingga diperoleh abu berwarna putih, setelah selesai, suhu tungku pengabuan diturunkan hingga suhu 40 oC. Cawan porselin dikeluarkan dengan menggunakan penjepit dan masukan ke dalam desikator selama 30 menit. Apabila abu belum putih benar harus dilakukan pengabuan kembali. Abu dibasahi (dilembabkan) dengan akuades secara bertahap, kemudian dikeringkan menggunakan hot plate dan diabukan kembali pada suhu 550-600 oC sampai diperoleh berat yang konstan. Suhu pengabuan diturunkan sampai ± 40 oC lalu dipindahkan cawan abu porselin ke dalam desikator selama 30 menit kemudian ditimbang bobotnya (C) segera setelah dingin. Kadar abu dalam bahan pangan dapat dihitung berdasarkan persamaan berikut : Keterangan: A = Berat cawan kosong (gram) B = Berat sampel sebelum pengabuan (gram) C = Berat cawan berisi sample setelah pengabuan (gram) c) Analisis kadar protein (AOAC 2005) Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode total nitrogen yang didasarkan pada reaksi penetralan asam basa. Kadar protein dihitung berdasarkan kesetimbangan reaksi kimia. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Tahapan destruksi adalah sebagai berikut: sampel dilumatkan dengan blender hingga partikelnya dapat melewati saringan 20 mesh. Sampel dimasukan dalam kantong plastik atau gelas yang bersih dan bertutup. Homogenat sampel ditimbang 2 gram pada kertas timbang, kemudian dimasukan ke dalam labu 25 destruksi. Sampel tersebut selanjutnya ditambahkan dua tablet katalis serta beberapa butir batu didih. Sampel ditambahkan 15 mL asam sulfat pekat (95-97%) dan 3 mL hidrogen peroksida secara perlahan dan didiamkan 10 menit dalam ruang asam. Destruksi dilakukan pada suhu 410 oC selama 2 jam atau sampai larutan jernih. Sampel hasil destruksi didiamkan hingga mencapai suhu kamar dan tambahkan 50-75 mL akuades. Tahap kedua adalah distilasi, posedur tahapan ini sebagai berikut: sebanyak 25 mL larutan H3BO3 4% yang mengandung indikator sebagai penampung destilat dimasukan dalam erlenmeyer. Labu yang berisi hasil destruksi dipasang pada rangkaian alat destilasi uap, kemudian ditambahkan 50-75 mL larutan natrium hidroksida dan natrium thiosulfat dan dilakukan destilasi, selanjutnya destilat ditampung ke dalam erlenmeyer tersebut hingga volume mencapai minimal 150 mL (hasil destilasi akan berubah menjadi kuning). Tahap ketiga adalah titrasi hasil destilat dengan HCl 0.2 N, yang sudah dibakukan sampai warna berubah dari hijau menjadi abu-abu netral. Analisis standar blanko dilakukan seperti tahapan sampel. Kadar protein dapat dihitung dengan persamaan berikut : Keterangan : KP = Kadar Protein Va = mL HCl untuk titrasi sampel Vb = mL HCl untuk titrasi blanko N = Normalitas HCl yang digunakan W = berat sampel c) Analisis kadar lemak (AOAC 2005). Prinsip analisis kadar lemak diawali dengan melakukan pengekstrakan sampel dengan pelarut organik untuk mengeluarkan lemak dengan bantuan pemanasan pada suhu titik didih pelarut selama 8 jam. Pelarut organik yang mengikat lemak selanjutnya dipisahkan dengan proses penguapan (evaporasi), sehingga hasil lemak tertinggal dalam labu. Penetapan bobot lemak dihitung secara gravimetri. Sampel dilumatkan hingga homogen dan dimasukan ke dalam wadah plastik atau gelas yang bersih dan bertutup. Apabila sampel tidak langsung 26 dianalisis, maka disimpan dalam refrigerator sampai saatnya akan dianalisis. Sampel dikondisikan pada suhu ruang dan pastikan sampel masih homogen sebelum ditimbang. Apabila terjadi pemisahan cairan dan sampel, maka dilakukan pengadukan ulangan dengan blender sebelum dilakukan pengamatan. Prosedur analisis lemak adalah sebagai berikut : labu alas bulat ditimbang dalam keadaan kosong (A). Homogenat sampel ditimbang sebanyak 2 gram (B) dan masukan ke dalam selongsong lemak (ekstraction timbles). Berturut-turut dimasukan 150 mL n-heksana ke dalam labu alas bulat, selongsong lemak ke dalam ekstractor soxhlet, dan pasang rangkaian sokhlet dipasang dengan benar. Ekstraksi dilakukan pada suhu 60 oC selama 8 jam. Campuran lemak dan heksana dalam labu alas bulat dievaporasi sampai kering. Labu alas bulat yang berisi lemak dimasukan ke dalam oven bersuhu 105 oC selama ± 2 jam untuk menghilangkan sisa n-heksana dan air. Labu dan lemak didinginkan dalam desikator selama 30 menit. Labu alas bulat yang berisi lemak ditimbang (C) sampai berat konstan. Kadar lemak dalam bahan pangan dapat dihitung berdasarkan persamaan berikut : Keterangan: KL = kadar lemak A = bobot contoh B = bobot labu lemak dan labu didih C = bobot labu lemak, batu didih dan lemak d) Analisis kadar karbohidrat (AOAC 2005) Perhitungan kadar karbohidrat dilakukan menggunakan metode by difference yaitu pengurangan 100 % dengan jumlah dari hasil empat komponen yaitu kadar air, protein, lemak dan abu. Perhitungannya sebagai berikut: % Karbohidrat = 100 % - ( % air + % lemak + % protein + % abu ) 3.3.1.3 Analisis asam amino (AOAC 1994) Komposisi asam amino ditentukan dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Perangkat HPLC sebelum digunakan harus dibilas dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe yang akan digunakan juga harus dibilas dengan akuades. Prosedur analisis asam 27 amino menggunakan HPLC disajikan Gambar 7. Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino: Temperatur : 27 oC (suhu ruang) Jenis kolom : pico tag 3,9x150 μm Kecepatan alir eluen : 1 ml/menit Tekanan : 3000 psi Fasa gerak : - Asetoniril 60% - Buffer fosfat 0,1 M Detektor : UV Panjang gelombang : 256 nm Derivatisasi : derivatisasi pre-kolom Tipe injeksi : on column injection tanpa septum Program : isokratik (kecepatan aliran eluen konstan) Kandungan masing-masing asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus: Keterangan : C = konsentrasi standar asam amino (2,5 μg) FB = faktor pengenceran ( 133,1 mL) BM = bobot molekul dari masing-masing asam amino (g/mol) 3.3.1.4 Analisis asam lemak (AOAC 1984) Kandungan asam lemak dapat ditentukan dengan metode gas kromatografi didasarkan pada partisi komponen-komponen dari suatu cairan di antara fasa gerak berupa gas dan fasa diam berupa zat padat atau cairan yang tidak mudah menguap yang melekat pada bahan pendukung inert. Komponen-komponen yang dipisahkan harus mudah menguap pada suhu pemisahan yang dilakukan, sehingga suhu operasi biasanya lebih tinggi dari suhu kamar dan biasanya dilakukan derivatisasi untuk contoh yang sulit menguap. Tahapan analisis asam lemak diawali dengan menghidrolisis lemak/minyak dalam sampel menjadi asam lemak, kemudian ditransformasi menjadi bentuk esternya yang bersifat lebih mudah menguap. Transformasi dilakukan dengan cara metilasi sehingga diperoleh metil ester asam lemak (FAME). Metil ester asam lemak (FAME) ini dianalisis dengan alat kromatografi gas. Identifikasi tiap komponen dilakukan dengan 28 membandingkan waktu retensinya dengan standar pada kondisi analisis yang sama. Waktu retensi dihitung pada kertas rekorder sebagai jarak dari garis pada saat muncul puncak pelarut sampai ke tengah puncak komponen yang dipertimbangkan. Tambelo kering 0,75 g 0,75 g 5-10 ml HCl 6N Penambahan Pemanasan dalam oven pada suhu 100 oC selama 24 jam Hidrolisat Protein Penyaringan dengan milipore berukuran 45 mikron Filtrat hidrolisat Penambahan 30 μL larutan pengering (campuran antara metanol, natrium asetat, dan trietilamim dengan perbandingan 2:2:1) Pengeringan dengan gas N2 Hidrolisat protein kering Penambahan 30 μL larutan derivatisasi ( campuran antara metanol, pikoiotisianat, dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4) Pengenceran dengan buffer asetat sebanyak 200 μL lalu dibiarkan selama 20 menit Penyaringan dengan milipore berukuran 0,45 mikron Injeksi ke alat HPLC Kromatogram Gambar 7 Prosedur analisis asam amino menggunakan HPLC. 29 a. Preparasi contohd (hidrolisis dan esterifikasi) Contoh lemak ditimbang sebanyak 20-30 mg, kemudia ditambahkan 1 mL larutan NaOH 0,5 N ke dalam metanol dan dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Sebanyak 2 mL BF3 16% dan 5 mg/mL standar internal ditambahkan pada sampel tersebut, lalu dipanaskan lagi selama 20 menit dan selanjutnya didinginkan. Sampel kemudian ditambahkan 2 mL NaCl jenuh dan 1 mL n-heksana, lalu dikocok dengan baik. Lapisan heksana dipindahkan dengan bantuan pipet tetes ke dalam tabung yang berisi 0,1 gram Na2SO4 anhidrat, dibiarkan 15 menit. Fasa cair dipisahkan dan selanjutnya diinjeksikan ke kromatografi gas. b. Analisis komponen asam lemak dengan kromatografi gas Pelarut sebanyak 1 µL diinjeksikan ke dalam kolom. Bila aliran gas pembawa dan sistem pemanasan sempurna, puncak pelarut akan nampak dalam kurang dari 1 menit. Sebanyak 5 µL campuran standar FAME diinjeksikan setelah pena kembali ke nol (baseline). Jika semua puncak sudah keluar, diinjeksikan 5 µL sampel yang telah dipreparasi (A). Waktu retensi dan puncak masing-masing komponen tersebut kemudian diukur. Jika rekorder dilengkapi dengan integrator, waktu retensi dan luas puncak langsung diperoleh dari integrator dan membandingkan waktu retensinya dengan standar untuk mendapatkan informasi mengenai jenis dari komponen-komponen dalam contoh. Jumlah dari masing-masing komponen dalam sampel dihitung menggunakan metode internal standar, dengan cara sebagai berikut : Keterangan : Cx Cs Ax As R = = = = = kosentrasi komponen x kosentrasi standar internal luas puncak komponen x luas puncak standar internal respon detektor terhadap komponen x relatif terhadap standar 30 Kondisi alat kromatografi gas pada saat dilakukan analisis : 1. Kolom : cyanopropil methylsil (kolom kapiler) 2. Dimensi kolom : p=60m,ø dalam = 0.25 mm, 025 µm film tickness 3. Laju alir n2 : 20 ml/menit 4. Laju alir h2 : 30 ml/menit 5. Laju alir udara : 200 – 250 ml/menit 6. Suhu injektor : 200 oc 7. Suhu detektor : 230 oc 8. Suhu kolom : program temperatur - Kolom temperatur : awal 190 oC diam 15 menit akhir 230 oC diam 20 menit 9. Ratio : 1:8 10. Injeksi volum : 1 µl 11. Linier velocity : 20 cm.sec 3.3.1.5 Analisis mineral Mineral yang dianalisis pada sampel tambelo meliputi mineral kalsium (Ca), kalium (K), magnesium (Mg), besi, (Fe), natrium (Na), mangan (Mn), klorida (Cl), seng (Zn), fospat, dan tembaga (Cu), dianalisis dengan metode spektrofotometer serapan atom (SSA). a. Analisis mineral kalsium (Ca), kalium (K), dan seng (Zn) (Yosida et al. 1972). Prinsip penentuan kadar kalsium, kalium dan seng adalah proses pelarutan sampel dengan asam menggunakan SSA. sebagai berikut: klorida, kemudian absorbansinya diukur dengan Prosedur analisis mineral kalsium, kalium dan seng adalah Sampel yang telah kering ditimbang sebanyak 1-2 gram, kemudian dihancurkan dan dimasukkan ke dalam gelas piala yang telah dibilas dengan HCl 1 N. Sampel ditambahkan dengan 25 mL HCl 1 N dan disimpan selama 24 jam. Setelah penyimpanan, sampel dikocok dengan shaker dan disaring dengan kertas Whatman No.1. 1). Analisis mineral kalsium (Ca) Ekstrak sampel dipipet sebanyak 1 mL, ditambahkan 2 mL larutan lantanum oksida dan ditambahkan HCl 1 N sampai volume menjadi 10 mL, kemudian ditera dengan penambahan akuades sampai volume menjadi 50 mL. 31 Larutan diukur absorbansi dengan SSA pada panjang gelombang 285,2 nm untuk magnesium dan 422,7 nm untuk kalsium. 2). Analisis mineral kalium (K) dan seng (Zn) Ekstrak sampel dipipet sebanyak 2 mL dan ditambahkan HCl 1 N sampai volume menjadi 40 mL, kemudian ditera dengan penambahan akuades sampai volume menjadi 50 mL. Larutan diukur absorbansi dengan AAS pada panjang gelombang 766,5 nm untuk kalium dan 213,9 nm untuk seng. b. Analisis mineral besi (Fe) Prinsip penentuan kadar besi adalah proses pelarutan bahan dengan larutan asam campur yang terdiri dari asam nitrat, asam sulfat dan asam perklorat, kemudian dilanjutkan dengan proses pemanasan. Prosedur analisis mineral besi adalah sebagai berikut: sampel yang telah kering ditimbang sebanyak 1-2 gram, kemudian dihancurkan. HNO3, H2SO4, Larutan asam campuran disiapkan yang dibuat dari dan HClO4 dengan perbandingan 5:1:2. Sampel yang telah hancur ditambah 10 mL larutan asam campur lalu dipanaskan di dalam ruang asam menggunakan api kecil selama 2 jam. Api dibesarkan sampai larutan menjadi jernih. Kemudian didinginkan. Larutan ditambahkan akuades sampai volume 50 mL dan disaring dengan kertas saring pencucian asam Whatman No.1 (acid-washed filter paper whatman No.1). Sebanyak 10 mL ekstrak sampel ditambahkan 1 mL hidroquinon dan 1 mL orto-fenantrolin, kemudian ditambahkan sodium sitrat sampai pH menjadi 3,5. Larutan diencerkan dengan akuades sampai volume 50 mL dan dipanaskan dalam water bath selama 1 jam. Larutan deret standar diperlakukan dengan pereaksi yang sama dengan ekstrak sampel. Absorbansi diukur dengan SSA pada panjang gelombang 248,3 nm. c. Analisis mineral tembaga (Cu) dan mangan (Mn) (SNI 01-2362-1991) Prinsip dari penentuan kadar tembaga dan mangan adalah proses pengabuan dengan suhu 450 oC dengan penambahan asam nitrat (HNO3). Prosedur analisis sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 25 gram dalam gelas piala 250 mL yang terdahulu dicuci dengan HNO3 6N. Sampel dikeringkan di dalam oven pengering pada suhu 110-125 oC selama 8-24 jam. Sample kering kemudian dipindahkan ke dalam tungku, dan atur suhu pada 250 oC. Suhu tunggu 32 dinaikkan secara bertahap hingga mencapai 350 oC selama periode 1-2 jam. Hal ini bertujuan untuk mencegah terjadinya proses pembakaran secara cepat yang menyebabkan contoh dapat terhambur keluar. Kondisi pada suhu ini dibiarkan sesaat untuk memberikan kesempatan sebagian besar lemak terbakar habis. Kenaikkan suhu kemudian dilanjutkan hingga 450 oC, dan dibiarkan selama semalam (16-24 jam). Jika proses sampel abu belum putih sempurna, sampel dikeluarkan dari tungku dan dinginkan. Sampel tersebut kemudian ditambahkan 0,25-1 mL HNO3 pekat. Sampel diletakkan diatas hot plate untuk menguapkan HNO3. Sampel kemudian dipanaskan kembali pada suhu 450 oC di dalam tungku selama 30-60 menit. Abu yang dihasilkan harus benar-benar putih, apabila tidak proses penambahan asam nitrat harus diulangi. Abu dilarutkan ke dalam 2 mL HNO3 pekat, kemudian diencerkan dengan akuades hingga 25 mL dan didihkan di atas hot plate. Larutan disaring dengan kertas saring Whatman No.42 yang sebelumnya telah dicuci dengan HNO3 10% dan akuades. Filtrat yang diperoleh kemudian diencerkan dengan akuades hingga 50 mL. Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam SSA. Absorbansi mineral Cu dan Mn masing-masing diukur dengan SSA pada panjang gelombang 324,7 nm dan Mn 285,2 nm. 3.3.2 Penelitian tahap kedua Penelitian yang dilakukan pada penelitian tahap kedua adalah ekstraksi bahan aktif, uji fitokimia, uji aktivitas antioksidan, serta uji fraksinasi dan identifikasi senyawa antioksidan. 3.3.2.1 Ekstraksi bahan aktif Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi tambelo yaitu tiga macam pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya, yaitu heksana (non polar), etil asetat (semi polar), dan metanol (polar). Tahapan proses ekstraksi tambelo meliputi penghancuran sampel, maserasi, partisi, dan evaporasi. Sampel kering ditimbang sebanyak 500 gram, kemudian dimaserasi dengan pelarut metanol (MeOH) sebanyak 2500 mL, perbandingan 1:5 pada suhu ruang selama 3x24 jam. Setiap 1 x 24 jam dilakukan penyaringan, kemudian filtrat yang dihasilkan digabungkan dan dipekat dengan menggunakan rotary evaporator. Ekstrak MeOH pekat dipartisi dengan n-heksana menggunakan corong pisah diulang sebanyak 3 kali. 33 Fase n-heksana dikumpulkan dan dipekatkan dan dihitung rendemennya. Ekstrak MeOH setelah partisi n-heksana dipartisi kembali dengan etil asetat, diulang sebanyak 3 kali. rendemennya. rendemen. Fase etil asetat dikumpulkan dan dipekatkan, lalu dihitung Ekstrak metanol sisa partisi dipekatkan kembali dan dihitung Semua ekstrak diuji fitokimia (Miyaoka et al. 1998; Ebada et al. 2008). dan uji antioksidan Diagram alir proses ekstraksi bahan aktif tambelo disajikan pada Gambar 8. Sampel (500 g) Maserasi 3x24 jam dengan MeOH perbandingan 1:5 Penyaringan Filtrat Residu Evaporasi Ekstrak MeOH Dipartisi dengan n-Heksana Fase n-heksana Evaporasi Ekstrak n-Heksana Fase MeOH Dipartisi dengan etil asetat Fase etil asetat Fase MeOH Evaporasi Evaporasi Ekstrak etil asetat Ekstrak MeOH Gambar 8 Diagram alir proses ekstraksi bahan aktif tambelo (Ebada et al. 2008). 34 3.3.2.2 Uji fitokimia (Departemen Kesehatan RI 1995) a) Uji alkaloid Sampel sebanyak 1 gram ekstrak ditambahkan 10 mL metanol dan beberapa tetes amoniak. Fraksi metanol dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H2SO4 2M. Fraksi asam diambil kemudian ditambahkan pereaksi Dragendrof, Meyer, dan Wagner. b) Uji saponin Sebanyak 50 mg sampel ditambah dietil eter. Residu yang tidak larut dalam dietil eter diambil, dipisahkan dan ditambahkan 5 ml air kemudian dikocok sampai timbul busa yang stabil. c) Uji steroid/Triterpenoid Sampel sebanyak 1 gram ditambahkan 25 mL etanol 30% dipanaskan (50 oC) dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambahkan eter. Lapisan eter yang terbentuk dipipet dan diletakkan papan uji (spot plate) dengan menambahkan pereaksi Liebermen Buchard (3 tetes asam asetat anhidrin dan 1 tetes H2SO4 pekat), selanjutnya diamati warna yang terbentuk, jika terbentuk warna hijau adalah steroid dan warna merah adalah triterpenoid. d) Uji Flavonoid Sebanyak 1 gram sampel ditambah metanol 30% sampai terendam kemudian dipanaskan. Filtratnya ditaruh ke dalam spot plate (papan uji) kemudian ditambahkan H2SO4 pekat, adanya flavonoid ditunjukkan oleh terbentuknya warna merah akibat penambahan H2SO4. e) Uji Tanin Sebanyak 50 mg sampel dilarutkan dalam 5 ml etanol ditambah dengan beberapa tetes pereaksi FeCl3 1 %. Adanya tannin ditunjukan dengan terbentuknya warna hijau, biru atau ungu. f) Fenol hidrokuinon (pereaksi FeCl3) Sebanyak 1 g sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan. 35 3.3.2.3 Uji aktivitas antioksidan (Yeh dan Cen 1995) Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode perendaman radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picrlhylhydrazyl) (Yeh dan Cen 1995). Prinsip kerjanya pada sampel (mengandung senyawa bersifat antioksidan) yang dapat meredam radikal bebas DPPH. Uji ini dilakukan terhadap ekstrak tambelo. Ekstrak dilarutkan dalam metanol dan dibuat dalam berbagai konsentrasi ( 20, 40, 60, dan 80 ppm), kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ekstrak tersebut masing-masing ditambahkan 200 μl larutan DPPH 1mM dalam metanol. Volume dicukupkan sampai 5 mL, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Serapan sampel tersebut diukur pada panjang gelombang 515 nm. Butylated hydroxytoluene (BHT) dan vitamin super ester C digunakan sebagai kontrol positif, dan untuk pembanding dengan masing-masing kosentrasi 4, 6, 8, dan 10 ppm. Hambatan dihitung dengan rumus. Nilai absorbansi sampel diperoleh persentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara kosentrasi sampel dan persentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Nilai kosentrasi dan hambatan ekstrak diplotkan masing-masing pada sumbu x dan y. Persamaan regresi yang diperoleh dalam bentuk y = bx + a. Persamaan ini digunakan untuk mencari Inhibition Concentration 50 % (IC50) dengan memasukkan angka 50 sebagai y sehingga didapatkan nilai x sebagai IC50. Pengujian ini dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. 3.3.2.4 Fraksinasi senyawa antioksidan Fraksinasi terhadap ekstrak kasar tambelo dilakukan pada ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi (ekstrak terpilih). Metode yang digunakan ada dua macam, yaitu kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kolom (KK). a) Kromatografi lapis tipis (KLT) Pada penelitian ini, pemilihan pelarut untuk fraksinasi dilakukan dengan mencoba beberapa kombinasi untuk mengembangkan spot ekstrak terpilih pada 36 kromatografi lapis tipis (KLT). Kombinasi yang digunakan adalah pelarut kloroform:metanol dengan perbandingan 9:1 mL, pelarut heksan : etil asetat dengan perbandingan 1:1 mL dan pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 17:3 mL, pelarut heksan:etil asetat dengan perbandingan 8:2 dan n-heksana:kloroform (3:2), untuk memilih eluen terbaik dicoba dengan berbagai eluen n-heksana, kloroform, etil asetat, dan metanol. Ekstrak terpilih sebanyak 0,02 gram dilarutkan dalam 0,5 mL pelarutnya. Larutan ekstrak tersebut kemudian ditotolkan pada plat silika gel 60 F254 dengan panjang l0 cm. Kombinasi pelarut yang menghasilkan pengembangan spot terbaik digunakan sebagai eluen untuk memfraksinasi ekstrak terpilih dengan kromatografi lapis tipis maupun kromatografi kolom. Diagram alir fraksinasi dengan metode KLT dapat disajikan pada Gambar 9. Ekstrak aktif KLT (silika gel) CHCl3:MeOH 9:1ml Heksan:EtOH 1:1ml CHCl3:MeOH 17:3 ml Heksan:EtOH 8:2ml Heksan :CHCl3 3:2 ml terbentuknya spot terbanyak Gambar 9 Diagram alir fraksinasi dengan metode KLT. b) Kromatografi kolom (KK) (Gritter et al. l99l) Pelaksanaan kromatografi kolom dilakukan dengan memasang kolom pada statif secara tegak lurus. Kolom diberi glasswool pada bagian bawahnya. Diagram alir fraksinasi dengan metode kromatografi kolom dapat dilihat pada Gambar 10. Pencucian kolom dilakukan dan pembuatan larutan silika gel (silika gel G40-63) yang akan dimasukkan ke dalam kolom sebelum ekstrak dimasukkan ke dalam kolom. Silika gel sebanyak 13-15 gram dilarutkan pada eluenn kloroform : metanol = 9:1 sehingga diperoleh larutan silika gel. Semua larutan silika gel masuk ke dalam kolom, lalu dilakukan penjenuhan silika gel dalam kolom selama 30-60 menit. Pada proses penjenuhan, bagian atas kolom ditutup 37 dengan aluminium foil untuk mencegah penguapan eluen yang terdapat dalam kolom sehingga silika gel tetap dalam kondisi basah. Ekstrak yang akan difraksinasi adalah ekstrak terpilih sebesar 1 gram dan dilarutkan pada pelarut asal sebanyak 3 mL. Silika gel harus jenuh sebelum ekstrak dimasukkan dan setelah silika gel jenuh maka kran kolom dibagian bawah kolom dibuka kembali setelah semua ekstrak masuk ke dalam kolom. Ekstrak dibiarkan mengalir ke bagian penjerap kolom dan kolom terus diisi agar silika gel tidak kering. Larutan yang keluar dari kolom ditampung pada tabung reaksi dengan masing-masing tabung reaksi berisi ± 3 mL. Larutan dalam tabung reaksi kemudian dikeringkan untuk menghasilkan residu ekstrak. Fraksi hasil kromatografi Kolom (KK) dilakukan pengujian KLT untuk penggabungan fraksi dengan mengacu pada kesamaan pola kromatogram, dan setiap fraksi penggabungan yang terbentuk dikeringkan dengan aerator di ruang asam, dihitung rendamennya, serta diuji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH (Yeh dan Cen 1995). Larutan silica gel + eluen 1: 1 (w/v) Larutan silika gel dimasukkan ke dalam kolom Pembuatan larutan ekstrak terpilih 1 g ekstrak terpilih + 3 ml eluen Dijenuhkan selama 30-60 menit Eluen dikeluarkan (silica gel tidak boleh kering) Larutan ektrak terpilih dimasukkan ke dalam kolom Kran dibuka Kolom terus dialiri eluen Larutan ditampung pada tabung reaksi (±10 ml) Ekstrak aktif Gambar 10 Diagram alir fraksinasi dengan kromatografi kolom. 38 3.3.2.5 Identifikasi senyawa antioksidan (Willard et al. 1988) Fraksi terpilih dengan nilai aktivitas antioksidan yang tertinggi dilanjutkan dengan mengidentifikasi senyawa antioksidan menggunakan Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) Agilent Technologies dilakukan untuk mendapatkan bobot molekul dan rumus molekul yang sangat membantu dalam elusidasi struktur molekul. Analisis yang dilakukan pada tahap identifikasi senyawa aktif, yaitu memilih senyawa yang memiliki puncak tinggi, kemudian dicocokkan dengan senyawa yang ada pada database MarinLit (Blunt and Blunt 2008). 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Penelitian Tahap Pertama 4.1.1 Rendemen daging tambelo Hasil pengukuran rendemen daging tambelo pada Tabel 2 menunjukkan bahwa tambelo segar setelah preparasi 40,00% dan setelah dikeringkan rendemen berubah menjadi semakin kecil yang disebabkan banyaknya kandungan air yang menguap. Jumlah rendemen setelah dikeringkan sebesar 22,73%. Penurunan rendemen tambelo disebabkan penguapan kandungan air akibat bahan mengalami tekanan vakum yang sangat tinggi setelah dibekukan, air akan tersublimasi dan bahan yang tidak tersublimasi berubah menjadi padat atau kering. Hal ini juga menunjukkan bahwa organisme perairan termasuk tambelo dan ikan ini memiliki kandungan air yang tinggi sehingga diperlukan penanganan yang bagus untuk mengurangi kerusakan pada bahan beku. Semakin tinggi rendemen maka semakin tinggi nilai ekonomisnya sehingga lebih efektif. Tabel 2 Rendemen daging tambelo Sampel Tambelo utuh Daging tambelo Berat segar 2200 gram 40,00 % Berat kering 22,73 % 4.1.2 Kandungan proksimat tambelo Hasil analisis proksimat dari daging segar tambelo dan serbuk kering tambelo, meliputi kadar air, protein, lemak, abu, dan karbohidrat. Kandungan proksimat daging tambelo dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Kandungan proksimat daging tambelo Proksimat (%) Kadar air Protein Lemak Abu Karbohidrat Segar Tambelo Temilok 82,72±0,01 7,21±0,31 0,28±0,04 2,07±0,27 7,72±0,62 73,60 1,04 4,29 4,05 17,02 Sumber : a Syaputra (2007) , b a Kering Tambelo Kerang mas ngur b 6,63±0,01 7,8 42,77±2,01 56,08 14,27±0,22 5,95 5,88±1,04 7,88 30,45±2,83 21 Waranmaselembun (2007) Kadar air merupakan jumlah air yang terkandung di dalam bahan pangan dan ikut menentukan kesegaran dan daya awet bahan pangan tersebut. Kadar air 40 yang tinggi mengakibatkan mudahnya bakteri, kapang dan khamir untuk berkembang biak sehingga akan terjadi perubahan pada bahan pangan yang dapat mempercepat pembusukkan (Winarno 1997). Hasil analisis proksimat kadar air tambelo segar adalah 82,72%, setelah mengalami pengeringan dengan freeze dry, kadar air tambelo kering menjadi 6,63%. Hal ini karena air yang terdapat pada tambelo segar tersublimasi akibat adanya tekanan vakum, sehingga tambelo segar menjadi kering. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Syahputra (2007) yang menunjukkan bahwa kadar air temilok segar sebesar 73,60%, sedangkan kadar air tambelo setelah dikeringkan sebesar 6,63%. Hasil perhitungan nilai rata-rata proksimat dapat dilihat pada Lampiran 1. Kadar air yang bahan untuk ekstraksi diisyaratkan sebesar 11%. Hal ini bertujuan agar proses ekstraksi dapat berjalan lancar (Setyowati 2009). Kadar air tambelo kering pada hasil penelitian ini memiliki kadar air dibawah kadar air maksimum yang diisyaratkan untuk proses ekstraksi. Hal ini menunjukkan bahwa sampel kering memiliki kadar air yang cukup baik untuk dilakukan proses ekstraksi karena semakin rendah nilai kadar air bahan maka semakin memudahkan pelarut untuk mengekstrak komponen senyawa aktif yang diinginkan. Protein merupakan zat gizi yang sangat penting bagi tubuh, karena selain sebagai sumber energi, protein berfungsi sebagai zat pembangun tubuh dan zat pengatur di dalam tubuh. Fungsi utama protein bagi tubuh adalah untuk pertumbuhan dan pemeliharaan jaringan, pembentukan senyawa esensial (hormon, enzim, hemoglobin, bahan pengumpal darah), regulasi keseimbangan air dalam tubuh, mempertahankan netralitas tubuh, pembentukan antibodi dan proses detoksifikasi, dan transpor zat gizi dalam tubuh. Protein dalam plasma (serum) darah dapat juga berfungsi sebagai antioksidan (Mucthadi 2009). Kadar protein pada tambelo segar adalah 7,31%, sedangkan kadar protein tambelo kering sebesar 42,77%. Kandungan protein pada tambelo kering berasal dari plankton yang merupakan salah satu makanan bagi tambelo. Plankton diketahui sebagai sumber protein sekaligus simbion dalam sistem pencernaan pada tambelo. 41 Hasil analisis kadar lemak dari tambelo segar adalah 0,28%, sedangkan kadar lemak pada tambelo kering sebesar 14,26%. Jika dibandingkan dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Syahputra (2007), kadar lemak tambelo lebih rendah dibandingkan dengan kadar lemak temilok segar (4,29%). Peranan lemak dalam bahan pangan yang utama adalah sebagai sumber energi. Lemak merupakan sumber yang dapat menyediakan energi sekitar 2,25 kali lebih banyak daripada yang diberikan oleh karbohidrat atau protein. Lemak adalah bentuk energi berlebih yang disimpan oleh hewan sehingga jumlah lemak dalam hewan yang dijadikan bahan pangan ditentukan oleh keseimbangan energi hewan tersebut. Ikan menyimpan cadangan energi dalam bentuk lemak di dalam hatinya (lebih dari 50% berat hatinya). Peranan lemak ikan dalam mencegah timbulnya penyakit jantung koroner telah dibuktikan. Hal ini terutama karena peranan asam lemak eikosapentaenoat (EPA) dan dokosaheksaenoat (DHA), yang terkenal dengan sebutan asam lemak omega 3, dalam menurunkan kadar LDL dan meningkatkan kadar HDL (Muchtadi 2009). Abu adalah zat anorganik, sisa hasil pembakaran suatu bahan organik. Sebagian besar bahan makanan, yaitu sekitar 96% terdiri dari bahan organik dan air, sisanya terdiri dari unsur- unsur mineral. Unsur mineral juga dikenal sebagai zat organik atau kadar abu. Pada proses pembakaran, bahan-bahan organik terbakar tetapi zat anorganiknya tidak, karena itulah disebut abu. Elemen-elemen mineral telah jelas diketahui fungsinya pada makanan ternak, belum banyak penelitian sejenis dilakukan pada manusia. Peranan berbagai unsur mineral bagi manusia masih belum sepenuhnya diketahui (Winarno,1997). Tabel 3 menunjukkan bahwa kandungan abu dalam tambelo segar 2,07%, lebih kecil dari temilok 4.05% dan kandungan abu pada tambelo kering 5,88% lebih kecil dari kerang mas ngur 7,88%, jika dibandingkan dengan literatur yang ada maka nilai hasil analisis memiliki nilai yang tidak jauh berbeda. Karbohidrat merupakan bagian terbesar dari senyawa organik, hal ini disebabkan karbohidrat merupakan bahan pembentukan tumbuh-tumbuhan dan juga terdapat pada hewan dalam jumlah tertentu. Berdasarkan hasil analisis proksimat pada tambelo kering memiliki karbohidrat yang relatif lebih tinggi 42 30,44%. Hal ini diduga bahwa tambelo menyimpan hasil pencernaan dalam bentuk glikogen, karena sebagian besar juga makanan yang diperolehnya berasal dari kayu bakau sehingga sistem pencernaannya dapat memanfaatkan selulosa dan lignin pada kayu bakau. Hal ini diperkuat oleh Purchon (1968) yang mengatakan bahwa sistem pencernaan yang dimiliki oleh shipworm atau tambelo mampu mencerna selulosa 80% dan lignin 45 dan pada umumnya kerang-kerangan menyimpan hasil pencernaannya dalam bentuk glikogen (gula otot) dan lemak. 4.1.3 Kandungan asam amino tambelo Mutu protein dinilai dari perbandingan asam-asam amino yang terkandung di dalam protein tersebut. Pada prinsipnya suatu protein yang dapat menyediakan asam amino esensial dalam suatu perbandingan yang dapat menyamai kebutuhan manusia dikatakan mempunyai mutu yang tinggi, sebaliknya protein yang kurang satu atau lebih asam-asam amino esensial mempunyai mutu yang rendah (Winarno 2008). Asam amino merupakan monomolekul dari protein yang memiliki fungsi penting bagi organisme hidup. Tambelo mengandung 17 jenis asam amino. Jenis asam amino yang tertinggi dalam tambelo adalah asam glutamat (3,55%), sedangkan asam amino isoleusin yang terendah (0,34%). Kandungan asam amino dari tambelo disajikan dalam Gambar 10, sedangkan kromatogram standar asam amino dapat dilihat Kadar Asam Amino (%) pada Lampiran 3 dan kromatogram asam amino tambelo pada lampiran 4. 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 3,55 2,85 1,74 1,63 1,81 1,80 1,29 1,25 1,26 1,19 0,34 0,56 0,72 1,01 0,37 0,41 0,41 Jenis Asam Amino Gambar 11 Histogram kandungan asam amino dari tambelo. 43 Kandungan asam amino yang terdapat di dalam tambelo diklasifikasikan menjadi sembilan jenis asam amino yang terdiri dari asam amino esensial, asam amino non esensial, asam amino asam, asam amino basa, asam amio netral, asam amino aromatik, asam amino sulfur, asam amino hidrofilik, dan asam amino hidrofobik, dapat disajikan pada Tabel 4. Tabel 4 Klasifikasi asam amino berdasarkan sifat fisik dan kimia dari tambelo Jenis asam amino Aspartat Glutamat Serin Glisin Alanin Prolin Tirosin Sistein Histidin Treonin Ariginin Valin Metionin Isoleusin Leusin Fenilalanin Lisin TOTAL % dalam total asam amino Klasifikasi asam amino (% berat protein) AAE AANE AAA AAB AAN AAR AAS AAHi 2,85 2,85 2,85 3,55 3,55 3,55 1,26 1,26 1,26 1,74 1,74 1,74 1,63 1,63 0,41 0,72 0,72 0,72 0,72 0,41 1,01 1,01 1,01 0,37 1,80 1,80 1,80 1,29 1,29 0,56 0,56 0,56 0,34 1,25 1,25 1,19 1,19 1,19 1,81 1,81 1,81 8,97 13,58 6,4 4,62 9,64 1,91 0,56 14,74 40,42 61,20 28,84 20,82 43,44 8,61 2,52 66,43 AAHb 1,63 1,29 0,56 1,25 1,19 5,92 26,68 AANE = asam amino non esensial; AAE = asam amino esensial; AAA = asam amino asam; AAB = asam amino basa; AAN = asam amino netral; AAR= asam amino aromatik; AAS = Asam amino sulfur; AAHi = asam amino hidrofilik; AAHb = asam amino hidrofobik. Asam glutamat adalah asam amino non esensial yang dapat disintesis dari gugus amida pada molekul glutamin yang diubah menjadi karboksilat melalui proses hidrolisis asam atau basa. Asam glutamat bermanfaat untuk menahan konsumsi alkohol berlebih, mempercepat penyembuhan luka pada usus, meningkatkan kesehatan mental dan meredam depresi (Linder 1992). Menurut the international glutamate information service (IGIS), glutamat yang berasal dari makanan merupakan sumber energi utama bagi usus. Kajian-kajian menggunakan isotop-isotop stabil menunjukkan bahwa usus mendapatkan sebagian besar energi 44 dari metabolisme asam amino. Usus sangat membutuhkan glutamat, dan telah diperlihatkan bahwa semua glutamat yang dimakan dari bahan makanan hanya 4 % yang keluar dari tubuh. Glutamat yang berasal dari makanan diperlukan bersama dengan sistin dan glisin untuk produksi glutathion, suatu molekul antioksidan yang memainkan peranan penting dalam mekanisme daya tahan tubuh serta perbaikan kerusakan sel dan jaringan tubuh. Glutamat bersama dengan glutamin merupakan asam amino yang paling berlimpah dari 20 jenis asam amino yang mencapai 20 persen dari asam-asam amino pada usus (the international glutamate information service). Sistin merupakan penghasil taurin yaitu suatu komponen gliutathion. Glutathion merupakan pelindung otak dan hati dari kerusakan akibat obat atau racun, alkohol dan unsur-unsur lain yang dapat membahayakan tubuh. Sistin juga diperlukan untuk kesehatan kulit, detoksifikasi dari tubuh (dalam kaitannya dengan sulfur) serta penghasil kolagen yang digunakan untuk kekenyalan kulit dan tekstur. Secara medis, sistin digunakan untuk memperoduksi hati dan mencegah atau meredakan penyakit yang berbahaya (Cat 2000). Asam-asam amino hasil pemecahan protein sebelum ditransportasikan ke hati terlebih dahulu diabsorbsi melalui sel-sel mukosa usus dan selanjutnya di serap oleh vena untuk kemudian ditranspor ke hati. Usus merupakan garis pertahanan pertama tubuh karena dari semua organ pencernaan, usus mempunyai kontak terbesar dengan lingkungan eksternal dalam bentuk makanan. Keterkaitan dengan pengunaan tambelo sebagai obat tradisional maka ditinjau dari komposisi asam amino yang diperoleh dapat dijelaskan bahwa umumnya asam-asam amino ini mempunyai kegunaan besar bagi kesehatan manusia. Beberapa asam amino ini secara umum mempunyai kegunaan besar untuk kesehatan manusia, baik secara langsung maupun tidak langsung di antaranya adalah metionin, isoleusin, leusin, histidin, lisin, phenilalanin, asam aspartat, asam glutamat, valin, glisin, alanin, prolin, sistin, dan treonin. Metionin merupakan suatu antioksidan yang baik karena dapat mensuplai belerang, menginaktifkan radikal bebas, dan membantu meningkatkan daya ingat. Metionin juga merupakan prekusor sistin yang merupakan asam amino penghasil glutathion untuk detoksifikasi di hati, dan juga merupakan salah satu amino yang 45 diperlukan untuk pembuatan creatine monohydrate di dalam tubuh, yaitu suatu campuran yang penting untuk menghasilkan energi dan pertumbuhan otot dan pergerakan tubuh. Metionin juga dapat berperan dalam menstabilkan lemak, membuat pencernaan menjadi lebih baik, dan sebagai antioksidan. Kekurangan metionin dapat menyebabkan akumulasi lemak di hati, pertumbuhan yang lambat, lemah, luka mengkerut, dan edema. Secara medis, metionin digunakan untuk gangguan depresi, radang sendi, dan penyakit hati atau liver (Cat 2006). Valin bermanfaat dalam pertumbuhan dan perbaikan jaringan otot serta menjaga keseimbangan nitrogen dan mengatur penggunaan glukosa. Valin merupakan salah satu dari tiga asam amino rantai cabang (yang lain adalah leusin dan isoleusin) yang meningkatkan energi, meningkatkan daya tahan tubuh, membantu proses pemulihan, memperbaiki jaringan otot, menurunkan kadar gula darah, dan meningkatkan produksi hormon pertumbuhan. Penambahan valin harus selalu dikombinasikan dengan isoleusin dan leusin pada rasio miligram (Bonderud 2011). Isoleusin bermanfaat dalam mempercepat penyembuhan luka, mengatur gula darah, dan membantu dalam pembentukan hemoglobin serta merupakan pertahanan utama tubuh untuk melawan infeksi akibat luka. Leusin bermanfaat dalam pengaturan gula darah, pertumbuhan dan perbaikan jaringan kulit, tulang dan otot serta membantu dalam penyembuhan luka, mengatur energi, dan membantu penguraian di dalam otot (Cat 2006). Histidin di dalam tubuh diperlukan untuk pertumbuhan dan perbaikan dari semua jenis jaringan. Histidin berperan penting dalam pemeliharaan dan pembuatan glial sel saraf yang disebut oligo-dendrocytes (selendang atau pembungkus) dan mencegah kerusakan otak dan jaringan saraf dalam tulang punggung. Histidin merupakan suatu prekusor asam amino non esensial, yang mana histidin akan membentuk sistem imun sebagai respon terhadap suatu reaksi alergi. Secara medis, histidin digunakan dalam mengobati radang sendi dan ketulian saraf. Alanin merupakan sebuah sumber penting energi untuk jaringan otot, otak dan sistem saraf pusat, memperkuat sistem kekebalan tubuh dengan memproduksi antibodi, membantu dalam metabolisme gula dan asam organi. Leusin bermanfaat 46 dalam pengaturan gula darah, pertumbuhan dan perbaikan jaringan kulit, tulang dan otot , membantu dalam penyembuhan luka, mengatur energi serta membantu penguraian di dalam otot (Cat 2006). Arginin penting untuk kesehatan reproduksi pria karena 80% cairan semen terdiri dari arginin. Arginin berperan dalam membantu detoksiifikasi hati pada sirosis hati dan fatty liver, meningkatkan sistem imun, menghambat pertumbuhan sel tumor dan kanker serta membantu pelepasan hormon pertumbuhan (Supamas 2011). Fenilalanin secara medis digunakan untuk perawatan radang sendi dan depresi. Kekurangan phenilalanin akan menyebabkan tubuh lemah, lesu, kerusakan hati dan pertumbuhan terhambat. Lisin digunakan di dalam tubuh untuk penyerapan kalsium serta pembentukan tulang dan pertumbuhan otot seperti mobilisasi lemak untuk digunakan sebagai energi. Lisin juga bermanfaat dalam menjaga keseimbangan nitrogen serta membantu menjaga badan pada saat stress berat dan kondisi yang melelahkan. Lisin juga diperlukan dalam membentuk antibody, hormone (GH, testosteron, hormon insulin), enzim, kolagen dan untuk memperbaiki jaringan yang rusak dan juga membantu dalam membangun protein otot yang baru, dan manfaatnya untuk cardiovascular meliputi pemeliharaan kesehatan pembuluh darah. Kekurangan lisin akan menyebabkan kekacauan enzim, kehilangan energi, kerontokan rambut, berat badan menurun, tidak berselera dan hilang kosentrasi (Cat 2006). Treonin bermanfaat dalam mencegah penumpukan lemak di hati, membantu kerja hati dan fungsi lipotropiknya. Kekurangan treonin akan menyebabkan warna kulit menjadi tidak normal. Hati mempunyai fungsi untuk melakukan metabolisme protein, lemak, dan karbohidrat. Apabila fungsi hati terganggu maka akan berdampak pada terganggunya proses metabolisme tersebut. Penderita gangguan hati, seperti sakit liver membutuhkan makanan yang tinggi protein dan karbohidrat serta lemak dengan kadar yang sedang karena hal ini akan meringankan kerja hati untuk memperoleh energi yang besar untuk aktivitasnya (Carroli et al. 2006). Tabel 5 menunjukkan skor kimia asam amino esensial tambelo dengan cara melakukan perbandingan antara asam amino protein esensial tambelo dengan 47 referensi dari FAO/WHO (1991). Berdasarkan hasil pengamatan, diketahui bahwa angka terendah ditunjukkan oleh asam amino isoleusin dan treonin masingmasing sebesar 19,87% dan 21,63% sehingga diperoleh skor kimia protein tambelo sebesar 19,87% dengan asam amino pembatas yang utama berada pada isoleusin. Hal ini berarti bahwa protein yang terkadung dalam tambelo dapat dimanfaatkan oleh tubuh hanya sekitar 19,87%, sehingga asam amino esensial perlu difortifikasi untuk meningkatkan nilai gizi protein tambelo. Tabel 5 Skor kimia asam amino esensial tambelo Asam amino Isoleusin Kadar dalam tambelo (mg/g prot) 7,95 Referesi FAO (1991) (mg/g prot) Skor kimia amino esensial (%) 40 19,87 Leusin 29,23 70 41,75 Lisin 42,32 55 76,94 Metionin 13,09 35 37,41 Fenilalanin + tirosin 22,33 60 37,22 8,65 40 21,63 30,16 50 60,32 Treonin Valin Keterangan : tritofan bukan asam amino pembatas sehingga tidak dilakukan analisis 4.1.4 Kandungan asam lemak tambelo Asam lemak adalah asam organik yang terdapat sebagai ester trigliserida atau lemak, baik yang berasal dari hewan atau tumbuhan. Analisis asam lemak dilakukan dengan menggunakan alat kromatografi gas untuk mengetahui komposisi asam lemak yang terdapat pada tambelo. Berdasarkan analisis kualitatif, keragaman asam lemak pada serbuk tambelo dapat teridentifikasi 15 jenis asam lemak, yang terdiri dari 7 jenis asam lemak jenuh (SFA), 5 jenis asam lemak tidak jenuh tunggal atau monounsaturated fatty acid (MUFA) dan 3 jenis asam lemak jenuh ganda atau polyunsaturated fatty acid (PUFA). Kromatogram standar asam lemak disajikan pada Lampiran 5, sedangkan kromatogram asam lemak daging tambelo disajikan pada Lampiran 6. Komposisi asam lemak dalam tambelo dapat dilihat pada Tabel 6. Jenis asam lemak yang banyak terkandung di dalam serbuk tambelo adalah asam palmitoleat (C16:1) (14,55 %). Asam palmitoleat adalah salah satu jenis 48 asam lemak tak jenuh tunggal (MUFA) yang merupakan jenis asam lemak yang memiliki satu ikatan rangkap pada rantai karbonnya. Asam lemak ini tergolong dalam asam lemak rantai panjang (LCFA), yang kebanyakan ditemukan dalam minyak zaitun, minyak kedelai, minyak kacang tanah, minyak biji kapas, dan canola. Asam lemak tak jenuh tunggal secara umum memiliki efek yang menguntungkan terhadap kadar kolesterol dalam darah, terutama bila digunakan sebagai pengganti asam lemak jenuh. Dalam hal penurunan kadar kolesterol darah, asam lemak tak jenuh tak tunggal (MUFA) lebih efektif bila dibandingkan dengan asam lemak tak jenuh jamak (PUFA) sehingga pemanfaatan asam oleat untuk formulasi makanan olahan menjadi popular (Achadi 2010). Tabel 6 Komposisi asam lemak dalam tambelo No Asam lemak Hasil (%berat minyak) Asam Lemak Jenuh 1 Miristat (C14:0) 5,80 2 Pentadekanoat (C15:0) 0,10 3 Palmitat (C16:0) 4 Heptadekanoat (C17:0) 0,66 5 Stearat (C18:0) 3,04 6 Arakidat (C20:0) 0,22 7 Heneikosanoat acid (C21:0) 0,80 13,69 Asam Lemak Tak Jenuh 8 Miristoleat (C14:1) 0,33 9 Palmitoleat (C16:1) 14,55 10 Cis-10-Heptadekanoat (C17:1) 0,24 11 Oleat (C18:1ω9) 1,94 12 Linolenat (C18:3ω3) 0,10 13 Cis-8,11,14-Eikosatrienoat (C20:3ω6) 0,13 14 EPA (C20:4ω3) 0,13 15 Arakidonat (20:4ω6) 0,29 Asam oleat (omega-9) yang terkandung di dalam tambelo kering sebesar 1,94%. Asam oleat memiliki sifat lebih stabil dan lebih baik perannya dibandingkan PUFA (PolyUnsaturated Fatty Acid), meskipun PUFA dapat menurunkan kolesterol LDL. Asam lemak tak jenuh ganda (PUFA) memiliki 49 kelemahan, yaitu dapat menurunkan HDL, sedangkan MUFA mampu menurunkan LDL dan meningkatkan HDL. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Mensink (1987) diacu dalam Achadi (2010) menunjukkan bahwa MUFA mampu menurunkan LDL dan meningkatkan HDL yang lebih besar dibandingkan dengan omega-3 dan omega-6. Jenis-jenis asam lemak tak jenuh ganda (PUFA) yang terkandung dalam tambelu kering, yaitu asam linoleat (C18:3ω3), asam eikosatrienoat (C20:3ω6), asam arakhidonat (C20:4 ω6), dan asam eikosapentanoat/EPA (C20:4ω3). Asam lemak tak jenuh ganda berperan penting dalam transpor dan metabolisme lemak, fungsi imun, mempertahankan fungsi, dan integritas membran sel. Asam lemak omega-3 dapat membersihkan plasma dari lipoprotein kilomikron dan kemungkinan juga dari VLDL (Very Low Density Lipoprotein) serta dapat menurunkan produksi trigliserida dan apolipoprotein beta di dalam hati (Achadi 2010). 4.1.5 Kandungan mineral tambelo Sekitar 96% bahan makanan terdiri dari bahan organik dan air. Sisanya terdiri dari unsur-unsur mineral. Sampai sekarang telah diketahui ada empat belas unsur mineral yang berbeda jenisnya diperlukan manusia agar memiliki kesehatan dan pertumbuhan yang baik. Unsur-unsur ini terdapat dalam tubuh dalam jumlah yang cukup besar dan karenanya disebut unsur mineral makro. Unsur mineral lain, seperti besi, iodium, mangan, tembaga, zink, kobalt, dan fluor hanya terdapat dalam tubuh dalam jumlah kecil saja, karena itu disebut trace element atau mineral mikro. Di dalam tubuh unsur mineral berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Kandungan mineral yang terdapat pada tambelo disajikan pada Tabel 7. Kandungan mineral pada tambelo diuji karena peranannya sebagai antioksidan dalam sistem pertahanan tubuh terhadap reaksi oksidasi radikal bebas dan mineral ini tergabung dalam enzim antioksidan yang berperan melindungi membran sel dan komponen dalam sitosol. Unsur kalsium (Ca) juga dianalisis bukan karena sebagai antioksidan, tetapi karena perannya yang sangat penting untuk pembentukan tulang dan gigi terutama pada masa pertumbuhan dan ibu hamil. Kadar Kalsium dari tambelo adalah 3532,46 ppm. Kekurangan Kalsium akan menyebabkan osteoporosis dan 50 akan mempengaruhi mental dan juga menyebabkan osteomalasia. Penyerapan Ca akan dipermudah dengan adanya vitamin D (Muchtadi 2009). Tabel 7 Kandungan mineral yang terdapat pada tambelo No Parameter Mineral Makro Kalsium (Ca) 1. Hasil (ppm) 3532,46 2. Klorida (Cl 5,41 3. Kalium (K) 626,40 4. Magnesium (Mg) 5. Mangan (Mn) <0,02 6. Natrium (Na) 435,42 Mineral Mikro Besi (Fe) 7. 8. Seng (Zn) 9. Tembaga (Cu) 10. Fosfor (P) 11. Selenium (Se) 3,05 1373,45 12,30 0,98 2363,06 0,18 Peranan zat besi (Fe) berhubungan dengan kemampuannya dalam reaksi oksidasi dan reduksi. Secara kimia, zat besi merupakan unsur yang sangat reaktif sehingga mampu berinteraksi dengan oksigen. Dalam keadaan tereduksi, besi kehilangan dua elektron sehingga memiliki dua sisa muatan positif (Fe2+ /fero), dalam keadaan teroksidasi, besi kehilangan tiga elektron sehingga memiliki tiga sisa muatan positif (Fe3+/feri) karena dapat berada dalam dua bentuk ion ini, besi berperan dalam respirasi sel, yaitu sebagai kofaktor bagi enzim-enzim yang terlibat dalam reaksi oksidasi reduksi (FAO/WHO 2001; Almatsier 2006). Aktivitas superoksida dismutase (SOD) dan katalase tergantung pada zat besi. Antioksidan enzimatis bekerja dengan cara mencegah terbentuknya senyawa radikal baru (Marks et al. 2000; Winarsi 2007). Zat besi sebagian besar berada dalam hemoglobin. Zat besi juga berperan dalam imunitas dalam pembentukkan sel-sel limfosit. Kandungan seng (Zn) pada tambelo segar adalah 12,30 ppm. Seng merupakan mineral penting pada berbagai sistem enzim dan hormon. Sebagai 51 salah satu mineral imunitas yang berfungsi untuk maturasi, diferensiasi, proliferasi, dan aktivasi sel T. Kemampuan tubuh seseorang untuk menyerap seng menurun sesuai dengan pertambahan usia sehingga penting untuk meningkatkan intake mineral seng ketika usia 40-an. Keadaan tubuh yang mengalami stres karena trauma, terkena polusi lingkungan, dan luka dapat menghabiskan suplai seng dalam tubuh (Wirahadikusumah 1985). Hasil penelitian Winarsi (2004) yang memberikan minuman susu skim yang diperkaya dengan isoflavon kedelai sebesar 100 mg dan 8 mg ZnSO4 yang diberikan setiap hari selama 2 bulan pada wanita premenopause diketahui dapat menurunkan sindrom premenopause, meningkatkan aktivitas enzim antioksidan, kadar IgG antiTT, dan hormon timulin 1. Seng (Zn) berperan dalam sistem pertahanan tubuh dengan cara berkonjugasi dengan thiol sehingga menghambat pembentukan ion superoksida. Mineral Zn sebagai komponen protein yang mempunyai gugus SH-(metallothionine) berperan sebagai pembersih radikal bebas. Mineral Zn juga merupakan komponen enzim yang berperan dalam perbaikan asam nukleat (Harris diacu dalam Ridwan 1997). Mineral Cu berperan melalui aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD). Enzim superoksida dismutase mempunyai substrat spesifik, yaitu ion superoksida. Peran tembaga sebagai kofaktor maupun sebagai pengatur enzim SOD cukup besar. Jika tubuh kekurangan tembaga maka akan terjadi peningkatan peroksida lipid (Harris diacu dalam Ridwan 1997). Hasil analisis diketahui bahwa kandungan tembaga (Cu) yang terdapat pada tambelo nilainya kecil, yaitu 0,98 ppm. Selenium (Se) adalah mineral penting yang sangat dibutuhkan oleh tubuh sebagai antioksidan untuk meredam aktivitas radikal bebas dan merupakan bagian penting enzim glutation peroksidase, yang dapat menghancurkan peroksida yang terbentuk dari hasil oksidasi lemak di dalam tubuh (Mucthadi D 2009). Selenium tidak diproduksi oleh tubuh, tetapi diperoleh dari konsumsi makanan sehari-hari. Angka kecukupan Se per hari yang dianjurkan oleh Widya Nasional Pangan dan Gizi (2004) adalah 5-20 µg untuk bayi dan anak di bawah 10 tahun dan 20-30 µg untuk pria dan wanita berumur di atas 10 tahun sebesar. Khusus ibu hamil dan 52 menyusui mendapat tambahan, masing-masing sebanyak 5 dan 10 µg/orang/hari (Winarno 2008). Kadar Selenium di dalam tambelo adalah 0,18 ppm. 4.2 Penelitian Tahap Kedua 4.2.1 Rendemen ekstrak tambelo Ekstraksi merupakan salah satu cara pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu bahan. Penelitian ini dilakukan proses ekstraksi dengan metode maserasi yang dilanjutkan dengan partisi cair-cair. Rendemen ekstrak tambelo yang terbesar adalah ekstrak kasar metanol 5,72%, sedangkan ekstrak tambelo yang mengandung rendamen relatif kecil adalah ekstrak n-heksana (2,19% ) dan etil asetat (2,86%). Berdasarkan hasil rendemen ekstrak tambelo tersebut, terbukti bahwa tambelo mengandung berbagai senyawa dengan tingkat kepolaran yang berbeda-beda. Besarnya rendemen ekstrak metanol diduga berkaitan dengan sifat pelarut metanol yang memiliki kemampuan pemisahan komponen dari bahan yang lebih baik. Hal ini sesuai dengan pernyataan Heath dan Reineccius (1986) bahwa metanol mampu mengekstrak senyawa organik, sebagian lemak serta tanin yang menyebabkan hasil ekstraksi metanol cukup kuat. Selain itu, pelarut metanol memiliki nilai kostanta dielektrik tinggi jika dibandingkan dengan pelarut yang lain sehingga pelarut metanol dapat membuka dinding sel yang mengakibatkan hampir semua senyawa dapat tertarik keluar dari dalam sel. 4.2.2 Kandungan fitokimia ekstrak tambelo Analisis fitokimia adalah salah satu cara untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder pada suatu tanaman atau hewan. Kandungan fitokimia ekstrak tambelo dapat dilihat pada Tabel 8. Tabel 8 Kandungan fitokimia ekstrak tambelo Uji Fitokimia Alkaloid Flavonoid Phenol Hidroquinon Steroid Triterpenoid Saponin Tanin n-Heksana + + + + + - Jenis Pelarut Etil Asetat + + + + + - Metanol + + + + + - 53 Berdasarkan hasil uji fitokimia ekstrak kasar tambelo, bahwa ekstrak metanol memiliki senyawa alkaloid yang sangat tinggi. Hal ini diduga senyawa alkaloid merupakan senyawa polar, karena senyawa yang terbawa pada proses ekstraksi adalah senyawa yang mempunyai polaritas sesuai dengan pelarutnya yaitu pelarut metanol. Khopkar (2003) berpendapat bahwa bahan dan senyawa kimia akan mudah larut pada pelarut yang relatif sama kepolarannya. Pelarut yang bersifat polar mampu mengekstrak senyawa alkaloid kuartener, komponen fenolik, karotenoid, tanin, gula, asam amino, dan glikosida (Harborne 1987). Alkaloid adalah senyawa alami amina, baik pada tanaman, hewan, ataupun jamur dan merupakan produk yang dihasilkan dari proses metabolisme sekunder, saat ini diketahui sebanyak 5.500 jenis alkaloid (Harborne 1987). Pada umumnya, alkaloid bebas basa hanya larut dalam pelarut organic, meskipun beberapa pseudoalkaloida dan protoalkaloida yang larut dalam air. Garam alkaloida kuarterner sangat larut dalam air (Sastrohamidjojo 1996). Ekstrak etil asetat tambelo (Tabel 8) diketahui mengandung senyawa flavonoid yang tinggi. Hal ini karena pelarut etil asetat bersifat semi polar sehingga memiliki kemampuan melarutkan senyawa polar dan non polar. Flavonoid merupakan senyawa polar yang mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih atau suatu gula sehingga akan larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, dan air (Harborne 1987). Flavonoid merupakan golongan senyawa polifenol yang terdiri atas 15 karbon sebagai kerangka dasarnya. Kelima belas atom karbon tersebut membentuk dua cincin aromatik (C6) yang terikat pada rantai propana (C3) sehingga membentuk susunan C6-C3-C6. Berdasarkan susunan ini dapat dihasilkan 3 jenis struktur, yaitu flavonoid (1’B-2C), isoflavonoid (1’B-3C), dan 1 neoflavonoid (1’B-4C). Menurut Pratt dan Hudson (1990), polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam sinamat, yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi flavon, flavonol, isoflavon, katekin, dan kalkon. Cos et al. (1998) melaporkan bahwa beberapa senyawa flavonoid bersifat antioksidan dan dapat menghambat kerja enzim xantin oksidase maupun reaksi superoksida. Kemudian dilaporkan juga senyawa flavonoid dari stereospermum 54 personatum selain bersifat antioksidan, senyawa tersebut juga dapat menghambat kerja enzim xantin oksidase (Kumar et al. 2006). Berdasarkan hasil uji fitokimia, ekstrak n-heksana tambelo mengandung senyawa steroid yang tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang terdapat pada ekstrak n-heksana bersifat non polar. Steroid merupakan golongan senyawa triterpenoid yang dapat diklasifikasikan menjadi steroid dengan atom karbon tidak lebih dari 21 yaitu sterol, sapogenin, glikosida jantung dan vitamin D. Steroid alami berasal dari berbagai transformasi kimia dua triterpena yaitu lanosterol dan sikloartenol. Senyawa steroid dapat digunakan sebagai bahan dasar pembuatan obat (Harbone 1987). Ada beberapa steroid seperti, fukosterol, diisolasi dari sumber daya hayati laut bersifat non toksik dan mempunyai khasiat menurunkan kolesterol dalam darah dan mendorong aktivitas antidiabetes (Bhakuni et al. 2005). 4.2.3 Aktivitas antioksidan ekstrak tambelo Pengujian aktivitas antioksidan dalam penelitian ini menggunakan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (Molyneux 2004; Vattem dan Shetty 2006). Senyawa DDPH adalah suatu radikal bebas stabil yang dapat bereaksi dengan radikal lain membentuk senyawa yang lebih stabil dan dapat bereaksi dengan atom hidrogen membentuk DPPH tereduksi (diphenylpicrylhydrazine) yang stabil. Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan apabila senyawa tersebut mampu mendonorkan atom hidrogennya ditandai dengan perubahan warna ungu menjadi kuning pucat (Molyneux 2004). Perubahan warna yang mengindikasikan adanya reaksi peredaman radikal bebas DPPH oleh senyawa antioksidan baik pada larutan ekstrak tambelo maupun pada larutan BHT dan vitamin super ester C. Perubahan warna pada ekstrak tambelo dapat dilihat pada Lampiran 7. Besarnya daya peredaman radikal bebas DPPH maka dilakukan pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 515 nm. Pengukuran absorbansi dilakukan pada setiap sampel antioksidan yang dibuat dengan berbagai konsentrasi. Secara teoritis, semakin tinggi kosentrasi antioksidan yang ditambahkan pada larutan DPPH, maka nilai absorbansi akan semakin turun karena warna larutan bertambah kuning. Peredaman (inhibisi) terhadap radikal bebas dinyatakan dalam persen, 55 dan aktivitas antioksidan dinyatakan dengan IC50 (Inhibition Concentration) yang menunjukkan kosentrasi sampel antioksidan yang dapat menghambat atau meredam aktivitas antioksidan yang semakin tinggi atau dengan kata lain IC50 sebagai kosentrasi senyawa antioksidan yang menyebabkan hilangnya 50% aktivitas DPPH. Semakin kecil nilai IC50 berarti aktivitas antioksidannya semakin tinggi (Molyneux 2004). Nilai IC50 dari ekstrak tambelo, BHT, dan vitamin super ester C disajikan pada Gambar 12. Rata-rata IC50 (ppm) 300 262,77 29,53 250 200 150 84,01 4,21 100 50 15 3,83 8,27 3,35 0 BHT Vitamin n-heksana ester super C Etil asetat Metanol Sampel Gambar 12 Nilai IC50 dari ekstrak tambelo, BHT, dan vitamin super ester C. Tabel 9 memperlihatkan bahwa nilai aktivitas antioksidan pada BHT dengan nilai IC50 3,35 ppm dan vitamin super ester C yaitu 8,27 ppm jauh leih ebih kecil dibandingkan dengan ketiga ekstrak kasar tambelo Tabel 9 Aktivitas antioksidan ekstrak tambelo 4 ppm % Inhibisi 6 ppm 8 ppm BHT 55,56 65,51 Vitamin super ester C 15,74 27,78 Sampel 10 ppm IC50 (ppm) 81,02 94,44 3,35 51,16 63,19 8,27 Berdasarkan Gambar 12, menunjukkan ekstrak etil asetat tambelo memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat dari kedua ekstrak yang lainnya, dengan nilai rata-rata IC50 sebesar 15.00 ppm. Ekstrak metanol tambelo memiliki aktivitas antioksidan yang kuat dengan nilai IC50 sebesar 85,86 ppm, sedangkan 56 ekstrak n-heksana tambelo memiliki aktivitas antioksidan yang lemah dengan nilai IC50 sebesar 262,77 ppm. Rendahnya aktivitas antioksidan ekstrak n- heksana diduga karena pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak nheksana tambelo dan kristal DPPH pada penelitian ini adalah metanol yang bersifat polar. Hal ini menyebabkan komponen bioaktif yang bersifat non polar pada ekstrak n-heksana tidak terlarut sepenuhnya pada pelarut tersebut sehingga berpengaruh pada nilai IC50. Bois (1958) diacu dalam Molyneux (2004) menyatakan bahwa suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat apabila nilai IC50 kurang dari 50 ppm, kuat apabila nilai IC50 antara 50-100 ppm, sedang apabila nilai IC50 berkisar antara 100-150 ppm, dan lemah apabila nilai IC50 berkisar antara 150-210 ppm. Pengujian aktivitas antioksidan dari masing-masing ekstrak kasar tambelo memiliki kekuatan penghambatan yang berbeda-berbeda antara yang satu dengan yang lainnya dan menghasilkan hubungan antara kosentrasi ekstrak kasar yang digunakan dengan persen inhibisinya. Hanani et al. (2005) menyatakan bahwa presentase penghambatan (% inhibisi) terhadap aktivitas radikal bebas akan ikut meningkat seiring dengan meningkatnya kosentrasi, baik pada kosentrasi ekstrak maupun pada kosentrasi standar (BHT dan vitamin super ester C). Perhitungan persen inhibisi IC50 dan grafik regresi linear pada BHT, vitamin super ester C dan ekstrak kasar tambelo dapat disajikan pada Lampiran 8. 4.2.4 Fraksi ekstrak terpilih Fraksinasi terhadap ekstrak kasar tambelo dilakukan pada ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi, yaitu etil asetat. Sebelum dilakukan fraksinasi terhadap ekstrak kasar etil asetat, dilakukan pencarian eluen terlebih dahulu dengan menggunakan KLT. Eluen ini berfungsi sebagai fase gerak saat fraksinasi. Eluen yang digunakan adalah n-heksana, kloroform, etil asetat, metanol, dan etanol. Eluen dengan pemisahan terbaik kemudian dikombinasikan satu dengan yang lainnya dengan berbagai perbandingan, dilakukan dengan mencoba beberapa kombinasi untuk mengembangkan spot ekstrak terpilih pada kromatografi lapis tipis (KLT). Kombinasi yang digunakan adalah yang terdiri dari pelarut kloroform : metanol (9:1), n-heksana : etil asetat (1:1), 57 kloroform : metanol (17:3), dan n-heksana : etil asetat (8:2). Profil pola pemisahan senyawa dengan eluen tersebut disajikan pada Lampiran 9a. Berdasarkan analisis dengan menggunakan KLT, diperoleh eluen terbaik yang terdiri dari campuran kloroform : metanol (9 : 1). Profil pemisahan senyawa dengan eluen kloroform : metanol (9 : 1) disajikan pada Gambar 12. Menurut Markam (1988), penggunaan kloroform : metanol sebagai eluen pada perbandingan 15 : 1 sampai 3 : 1 dapat memisahkan senyawa flavonoid dengan baik. Berdasarkan hasil fraksinasi tersebut (Gambar 12), diduga terdapat sembilan jenis senyawa pada ekstrak etil asetat tambelo. Hasil pengecekan terhadap fraksi tersebut, diduga bahwa masing-masing fraksi telah menunjukkan adanya 1 spot dengan Rf yang berbeda. Berdasarkan hasil fraksinasi kolom, diperoleh 10 fraksinasi gabungan yang disajikan pada Lampiran 9b. Rendamen fraksi terbesar terdapat pada fraksi 1 (0,15748%) dan rendamen terkecil pada fraksi 6 (0,00156%). Data rendamen hasil kolom disajikan pada Lampiran 10. Kesepuluh fraksi tersebut kemudian dilakukan uji aktivitas antioksidan dan uji fitokimia. Rf9 = 8,2/8,5 = 0,97 Rf8 = 7,1/8,5 = 0,84 Rf7 = 7/8,5 = 0,82 Rf6 = 6,3/8,5 = 0,74 Rf5 = 5,5/8,5 = 0,65 Rf4 = 4,1/8,5 = 0,48 Rf3 = 3,4/8,5 = 0,4 Rf2 = 2,1/8,5 = 0,25 Rf1 = 0,5/8,5 = 0,06 Gambar 12 Profil pemisahan senyawa dengan eluen kloroform : metanol (9 : 1) 4.2.5 Kandungan fitokimia fraksi tambelo Berdasarkan hasil fraksinasi kolom, diperoleh 10 fraksinasi gabungan yang kemudian dilakukan pengujian fitokimia. Berdasarkan analisis fitokimia yang dilakukan, diketahui bahwa pada fraksi 9 dan fraksi 10 mengandung senyawa triterpenoid, flavonoid, steroid, alkaloid dan fenol hidrokuinon. Hal ini menunjukkan bahwa dalam fraksi tersebut mengandung senyawa yang 58 memungkinkan dapat menghambat radikal bebas. Kandungan fitokimia fraksi tambelo disajikan pada Tabel 10. Tabel 10 Kandungan fitokimia fraksi tambelo Kelompok Senyawa Nama Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi 4 Fraksi 5 Fraksi 6 Fraksi 7 Fraksi 8 Fraksi 9 Fraksi 10 Alkaloid Flavonoid + + Phenol Hidroquinon - + + + Steroid Triterpenoid Saponin Tanin + + - - + + + + - + + + + - - + + - + + + - + + - + + - - + + + + + + - + + - + + + - + + + + + + - + + + + + + - + + + + + + - 4.2.6 Aktivitas antioksidan fraksi tambelo Aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi-faraksi tambelo disajikan pada Gambar 13. Berdasarkan hasil pengujian, diketahui bahwa aktivitas antioksidan fraksi kesembilan mempunyai aktivitas antioksidan yang sangat kuat, terbukti terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning cerah dengan nilai IC50 8,87 ppm, disusul dengan fraksi 10 dengan nilai IC50 28,91 ppm. Perhitungan persen inhibisi dari hasil fraksinasi dapat lihat pada Lampiran 12. Gambar 14 memperlihatkan bahwa fraksi 9 memiliki daya inhibisi yang setara dengan vitamin super ester C. Hal ini memungkinkan adanya senyawa aktif dalam faksi 9 yang berpotensi sebagai obat antioksidan. Aktivitas antioksidan pada fraksi tambelo lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak tambelo. Hal ini berkaitan dengan fungsi proses fraksinasi yang bertujuan untuk memperoleh pola pemisahan yang sempurna, fraksi yang didapat lebih murni senyawa aktif dan lebih banyak terisolasi. 59 103,51 4,63 Rata-rata IC50 120 100 80 60 40 20 5,21 76,87 74,49 63,50 61,64 5,94 86,04 3,40 58,32 2,43 2,68 4,29 43,17 2,06 8,87 1,90 15 28,91 4,69 0 Ekstrak Fraksi Fraksi Fraksi Fraksi Fraksi Fraksi Fraksi Fraksi Fraksi Fraksi etil 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 asetat Estrak kasar dan Hasil Fraksi Gambar 14 Aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi-faraksi tambelo Sebuah senyawa dapat disebut sebagai antioksidan bila senyawa tersebut dapat mendonorkan atom hidrogennya dengan cepat sehingga dapat menghambat terjadinya pembentukan radikal bebas (Sauriasari 2006). Pengujian dengan menggunakan DPPH merupakan salah satu metode yang sederhana. Senyawa DPPH merupakan radikal bebas yang bersifat stabil sehingga dapat bereaksi dengan atom hidrogen yang berasal dari suatu senyawa antioksidan. Hasil reaksi tersebut berupa DPPH tereduksi (yang tidak reaktif lagi karena telah mendapatkan donor hidrogen (Molyneux 2004). Ketika DPPH menerima elektron atau radikal hidrogen, maka akan terbentuk molekul diamagnetik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen, akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH. Jika semua elektron pada radikal bebas DPPH menjadi berpasangan. Mekanisme penghambatan radikal DPPH dapat dilihat pada Gambar 15. Gambar 15 Mekanisme penghambatan radikal DPPH’ Keterangan: RH = asam lemak tidak jenuh R = radikal bebas 60 4.2.7 Identifikasi senyawa fraksi teraktif Liquid chromatography mass spectrofotometer (LC-MS) merupakan metode analisis kuantitatif yang merupakan kombinasi antara kromatografi cair dengan spektroskopi massa, Instrumentasi LC-MS terdiri atas inlet-LC, sumber ion, tekanan permukaan, massa analyzer, detektor, instrumen kontrol dan proses data.Analisis senyawa menggunakan LC-MS dilakukan pada fraksi terbaik (fraksi 9). Analisi LC/MS yang dilakukan secara electrospray ionisation. Berdasarkan analisis LC-MS sampel fraksi 9 dengan berat molekul 352. Data spektrum sampel fraksi 9 dapat dilihat pada Lampiran 11. Berdasarkan database MarinLit (Blunt and Blunt 2008), terdapat empat struktur senyawa yang terbagi atas tiga komponen, yaitu farnesic acid glyceride, sesquiterpenoic acid glyceride, dan labdane diterpenoid. Ketiga komponen tersebut tergolong dalam kelompok senyawa terpenoid. Struktur senyawa tersebut disajikan pada Gambar 16. (a) (b) Komponen 1 Farnesic acid glyceride (c) Komponen 2 sesquiterpenoic acid glyceride (d) Komponen 3 Labdane diterpenoid Gambar 16 Komponen fraksi teraktif dari tambelo dengan massa 352 m/z yang terdeteksi sebagai kelompok senyawa terpenoid. 61 Terpenoid adalah senyawa alam yang terbentuk dengan proses biosintetis, terdistribusi luas dalam dunia tumbuhan dan hewan. Terpenoid yang disebut juga isoprenoid, yang dapat dikelompokkan menjadi monoterpen (C10), seskuiterpen (C15), diterpen (C20), triterpen (C30), tetraterpen (40), dan politerpen (≥ 40) (Sirait 2007). Berdasarkan pengelompokan dari senyawa terpenoid tersebut, komponen 1 farnesic acid glyceride dan komponen 2 sesquiterpenoic acid glyceride termasuk di dalam kelompok senyawa seskuiterpenoid. Seskuiterpenoid merupakan senyawa terpenoid yang dibangun oleh 3 unit isoprena yang terdiri dari kerangka asiklik dan bisiklik dengan kerangka dasar naftalen. Secara umum senyawa seskuiterpenoid ini mempunyai bioaktifitas yang cukup besar, di antaranya adalah sebagai antifeedant, hormon, antimikroba, antibiotik dan toksin serta regulator pertumbuhan tanaman dan pemanis. Senyawa-senyawa seskuiterpenoid tersebut diturunkan dari cis farnesil pirofosfat dan trans farnesil pirofosfat melalui reaksi siklisasi dan reaksi sekunder lainnya. Beberapa publikasi tentang ketiga komponen seperti yang dilaporkan oleh Gustafson et al. (1983) bahwa di dalam ekstrak nudibranch Archidoris montereyensis mengandung senyawa-senyawa diterpenoic acid glyceride, drimane sesquiterpenoic acid glyceride, monocyclofarnesic acid glyceride, dan glyceryl ether. Andersen et al. (1980) juga melaporkan bahwa nudibranch jenis A. odheri menghasilkan senyawa 2,3-dihydroxypropilfarnesate dan memiliki dua turunan monoasetoksi. Kedua komponen tersebut memiliki aktivitas sebagai antibiotik dan antifeedant. Pendapat ini juga didukung oleh Marero et al. (2003) yang melaporkan bahwa hasil isolasi dari pulmonate Trimusculus peruvianus menghasilkan empat senyawa labdane diterpens melalui jalur oksidasi. Senyawasenyawa tersebut memiliki aktivitas sitotoksik yang menghambat sel kanker usus besar pada manusia. Labdane merupakan diterpen bisiklik alami yang membentuk inti struktural untuk berbagai macam produk alami yang dikenal sebagai labdanes atau diterpenes labdane. Diterpenoid merupakan senyawa yang mempunyai 20 atom karbon dan dibangun oleh 4 unit isoprena. Senyawa ini mempunyai bioaktivitas yang cukup luas yaitu sebagai hormon pertumbuhan tanaman, podolakton inhibitor pertumbuhan tanaman, antifeedant serangga, inhibitor tumor, 62 senyawa pemanis, antifouling, dan anti karsinogen. Senyawa diterpenoid dapat berbentuk asiklik, bisiklik, trisiklik, dan tetrasiklik. Tata nama yang digunakan lebih banyak adalah nama trivial (Sirait 2007). Berdasarkan hasil analisis LC-MS, senyawa flavonoid, tidak terdeteksi, hal ini diduga bahwa senyawa flavonoid yang terkandung di dalam ekstrak tambelo termasuk dalam kelompok senyawa volatil sehingga ada kemungkinan bahwa senyawa flavonoid yang berperan sebagai senyawa antioksidan di dalam ekstrak tambelo adalah kelompok senyawa volatil. 63 5 SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan Hasil penelitian menunjukkan bahwa kandungan kimia tambelo segar terdiri dari air 82,72%, protein 7,21%, lemak 0,28%, abu 2,07%, dan karbohidrat 7,71%. Komposisi kimia tambelo kering adalah kadar air 6,63%, protein 42,77%, lemak 14,27%, abu 5,88%, dan karbohidrat 30,45%. Daging tambelo mengandung 17 jenis asam amino dan 15 jenis asam lemak. Rendemen tertinggi terdapat pada ekstrak metanol yaitu 5,72%. Pada ke tiga ekstrak (n-heksana, etil asetat, metanol) mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid dan saponin. Ekstrak kasar etil asetat memiliki aktivitas antioksidan dengan IC 50 sebesar 15 ppm. Fraksi 9 dari ekstrak etil asetat menunjukkan aktivitas antioksidan sebesar 8,87 ppm yang setara dengan vitamin super ester C (8,27ppm). Fraksi 9 menyerupai salah satu dari empat struktur senyawa yang dikelompokkan ke dalam tiga komponen, yaitu farnesic acid glyceride, sesquiterpenoic acid glyceride dan labdane diterpenoid. 5.2 Saran Perlu dilakukan pemurnian lagi dengan menggunakan kromatografi kolom dan untuk memperoleh satu struktur senyawa aktif digunakan nuclear magnetik resonance (NMR). DAFTAR PUSTAKA Achadi EL. 2010. Gizi dan kesehatan Masyarakat. Jakarta: PT. Rajagrafindo Persada. Hlm. 20-319 Almatsier S. 2002. Pelayanan gizi rumah sakit dan perkembangan ilmu serta teknologi. Gizi Indonesia, 17:97-104. Almatsier S. 2006. Prinsip dasar ilmu Gizi. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. hlm. 14-104. _________. 2009. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. hlm. 50-279. American Association of Cereal Chemist [AACC]. 1994. Approved Methods of The American Association of Cereal Chemist. Ed ke-9. Vol 1. USA :American Association of Cereal Chemist. Andersen RJ, Sum FW. 1980. Farnesic acid glycerides from the nudibranch Archidoris odhneri. J. Tetrahedron Lett, 21:797-800. Association of Official Analytical Chemist [AOAC]. 1984. Official Methods of Analysis of Association of official Analytical Chemical. Associaton of Official Analytic Chemist Inc. Virginia. ____________. 2005. Official Methods of Analysis (18 Edn). Association of Official Analytical Chemist Inc. Mayland. USA. ____________. 2005. Official Methods of Analysis (18 Edn). Association of Official Analytical Chemist Inc. Mayland. USA. Betia J. Ed. 2011. Palawan’s Kinilaw na Tamilok. [kaset audio]. Journeyingjames, produsen. Palawan. 1 video kaset: 2:50 menit, bersuara, berwarna. Dilengkapi: 4 gambar foto berwarna 10 x 12 inci. http://journeyingjames.com/2011/01/palawans-kinilaw-na-tamilok/. [02 Sept 2011]. Bhakuni DS, Awat DS. 2005. Bioactive marine natural Product. New Delhi: Anamaya Publisher. hlm. 302-308 Blunt JW, Blunt DA. 2008. MarinLit-Marine Literature Database. Version # vpcl 13.5. Christchurch: Marine Chemistry Group, Department of Chemistry-University of Caterbury. Bonderud D. 2011. Amino acid: What is Valine. http://www.wisegeek.com [08 Maret 2011]. 65 Carroli C, Arata D, Dena CC. 2006. Effect of threonine deficiency on changes in enzyme activity and liver fat deposition with time. J.Nutrition 1:502-506. Cat B. 2006. Amino acid protein suplemen. Dietary Amino Acids Benefits. www. [email protected] [06 Maret 2011]. Coppen PP. 1983. The use of antioxidants. Di dalam: Allen JC, Hamilton RJ. Editor. Rancidity in Foods. New York: Science Publishers. hlm. 67-90. Conectique. Selenium untuk kekebalan tubuh. Reduce-it weight management program Diet and Nutrition (2011). http://www/conectique.co/tipsoz_solution/diet_utrition/nutrition/article.php?article_id=3160. [29 Sept 2011]. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Material Medika Indonesia. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. [DSN], Dewan Standarisasi Nasional. 1991. Metode Pengujian Kimia Produk Perikanan. Penentuan Logam Berat. SNI 01-2362-1991. Jakarta: Departemen Perindustrian RI. Ebada SS, Edrada RA, Lin W, Proksch P. 2008. Protocols: methods for isolation, purification and structural elucidation of bioactive secondary metabolites from marine invertebrataes. Nature 3-12. Edrada RA, Wray V, Handayani D, Schupp P, Balbin-Oliveros M, Proksch P. 2000. Structure activity relationship of bioactive metabolites from some Indo-Pasific marine invertebrates. Nat. Prod. Chem., 21: 251- 254. Effendi YH. 2002. Pengantar gizi kesehatan. Diktat. Bogor: Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. FAO/WHO. 2001. Human Vitamin and Mineral Requirement. Report of a joint FAO/WHO xpert consultation. Bangkok, Thailand. Roma: Food and Nutrition Division. Filho CS, Tagliaro CH, Beasley CR. 2008. Seasonal abundance of the shipworm Neoteredo reynei (Bivalvia, Teredinidae) in mangrove driftwood from a northern Brazilian beach. Iheringia, Sér. Zool. Porto Alegre, 98:17-23. Griffin et al. Penemu: The United States of America as represented by the Secretary of Agriculture. 17 Mei 1994. Industrial alkaline protease from shipworm bacterium. US Paten. Paten 5 512 749. Gritter JR, Bobbitt JM, Arthur, E Schwarting. 1991. Pengantar Kromatografi. Ed ke-2. Padmawinata K, penerjemah. Bandung: ITB press. hlm. 27-36. 66 Gustafson K, Andersen RJ 1985. Chemical studies of British Colombia Nudibranchs. J. Tetrahedron, 41:1101-1108. Hamilton RJ. 1983. The chemistry of ranciditry in food. Di dalam: Allen JC. Hamilton RJ, editor. Rancidity in Food. New York: Applied Science Publisher. hlm 1-20. Hamman MT, Otto CS, Scheuer PJ, Dunbar DC. 1996. Kahalalides : bioactive peptides from marine mollusk Elysia rufescens and its algal diet Bryopsis sp. J. Org. Chem, 61: 6594. Hanani E, Mun’im A, Sekarini R. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam spons Callyspongia sp. dari Kepulauan Seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian, 2:127-133. Handayani D, Sayuti N, Dachriyanus. 2008. Isolasi dan karakteristik senyawa antibakteri epidioksi sterol dari spon laut Petroia Nigrans, Asal Sumatera Barat. Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknologi-II 2008; Lampung, 17-18 November 2008. http://lemlit.unila.ac.id/file/arsip [12 April 2009]. Hardinsyah, Sumule A, Letsoin J. 2006. Jenis dan jumlah konsumsi tambelo, siput dan kerang oleh penduduk di kawasan Muara Mimika, Papua. J. Gizi dan Pangan 1:1-12. Harper LJ, Deaton BJ, Driskel JA. 1988. Pangan Gizi dan Pertanian. Suhardjo, penerjemah. Jakarta: Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Terjemahan dari: Food Nutrition and Agriculture. hlm. 30-69. Hatano TH, Kagawa H, Yasuhara TT, Okuda. 1988. Two new flavonoids and other constituents in licorice roots: their relative astringency and radical scavenging effect. Chem. Pharm. Bull, 36:3090-2097. Heath, HB, Reineccius, G. 1986. Flavor Chemistry and Technology. New York: Van Nostrand Reinhold Comp. Publ. Harbone JB. 1987. Metode Fitokimia; Penuntun Cara Modern Menaganalisis Tumbuhan. Ed. Ke-2. Padmawinata K, Soediro S, penerjemah. Bandung: ITB. Terjemahan dari Phytochemical method. Ketaren S. 1986. Lemak dan Minyak Pangan. Jakarta: UI Press. Kumar US, Tiwari AK, Reddy SV, Apama P, Rao RJ, Ali AZ, Rao JM. 2006. Free radical scavanging and xanthine oksidase inhibitory constituens from Stereospermum personatun. J Nat Prod 68:1611-1621. * Khopkar SM. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press. 67 Linder MC. 1992. Biokimia nutrisi dan metabolisme. Cetakan I. Parakkasi A, penerjemah; Linder MC, editor. Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Nutritional biochemistry and metabolism. Linder CM. 2006. Biokimia nutrisi dan metabolisme dengan pemakaian secara klinis. Parakkasi A, penerjemah; Linder MC, editor. Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Nutritional biochemistry and metabolism. Mayabubun 2003. Persepsi Masyarakat Suku Kamoro terhadap tambelo Bactronophorus thoracites di Kabupaten Mimika [skripsi]. Jayapura: Fakultas Keguruan dan ilmu Pendidikan, Universitas Cenderawasih Jayapura. Miyaoka H, Shimomura M, Kimura H, Yamada Y. 1998. Antimalarial activity of kalihinol a and realtive diterpenoids from the okinawan sponge, Acanthrlla sp. J. Tetrahedron 13467-13474 Molyneux P. 2004. The use of the stable free radicals diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol 2004, 26:211-219. Morrero D et al. 2003. Labdane diterpenoid with a new oxidation pattern from the marine pulmonate Trimusculus peruvianus. Tetrahedron, 59:48-55 Muchtadi D. 1989. Evaluasi Nilai Gizi Pangan. Bogor: IPB Press. 14-55 hlm. Muchtadi TRM. 2000. Asam Lemak Omega 9 dan Manfaatnya bagi Kesehatan. http://www.intiboga.com/omega9b.htm. [12 April 2009] Muchtadi D. 2009. Gizi Anti Penuaan Dini. Bandung: CV. Alfabet. hlm 45-67. Muchtadi D. 2009. Pengantar Ilmu Gizi. Bandung: CV. Alfabeta. hlm.20-56. Muller K. 2004. Ekologi Kamoro-Bab IX. PapuaWeb. Galeri-Galery. http://www.papuaweb.org/gb/foto/muller/ecology/09/index.html [16 Juli 2009]. Munifah I, Krisnawang H. 2007. Isolation and antioxidative assay of several marine macroalgae components within ethyl-acetate fraction. http://www.scribd.com/doc/isolation-seminternationalUGM/2558795 [ 02 Maret 2011]. Nair NB, Saraswathy M. 1971. The biology of wood-boring teredinid mollusca. Di dalam: Russell FS, Yonge M. Editor. Advance in marne biology. Vol ke-9. New York: Academic Press Inc. hlm. 335-344. 68 Nelson JK, Moxness KE, Jensen MD, Gastineau CF. 1994. Mayor clinic diet manual : A Handbook of Nutrition Practices. Ed ke-7. Philadelphia : Mosby. hlm. 67-78 Nurjanah, Imran Z, Kustiariyah. 2005. Kandungan mineral dan proksimat kerang darah (Anadara granosa) yang diambil dari Kabupaten Boalemo, Gorontalo. Buletin THP, 8(2):12-25. Poedjiadi A, Supriyanti FMT. 2006. Dasar-dasar biokimia. Edisi revisi. Jakarta: UI Press. 8-389 hlm Pratt DE. 1992. Natural antioxidant from plant material. Di dalam: Huang MT, Ho CT, Lee CY, editor. Phenolic Compound in Food and Their Effect on Health. Washington DC: American Society. Pratt DE, Hudson BJF. 1990. Natural antioxidant not exploited comercially. Di dalam: Hudson BJF, editor. Food Antioxidant. London: Elsevier Applied Science. hlm. 230-429. Purchon RD. 1968. The Biology of The Mollusca. Pergamon Press. Hungary.Supamas. 2011. Asam amino non esensial. Jakarta: Surya Pagoda Mas http://www.supamas.com [07 Maret 2011]. Ranney MW. 1979. Antioxidant Recent Development. Noyes Data Co. Park Ridge, USA. hlm. 87-121. Ridwan E. 1997. Tempe mampu menghambat proses ketuaan. Cermin Dunia Kedokteran, 120(1):7-13. Robinson T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Kosasih Padmawinata, penerjemah. Bandung: ITB. Terjemahan dari: The organic constiuteuns of higher plants. Edisi ke-6. Salamah E, Ayuningrat E, Purwaningsih S. 2008. Penapisan awal komponen bioaktif dari kijing Taiwan (Anadonta woodiana Lea) sebagai senyawa antioksidan. Buletin TeknologiHasil Perikanan, 11:119-132. Schuler P. 1990. Natural antioxidant exploited commercially. Di dalam: Food Antioxidant. Hudson BJF, editor. London and New York: Elsevier Applied Science. hlm. 123-280. Setyowati, Suparni. 2009. Unit Corn Mill. www.chem-is-try.org. [7 Mei 2011] Sidik. 1997. Antioksidan Alami Asal Tumbuhan. Makalah dalam Seminar Nasional Tumbuhan Obat Indonesia XII. Institut Teknologi Bandung 26-27 Juni 1997. Sirait M. 2007. Penuntun fitokimia dalam farmasi. Bandung: ITB. 191-246 hlm 69 Sitompul S. 2004. Analisis asam amino dalam tepung ikan dan bungkil kedelai. Buletin Teknik Pertanian, 9(1): 33-37. Suariasari R. 2006. Mengenal dan menangkal http://www.beritaiptek.com [ 8 Juni 2011] radikal bebas. Sudarmadji S, Haryono B, Suhardi. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta: Liberty. hlm. 57-158. Suharsono. 1970. Biokimia. Jakarta: Erlangga. hlm. 12-34. Supamas. 2011. Asam amino non esensial. Jakarta: Surya Pagoda Mas http://www.supamas.com [07 Maret 2011]. Suratmo. 2009. Potensi ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai antioksidan. http://fisika.brawijaya.ac.id/bssub/PDF%20FILES/BSS_ 205_I.pdf. [3 februari 2011] Syaputra D, Ibrahim B, Poernomo D. 2007. Produk Fermentasi Ikan Dari Cacing Kapal Bactronophorus sp. Segar. Jurnal Sumberdaya Perairan, 1:12-14. Trindade-Silva E, Machado-Ferreira E, Senra MVX, Vizzon VF, Yparraguirre LA, Leoncini O and Amaro CSAG. 2009. Physiological traits of the symbiotic bacterium Teredinibacter turnerae isolated from the mangrove shipworm Neoteredo reynei. Genetics and Molecular Biology Online Ahead of Print. Sociedade Brasileira de Genética. Printed in Brazil. Genet. Mol. Biol. Waranmaselembun C. 2007. Komposisi kimia dan aktivitas inhibitor topoimerase I dari kerang mas ngur (Attactodea striata), [Tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Waterbury JB, Calloway CB, Turner RD. 1983. A cellulolytic nitrogen fixing bacterium cultured from the gland of deshayes in shipworms. Science, 221:1401-1403. Winarno FG. 1984. hlm. 92-128 Kimia Pangan. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. __________. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama. hlm.145-167. __________.1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. hlm. 3-14 __________. 2008. Kimia Pangan dan Gizi. Bogor: M-Brio Press. hlm.14-55. 70 Winarsi H. 2004. Efek Minuman Fungsional yang Disuplementasi Isoflavon Kedelai dan Zn terhadap Profil Lipiddan Produk MDA Plasma Wanita Premenopause. Dalam: Peran Biokimia dan Biologi Molekuler dalam Eksplorasi dan Pemanfaatan Sumberdaya Hayati Berkelanjutan. Prosiding Seminar Nasional PBBMI. Yogyakarta . Winarsi H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Jakarta: Kanisius. hlm. 86-105. Yen GC, Chen HY. 1995. Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity. J. of Agricultural and Food Chemistry, 43:27-32 71 72 LAMPIRAN 73 74 Lampiran 1. Nilai rata-rata hasil analisis proksimat tambelo segar dan kering a. Kandungan proksimat tambelo segar Nutrisi Kadar air Protein Lemak Abu Karbohidrat Tambelo I 82,71 7,43 0,31 2,27 7,28 II 82,72 6.99 0,26 1,88 8,15 Rata-rata Standar deviasi 82,72 7,21 0,28 2,07 7,72 0,01 0,31 0,04 0,28 0,62 b. Kandungan proksimat tambelo kering Nutrisi Kadar air Protein Lemak Abu Karbohidrat Tambelo I 6,62 44,20 14,11 6,62 28,45 II 6,63 41,35 14,42 5,15 32,45 Rata-rata Standar deviasi 6,63 42,77 14,27 5,88 30,45 0,01 2,02 0,22 1,04 2,83 Lampiran 2. Nilai rata-rata asam amino tambelo No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Jenis asam amino Treonin Valin Metionin Isoleusin Leusin Phenilalanin Lisin Histidin Arginin Asam aspartat Asam glutamate Serin Glisin Alanin Prolin Tirosin Sistein TOTAL Hasil (% berat Protein) I II 0,387 0,360 1,293 1,287 0.596 0,518 0,337 0,349 1,251 1,243 1,195 1,179 1,821 1,795 1,005 1,016 1,839 1,761 2,854 2,841 3,663 3,432 1,285 1,236 1,662 1,820 1,651 1,618 0,418 0,403 0,719 0,729 0,423 0,402 22,399 21,989 Rata-rata Standar deviasi 0,37 1,29 0,56 0,34 1,25 1,19 1,81 1,01 1,80 2,85 3,55 1,26 1,74 1,63 0,41 0,72 0,41 0,019 0,004 0,055 0,008 0,006 0,011 0,018 0,008 0,055 0,009 0,163 0,035 0,112 0,023 0,011 0,007 0,015 22,19 0,290 75 Lampiran 3 Kromatografi standar asam amino pada HPLC 76 Lampiran 4 kromatogram asam amino daging tambelo pada HPLC a. Kromatografi asam amino ulangan I 77 b. Kromatografi asam amino ulangan II 78 Lampiran 5 Kromatogram standar asam lemak pada GC 79 Lampiran 6 Kromatogram asam lemak daging tambelo pada GC 80 Lampiran 7 Perubahan warna yang mengindikasikan reaksi peredaman DPPH 81 Dari ekstrak tambelo 4 Blanko 6 10 8 BHT + DPPH (4,6,8,10 ppm) 20 40 60 4 40 80 60 8 10 Vitamin super ester C + DDPH (4,6,8, 10 ppm) 20 Ekstrak n-Heksan + DPPH (20,40,60,80 ppm) 20 6 80 Ekstrak Etil Asetat + DPPH (20,40,60,80 ppm) 40 80 60 Ekstrak Metanol + DPPH (20,40,60,80 ppm) 20 40 60 80 Fraksi 9 Etil Asetat + DPPH (20,40,60,80 ppm) Lampiran 8 Perhitungan persen inhibisi dan IC50 pada BHT, vitamin super ester 82 C dan ekstrak kasar tambelo a. Persen inhibisi dan IC50 pada BHT dan vitamin super ester C 4 ppm % Inhibisi 6 ppm 8 ppm BHT 55,56 65,51 Vitamin super ester C 15,74 27,78 Sampel 10 ppm IC50 (ppm) 81,02 94,44 3,35 51,16 63,19 8,27 10 12 100,0 y = 6,608x + 27,87 R² = 0,993 90,0 80,0 % Inhibisi 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 0 2 4 6 8 Kosentrasi BHT (ppm) 70 y = 8,287x - 18,54 R² = 0,981 60 Axis Title 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 Kosentrasi vitamin super ester C (ppm) b. Persen inhibisi dan IC50 pada ekstrak n-heksana 12 83 2 3 Absorb 432 0,449 0,421 0,419 0,376 0,462 0,423 0,412 0,401 0,454 0,434 0,407 0,405 20 40 60 80 20 40 60 80 20 40 60 80 % inhibisi 0 -3,94 2,55 3,01 12,96 -6,94 2,08 4,63 7,18 -5,09 -0,46 5,79 6,25 14 Pers.regresi linear IC50 y=0,255x – 9,143 231,93 y=0,224x – 9,490 265,58 y=0,201x – 8,449 290,79 Rata-rata IC50 Standar deviasi 262,77 29,531 y = 0,255x - 9,143 R² = 0,896 12 10 8 % inhibisi Blanko 1 Kosent 6 4 2 0 -2 0 20 40 60 80 100 80 100 -4 -6 Kosentrasi (ppm) ulangan 1 10 y = 0,224x - 9,490 R² = 0,888 8 6 4 % Inhibisi Ulangan 2 0 -2 0 20 40 60 -4 -6 -8 Kosentrasi (ppm) ulangan 2 % inhibisi 84 y = 0,201x - 8,449 R² = 0,919 10 8 6 4 2 0 -2 0 -4 -6 20 40 60 80 100 Kosentrasi (ppm) ulangan 3 c. Persen inhibisi dan IC50 pada ekstrak etil asetat Ulangan Kosent Blanko 2 3 % inhibisi 1 20 40 60 80 20 40 60 80 20 40 60 80 % inhibisi Absorb 0,432 0,205 0,119 0,089 0,041 0,231 0,142 0,084 52,55 72,45 79,40 90,51 46,53 67,13 80,56 0,066 84,72 0,225 0,123 0,062 0,055 47,92 71,53 85,65 87,27 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Pers. Regresi linear IC50 (ppm y=0,604x + 43,51 10,75 y=0,64x + 37,73 19,17 y=0,660x + 40,04 15,09 y = 0,604x + 43,51 R² = 0,955 0 20 40 60 80 Kosentrasi (ppm) ulangan 1 100 Rataan IC50 (ppm Standar deviasi 15,00 4,211 85 y = 0,64x + 37,73 R² = 0,923 100 90 80 % inhibisi 70 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 % Inhibisi Kosentrasi (ppm) ulangan 2 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 y = 0,660x + 40,04 R² = 0,878 0 20 40 60 80 100 Kosentrasi (ppm) ulangan 3 d. Persen inhibisi dan IC50 pada ekstrak metanol Ulangan Kosent Absorb % inhib 20 40 60 80 20 40 60 80 20 40 60 80 0,432 0,371 0,347 0,303 0,201 0,391 0,337 0,305 0,203 0,392 0,372 0,312 0,223 14,12 19,68 29,86 53,47 9,49 21,99 29,40 53,01 9,30 13,89 27,78 48,38 Blanko 1 2 3 Pers. Regresi linear IC50 (ppm y=0,641x + 2,777 82,34 y=0,689x – 6,018 81,30 y=0,656x – 7,986 88,39 Rataan IC50 (ppm Standar deviasi 84,01 3,829 86 60 y = 0,641x - 2,777 R² = 0,905 % Inhibisi 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 Kosentrasi (ppm) 60 % Inhibisi 50 y = 0,689x - 6,018 R² = 0,946 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 Kosentrasi (ppm) 60 y = 0,656x - 7,986 R² = 0,930 % Inhibisi 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 Kosentrasi (ppm) 80 100 87 e. Nilai deviasi ekstrak kasar tambelo Ekstrak n-Heksana Etil asetat Metanol Ulangan I II III 231,93 265,58 290,79 10,75 19,17 15,09 82,34 81,30 88,39 Ratarata 788,3 45,01 252,03 Standart devisiasi 29,53 4,21 3,83 Lampiran 9 Profil pola pemisahan senyawa a. Profil pola pemisahan ekstrak etil esetat tambelo pada berbagai eluen 1 2 3 Keterangan : Ekstrak Etil asetat 1. n-Heksana : Etil asetat 2. n-Heksana : Etil asetat 3. Kloroform : Metanol 4. Kloroform : Metanol 5. N-Heksana : Kloroform 4 = = = = = 1:1 8:2 9:1 17:3 3:2 5 88 b. Profil Spesifikasi dan pola pemisahan hasil kromatografi Lampiran 10 Rendamen fraksi tambelo No Nama Fraksi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi 4 Fraksi 5 Fraksi 6 Fraksi 7 Fraksi 8 Fraksi 9 Fraksi 10 Rendamen (%) 0,15748 0,03492 0,00732 0,00506 0,00710 0,00156 0,0028 0,0152 0,00482 0,0025 Lampiran 11 Perhitungan persen inhibisi (IC50) hasil fraksinasi tambelo a. Nilai standart deviasi hasil fraksinasi Fraksi Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi 4 Fraksi 5 Fraksi 6 Fraksi 7 Fraksi 8 Fraksi 9 Fraksi 10 I 108,76 60,78 58,37 73,41 91,36 70,83 62,85 44,97 8,77 24,37 Ulangan II 100,03 64,27 62,86 73,47 80,95 75,07 57,80 43,61 7,03 33,13 III 101,74 65,46 63,14 83,72 85,82 77,56 54,32 40,92 10,82 25,85 Rata-rata 103,51 63,50 61,46 76,87 86,04 74,49 174,97 129,5 26,62 83,35 Standart deviasi 4,63 2,43 2,68 5,94 5,21 3,40 4,29 2,06 1,90 4,69 89 b. Perhitungan persen inhibisi dan IC50 pada fraksi 9 dan fraksi 10 Sampel Ulangan Abs % Inhibisi 0,425 0 20 0,193 54,59 40 0,149 64,94 60 0,086 79,76 80 0,073 82.82 20 0,179 57,88 40 0,148 65,18 Kosentrasi Blanko 1 Fraksi 9 2 3 1 Fraksi 10 2 3 60 0,082 80,71 80 0,049 88,47 20 0,187 56 40 0,136 68 60 0,086 79,76 80 0,028 93,41 20 0,255 40,00 40 0,127 70,12 60 0.108 74,59 80 0,078 81,65 20 0,277 34,82 40 0,164 61,41 60 0,112 73,65 80 0,099 76,71 20 0.246 42.12 40 0.155 63.53 60 0.102 76.00 80 0.079 81.41 Pers. regresi linear IC50 (ppm) y=0,497x + 45,64 8,77 y=0,536x + 46,23 7,03 y=0,62x + 43,29 10,82 y=0,647x + 34,23 24,37 y=0,689x + 27,17 33,13 y=0,651x + 33,17 25,85 Rataan IC50 (ppm) 8,87 1,90 27,78 4,69 Lampiran 12 Hasil identifikasi senyawa terpenoid tambelo pada LC-MS LAMPIRAN 74 75 Lampiran 1. Nilai rata-rata hasil analisis proksimat tambelo segar dan kering a. Kandungan proksimat tambelo segar Nutrisi Kadar air Protein Lemak Abu Karbohidrat Tambelo I 82,71 7,43 0,31 2,27 7,28 II 82,72 6.99 0,26 1,88 8,15 Rata-rata Standar deviasi 82,72 7,21 0,28 2,07 7,72 0,01 0,31 0,04 0,28 0,62 b. Kandungan proksimat tambelo kering Nutrisi Kadar air Protein Lemak Abu Karbohidrat Tambelo I 6,62 44,20 14,11 6,62 28,45 II 6,63 41,35 14,42 5,15 32,45 Rata-rata Standar deviasi 6,63 42,77 14,27 5,88 30,45 0,01 2,02 0,22 1,04 2,83 Lampiran 2. Nilai rata-rata asam amino tambelo No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Jenis asam amino Treonin Valin Metionin Isoleusin Leusin Phenilalanin Lisin Histidin Arginin Asam aspartat Asam glutamate Serin Glisin Alanin Prolin Tirosin Sistein TOTAL Hasil (% berat Protein) I II 0,387 0,360 1,293 1,287 0.596 0,518 0,337 0,349 1,251 1,243 1,195 1,179 1,821 1,795 1,005 1,016 1,839 1,761 2,854 2,841 3,663 3,432 1,285 1,236 1,662 1,820 1,651 1,618 0,418 0,403 0,719 0,729 0,423 0,402 22,399 21,989 Rata-rata Standar deviasi 0,37 1,29 0,56 0,34 1,25 1,19 1,81 1,01 1,80 2,85 3,55 1,26 1,74 1,63 0,41 0,72 0,41 0,019 0,004 0,055 0,008 0,006 0,011 0,018 0,008 0,055 0,009 0,163 0,035 0,112 0,023 0,011 0,007 0,015 22,19 0,290 76 Lampiran 3 Kromatografi standar asam amino pada HPLC 77 Lampiran 4 kromatogram asam amino daging tambelo pada HPLC a. Kromatografi asam amino ulangan I 78 b. Kromatografi asam amino ulangan II 79 Lampiran 5 Kromatogram standar asam lemak pada GC 80 Lampiran 6 Kromatogram asam lemak daging tambelo pada GC 81 Lampiran 7 Perubahan warna yang mengindikasikan reaksi peredaman DPPH Dari ekstrak tambelo 4 Blanko 6 10 8 BHT + DPPH (4,6,8,10 ppm) 20 40 60 4 40 80 60 8 10 Vitamin super ester C + DDPH (4,6,8, 10 ppm) 20 Ekstrak n-Heksan + DPPH (20,40,60,80 ppm) 20 6 80 Ekstrak Etil Asetat + DPPH (20,40,60,80 ppm) 40 80 60 Ekstrak Metanol + DPPH (20,40,60,80 ppm) 20 40 60 80 Fraksi 9 Etil Asetat + DPPH (20,40,60,80 ppm) 82 Lampiran 8 Perhitungan persen inhibisi dan IC50 pada BHT, vitamin super ester C dan ekstrak kasar tambelo a. Persen inhibisi dan IC50 pada BHT dan vitamin super ester C 4 ppm % Inhibisi 6 ppm 8 ppm BHT 55,56 65,51 Vitamin super ester C 15,74 27,78 Sampel 10 ppm IC50 (ppm) 81,02 94,44 3,35 51,16 63,19 8,27 10 12 100,0 y = 6,608x + 27,87 R² = 0,993 90,0 80,0 % Inhibisi 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 0 2 4 6 8 Kosentrasi BHT (ppm) 70 y = 8,287x - 18,54 R² = 0,981 60 Axis Title 50 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 Kosentrasi vitamin super ester C (ppm) 10 12 83 b. Persen inhibisi dan IC50 pada ekstrak n-heksana 2 3 Absorb 432 0,449 0,421 0,419 0,376 0,462 0,423 0,412 0,401 0,454 0,434 0,407 0,405 20 40 60 80 20 40 60 80 20 40 60 80 % inhibisi 0 -3,94 2,55 3,01 12,96 -6,94 2,08 4,63 7,18 -5,09 -0,46 5,79 6,25 14 Pers.regresi linear IC50 y=0,255x – 9,143 231,93 y=0,224x – 9,490 265,58 y=0,201x – 8,449 290,79 Rata-rata IC50 Standar deviasi 262,77 29,531 y = 0,255x - 9,143 R² = 0,896 12 10 8 % inhibisi Blanko 1 Kosent 6 4 2 0 -2 0 20 40 60 80 100 80 100 -4 -6 Kosentrasi (ppm) ulangan 1 10 y = 0,224x - 9,490 R² = 0,888 8 6 4 % Inhibisi Ulangan 2 0 -2 0 20 40 60 -4 -6 -8 Kosentrasi (ppm) ulangan 2 % inhibisi 84 y = 0,201x - 8,449 R² = 0,919 10 8 6 4 2 0 -2 0 -4 -6 20 40 60 80 100 Kosentrasi (ppm) ulangan 3 c. Persen inhibisi dan IC50 pada ekstrak etil asetat Ulangan Kosent Blanko 2 3 % inhibisi 1 20 40 60 80 20 40 60 80 20 40 60 80 % inhibisi Absorb 0,432 0,205 0,119 0,089 0,041 0,231 0,142 0,084 52,55 72,45 79,40 90,51 46,53 67,13 80,56 0,066 84,72 0,225 0,123 0,062 0,055 47,92 71,53 85,65 87,27 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Pers. Regresi linear IC50 (ppm y=0,604x + 43,51 10,75 y=0,64x + 37,73 19,17 y=0,660x + 40,04 15,09 y = 0,604x + 43,51 R² = 0,955 0 20 40 60 80 Kosentrasi (ppm) ulangan 1 100 Rataan IC50 (ppm Standar deviasi 15,00 4,211 85 y = 0,64x + 37,73 R² = 0,923 100 90 80 % inhibisi 70 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 % Inhibisi Kosentrasi (ppm) ulangan 2 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 y = 0,660x + 40,04 R² = 0,878 0 20 40 60 80 100 Kosentrasi (ppm) ulangan 3 d. Persen inhibisi dan IC50 pada ekstrak metanol Ulangan Kosent Absorb % inhib 20 40 60 80 20 40 60 80 20 40 60 80 0,432 0,371 0,347 0,303 0,201 0,391 0,337 0,305 0,203 0,392 0,372 0,312 0,223 14,12 19,68 29,86 53,47 9,49 21,99 29,40 53,01 9,30 13,89 27,78 48,38 Blanko 1 2 3 Pers. Regresi linear IC50 (ppm y=0,641x + 2,777 82,34 y=0,689x – 6,018 81,30 y=0,656x – 7,986 88,39 Rataan IC50 (ppm Standar deviasi 84,01 3,829 86 60 y = 0,641x - 2,777 R² = 0,905 % Inhibisi 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 Kosentrasi (ppm) 60 % Inhibisi 50 y = 0,689x - 6,018 R² = 0,946 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 Kosentrasi (ppm) 60 y = 0,656x - 7,986 R² = 0,930 % Inhibisi 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 Kosentrasi (ppm) 80 100 87 e. Nilai deviasi ekstrak kasar tambelo Ekstrak n-Heksana Etil asetat Metanol Ulangan I II III 231,93 265,58 290,79 10,75 19,17 15,09 82,34 81,30 88,39 Ratarata 788,3 45,01 252,03 Standart devisiasi 29,53 4,21 3,83 Lampiran 9 Profil pola pemisahan senyawa a. Profil pola pemisahan ekstrak etil esetat tambelo pada berbagai eluen 1 2 3 Keterangan : Ekstrak Etil asetat 1. n-Heksana : Etil asetat 2. n-Heksana : Etil asetat 3. Kloroform : Metanol 4. Kloroform : Metanol 5. N-Heksana : Kloroform 4 = = = = = 1:1 8:2 9:1 17:3 3:2 5 88 b. Profil Spesifikasi dan pola pemisahan hasil kromatografi Lampiran 10 Rendamen fraksi tambelo No Nama Fraksi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi 4 Fraksi 5 Fraksi 6 Fraksi 7 Fraksi 8 Fraksi 9 Fraksi 10 Rendamen (%) 0,15748 0,03492 0,00732 0,00506 0,00710 0,00156 0,0028 0,0152 0,00482 0,0025 Lampiran 11 Perhitungan persen inhibisi (IC50) hasil fraksinasi tambelo a. Nilai standart deviasi hasil fraksinasi Fraksi Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi 4 Fraksi 5 Fraksi 6 Fraksi 7 Fraksi 8 Fraksi 9 Fraksi 10 I 108,76 60,78 58,37 73,41 91,36 70,83 62,85 44,97 8,77 24,37 Ulangan II 100,03 64,27 62,86 73,47 80,95 75,07 57,80 43,61 7,03 33,13 III 101,74 65,46 63,14 83,72 85,82 77,56 54,32 40,92 10,82 25,85 Rata-rata 103,51 63,50 61,46 76,87 86,04 74,49 174,97 129,5 26,62 83,35 Standart deviasi 4,63 2,43 2,68 5,94 5,21 3,40 4,29 2,06 1,90 4,69 89 b. Perhitungan persen inhibisi dan IC50 pada fraksi 9 dan fraksi 10 Sampel Ulangan Abs % Inhibisi 0,425 0 20 0,193 54,59 40 0,149 64,94 60 0,086 79,76 80 0,073 82.82 20 0,179 57,88 40 0,148 65,18 Kosentrasi Blanko 1 Fraksi 9 2 3 1 Fraksi 10 2 3 60 0,082 80,71 80 0,049 88,47 20 0,187 56 40 0,136 68 60 0,086 79,76 80 0,028 93,41 20 0,255 40,00 40 0,127 70,12 60 0.108 74,59 80 0,078 81,65 20 0,277 34,82 40 0,164 61,41 60 0,112 73,65 80 0,099 76,71 20 0.246 42.12 40 0.155 63.53 60 0.102 76.00 80 0.079 81.41 Pers. regresi linear IC50 (ppm) y=0,497x + 45,64 8,77 y=0,536x + 46,23 7,03 y=0,62x + 43,29 10,82 y=0,647x + 34,23 24,37 y=0,689x + 27,17 33,13 y=0,651x + 33,17 25,85 Rataan IC50 (ppm) 8,87 1,90 27,78 4,69 Lampiran 12 Hasil identifikasi senyawa terpenoid tambelo pada LC-MS