ii. bahan dan metode

II. BAHAN DAN METODE
2. 1 Perancangan Percobaan
Rumput laut yang digunakan pada penelitian ini yaitu rumput laut K.
alvarezii dengan kondisi baik (tidak terdapat tanda-tanda pemutihan jaringan)
yang berasal dari Kepulauan Natuna, Kepulauan Riau. Penelitian ini dimulai
dengan persiapan eksplan thalus rumput laut. Persiapan eksplan meliputi
persiapan media kultur semi steril. Media yang digunakan adalah media CW.
Persiapan lainnya dalam persiapan eksplan adalah transportasi eksplan dari tempat
asal dan pembersihan eksplan untuk dikultur pada kondisi semi steril. Setelah
dilakukan persiapan eksplan, dilakukan sterilisasi eksplan menggunakan media
CW dengan penambahan antibiotik. Sterilisasi eksplan meliputi persiapan media
steril, inisiasi eksplan, dan uji kontaminasi eksplan.
Proses selanjutnya pada penelitian ini adalah induksi kalus. Induksi kalus
meliputi kegiatan pembuatan media perlakuan untuk induksi kalus, penanaman
eksplan, dan pengamatan induksi kalus. Media perlakuan yang digunakan adalah
media CW dan PES padat dengan penambahan zat pengatur tumbuh dari
golongan auksin yaitu Indol Acetic Acid (IAA) dan Napthalen Acetic Acid (NAA),
serta dari golongan sitokinin yaitu Benzyl Amino Purine (BAP). Jenis ZPT
dikombinasikan sesuai rancangan percobaan pada penelitian ini. Perlakuan
dengan penambahan ZPT IAA dan BAP dibuat menjadi 9 perlakuan di tiap-tiap
media dasar. Sementara itu perlakuan dengan penambahan ZPT NAA dan BAP
dibuat menjadi 6 perlakuan di tiap-tiap media dasar, akan tetapi perlakuan dengan
tanpa penambahan NAA menggunakan data yang sama dengan kelompok
perlakuan penambahan ZPT IAA dan BAP sehingga jumlah perlakuan menjadi 9
perlakuan. Setiap perlakuan dibuat sebanyak 10 ulangan.
2. 2 Prosedur Penelitian
2. 2. 1 Persiapan Eksplan
2. 2. 1. 1 Persiapan Wadah dan Media Kultur
Wadah yang digunakan yaitu toples. Langkah awal yaitu toples dicuci dan
disterilisasi dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit.
Selanjutnya dibuat stok air laut saring untuk campuran dalam pembuatan
media kultur semi steril dengan cara air laut disaring menggunakan internal filter
akuarium AA-1200L. Air laut yang sudah disaring tersebut kemudian disaring
kembali menggunakan plankton net sebanyak dua kali.
Setelah itu dilanjutkan dengan pembuatan larutan stok media untuk kultur
semi steril. Pembuatan dilakukan dengan cara larutan stok A dipanaskan hingga
mendidih kemudian ditambahkan 1 mℓlarutan stok B ke dalam larutan stok A dan
diaduk menggunakan magnetic stirrer sampai homogen. Komposisi media CW
terdapat pada Lampiran 1.
Langkah selanjutnya adalah pembuatan media untuk kultur semi steril.
Media CW dalam toples ditentukan sebanyak 4 liter. Langkah pertama dalam
pembuatan media CW untuk kultur semi steril yaitu disiapkan terlebih dulu labu
ukur ukuran 2 ℓyang telah diisi dengan air laut saring sebanyak 1 ℓ. Selanjutnya
ditambahkan 8 mℓstok larutan CW (2 mℓ
/ℓ) dan 4 mℓstok larutan thyamine (1
mℓ
/ℓ) sambil diaduk dengan magnetic stirrer kemudian ditambahkan air laut
saring hingga volume mencapai 2 ℓ
. Setelah diaduk secara merata, media
dimasukkan ke dalam toples kaca dan ditambahkan lagi air laut saring sebanyak 2
ℓke dalam toples kaca hingga volume mencapai 4 ℓ. Setelah selesai membuat
media, toples kaca ditutup dengan menggunakan plastik tahan panas dan diikat
dengan karet kemudian disterilisasi dengan autoklaf selama 1 jam pada suhu
1210C atau tekanan 0,1 Mpa. Satu hari setelah disterilisasi, pada media CW
ditambahkan 1 mℓstok larutan vitamin B12 steril. Hal ini dilakukan dalam
laminar air flow.
2. 2. 1. 2 Persiapan Eksplan untuk Kultur Semi Steril
K. alvarezii ditransportasikan dari Kepulauan Natuna, Kepulauan Riau,
Indonesia menuju Laboratorium Service SEAMEO BIOTROP Tajur, Jawa Barat,
Indonesia. Rumput laut dimasukkan ke dalam wadah transportasi yaitu box kardus
dimana rumput laut dibalut dengan koran basah. Waktu transportasi disesuaikan
dengan persiapan media kultur.
Selanjutnya, thalus rumput laut yang sehat dan bersih dipotong sekitar 10
cm menggunakan pisau lalu dibersihkan dengan air laut steril (Gambar 1). Untuk
aklimatisasi pada kondisi laboratorium, eksplan yang telah dipotong kemudian
5
dikultur pada kondisi semi steril dalam media CW yang sebelumnya sudah
dipersiapkan dan diberikan aerasi serta ditutup dengan plastik wrap code PW-45.
Gambar 1. Stok air laut steril.
Rumput laut dipelihara sampai dapat bertahan hidup dengan stabil dalam
ruangan AC dan diberikan fluktuasi penyinaran cahaya gelap : terang = 12:12 jam
dengan intensitas ± 1500 lux (Suryati dan Mulyaningrum 2009) (Gambar 2).
Selama aklimatisasi, media diganti satu minggu sekali.
Gambar 2. Kultur cair semi steril (aklimatisasi eksplan).
2. 2. 2 Sterilisasi Eksplan Thalus
2. 2. 2. 1 Persiapan Media Sterilisasi
Media CW sebanyak 970 mℓyang sudah disterilisasi dengan autoklaf
ditambahkan larutan antibiotik mix (penicillin G, streptomycin sulphate,
kanamycin, nystatin, neomycin) sebanyak 30 mℓdan vitamin B12 0,2 mℓdi
dalam laminar air flow. Pembuatan larutan antibiotik mix (Suryati dan
Mulyaningrum 2009) yaitu dengan cara mencampurkan penicillin G 1 g,
streptomycin sulphate 2 g, kanamycin 1 g, nystatin 25 mg dan neomycin 200 mg
6
ke dalam 100 mℓaquades yang kemudian disterilisasi dengan syringe filter 0,22
μm. Setelah pembuatan media steril selesai, media steril dibagi ke dalam 10 botol
dengan volume masing-masing 100 mℓ
.
2. 2. 2. 2 Inisiasi Eksplan
Eksplan yang digunakan adalah rumput laut yang telah diaklimatisasikan
pada kultur semi steril selama 1 minggu dan 5 minggu. Rumput laut dipotong
sepanjang 5 cm dengan menggunakan pisau scalpel steril kemudian dibersihkan
dengan air laut steril sebanyak dua kali. Selanjutnya rumput laut yang telah
dibersihkan, dicuci dan direndam air laut steril ditambah sabun tween sebanyak 5
tetes per 100 mℓselama 10 menit, kemudian dibilas dengan menggunakan air laut
steril kembali sebanyak dua kali. Proses selanjutnya adalah perendaman eksplan
rumput laut ke dalam larutan betadine 0,5% (0.5 mℓper 100 mℓair laut) selama 2
menit dan setelah itu dibilas kembali sebanyak dua kali dengan air laut steril.
Eksplan kemudian dimasukkan ke media CW + antibiotik mix sebanyak 12-14
eksplan per botol kultur kemudian dishaker selama 60 jam dengan penyinaran
lampu TL 1500 lux dengan perbandingan penyinaran terang gelap 12 : 12 jam.
Setelah 60 jam dishaker, eksplan dibilas dengan air laut steril kemudian
ditanam di media CW padat (media CW dengan penambahan bacto agar 8 g/ℓ).
Eksplan yang ditanam disimpan di ruang kultur pada suhu ruangan 220C dan
pencahayaan lampu 1500 lux dengan perbandingan pencahayaan terang gelap 12 :
12 jam. Pada 2 minggu setelah tanam, diamati jumlah eksplan yang
terkontaminasi dan kondisi fisik eksplan.
2. 2. 3 Induksi Kalus
2. 2. 3. 1 Persiapan Media Induksi Kalus
Rancangan percobaan dilakukan untuk mendapatkan media yang optimal
untuk induksi kalus. Induksi kalus dilakukan pada dua jenis media dasar yaitu CW
dan PES. Komposisi media PES terdapat di Lampiran 2. Media dasar CW dibuat
sebanyak 1 liter. Pembuatan media CW dilakukan dengan cara stok larutan CW
dimasukkan sebanyak 2 mℓdan stok thyamine 1 mℓke dalam labu ukur
berukuran 1 ℓkemudian ditambahkan air laut saring sampai 1 ℓ. Sementara itu,
banyaknya media PES yang dibuat adalah 1 liter. Pembuatan media PES yaitu
7
dengan cara larutan stok PES steril sebanyak 20 mℓdimasukkan ke dalam 980 mℓ
air laut yang sudah disterilisasi dengan autoklaf. Penambahan stok PES steril
tersebut dilakukan dalam laminar air flow.
Pada masing-masing media tersebut ditambahkan dua kombinasi ZPT
yaitu BAP + IAA dan BAP + NAA. Konsentrasi BAP yang digunakan adalah 0;
0,5; 1 mg/ℓ
. Konsentrasi IAA yang digunakan adalah 0; 2,5; 5 mg/ℓ
, sedangkan
NAA pada konsentrasi 0; 0,5; 1 mg/ℓ(Tabel 1 dan Tabel 2).
Tabel 1. Perancangan media perlakuan dengan penambahan ZPT IAA dan BAP
Media Dasar
CW
PES
IAA
BAP (mg/ℓ
)
(mg/ℓ
)
0
0,5
1
0
1
6
11
2,5
2
7
12
5
3
8
13
0
16
21
26
2,5
17
22
27
5
18
23
28
Keterangan : Angka yang dicetak miring merupakan penomoran pada media perlakuan di botol
Tabel 2. Perancangan media perlakuan dengan penambahan ZPT NAA dan BAP
Media Dasar
CW
PES
NAA
BAP (mg/ℓ
)
(mg/ℓ
)
0
0,5
1
0
1
6
11
0,5
4
9
14
1
5
10
15
0
0,5
16
21
26
19
24
29
1
20
25
30
Keterangan : Angka yang dicetak miring merupakan penomoran pada media perlakuan di botol
Setiap media perlakuan ditambahkan bacto agar 8 g/ℓ kemudian
dipanaskan hingga larut. Setelah larut, media perlakuan disterilisasi di autoklaf
selama 30 menit pada suhu 121 0C atau tekanan 0,1 Mpa. Setelah disterilisasi dan
suhu media sudah menjadi hangat, tiap-tiap media perlakuan ditambahkan 0,1 mℓ
vitamin B12 di dalam laminar dan diaduk menggunakan magnetic stirrer.
Selanjutnya media perlakuan dituang ke dalam botol perlakuan steril (botol
chicken).
8
2. 2. 3. 2 Penanaman Eksplan dan Pengamatan
Eksplan rumput laut K. alvarezii yang tidak terkontaminasi pada 2 minggu
setelah sterilisasi dipindahkan (subkultur) ke media perlakuan. Eksplan yang steril
dikeringkan dengan menggunakan tissu steril kemudian dipotong menjadi panjang
4-5 mm dan dikeringkan kembali menggunakan tissu steril untuk menghilangkan
cairan dan lendir yang keluar pada saat pemotongan. Eksplan kemudian ditanam
di media perlakuan untuk induksi kalus (1 eksplan per botol).
2. 3 Parameter Penelitian dan Analisis Data
Parameter yang diukur pada penelitian ini adalah hubungan umur
pemeliharaan eksplan pada kondisi semi steril terhadap tingkat kontaminasi,
tingkat persentase kalus yang terinduksi dan respon pertumbuhan kalus.
2. 3. 1 Sterilisasi Eksplan Thalus Rumput Laut
Kontaminasi merupakan salah satu hal yang harus dihindari dari kegiatan
kulur jaringan. Untuk menunjang keberhasilan kultur jaringan, eksplan yang
ditanam harus steril dan tidak terkontaminasi. Eksplan yang dipelihara pada kultur
semi steril selama 1 minggu dan 5 minggu diuji hubungannya terhadap jumlah
eksplan yang terkontaminasi dan tidak terkontaminasi. Hal ini bertujuan untuk
mengetahui apakah ada hubungan lama pemeliharaan dalam kultur semi steril
terhadap kontaminasi eksplan.
Untuk mengetahui hubungan antara lama pemeliharaan dalam kultur semi
steril dan kontaminasi eksplan, maka dilakukan penghitungan eksplan yang
terkontaminasi dan tidak terkontaminasi. Perhitungan dilakukan pada tiap-tiap
umur pemeliharaan (1 minggu dan 5 minggu).
Data hubungan umur eksplan dalam kultur semi steril terhadap tingkat
kontaminasi eksplan dianalisis statistik dengan menggunakan uji independensi
(chi-square test). Langkah-langkah uji independensi yang telah dirumuskan
Daniel (1990) adalah sebagai berikut:
1. Merumuskan H0 dan H1
H0 : Umur eksplan dalam pemeliharaan kultur semi steril dan kontaminasi
eksplan adalah independent (tidak ada hubungan)
9
H1 : Umur eksplan dalam pemeliharaan kultur semi steril dan kontaminasi
eksplan tidak independent (ada hubungan)
2. Menentukan taraf nyata dan derajat kebebasan serta menentukan daerah
kritisnya (α= 0,05; derajat bebas (v) = (kolom – 1) (baris – 1))
Menentukan statistik uji yang cocok χ2 =
Eij = (total baris i) x (total kolom j) : total pengamatan
3. Menghitung statistik uji
4. Menarik Kesimpulan
2
Jika χ
hitung > χ2 tabel (α,v) : tolak Ho
2
Jika χ
hitung < χ2 tabel (α,v) : gagal tolak Ho
Keterangan :
O : frekuensi obeservasi
E : frekuensi harapan
i : baris ke-i
j : kolom ke-j
2. 3. 2 Persentase Eksplan Membentuk Kalus
Persentase eksplan membentuk kalus pada tiap-tiap perlakuan dihitung
dengan membandingkan jumlah eksplan yang membentuk kalus pada minggu ke6 setelah tanam dengan jumlah eksplan keseluruhan yang ditanam pada tiap-tiap
media perlakuan. Untuk menghitung persentase eksplan membentuk kalus
digunakan rumus matematika sebagai berikut:
% eksplan membentuk kalus =
x 100%.
Data tingkat persentase kalus yang terinduksi dianalisis secara deskriptif dan
perhitungan persentase menggunakan MS.Excel 2007.
2. 3. 3 Pertumbuhan Kalus
Pada minggu ke-6 setelah tanam dilakukan pengamatan pertumbuhan
kalus. Pengamatan respon pertumbuhan kalus dilakukan dengan cara pemberian
nilai (skor). Kalus yang terbentuk terbagi menjadi 6 nilai pertumbuhan, yaitu:
0 : eksplan tidak bereaksi atau mati
10
1 : pembentukan kalus sangat rendah
2 : pembentukan kalus rendah
3 : pembentukan kalus sedang
4 : pembentukan kalus tinggi
5 : pembentukan kalus sangat tinggi
Data yang diperoleh kemudian diolah untuk mendapatkan media yang
optimal untuk pertumbuhan kalus. Data respon tumbuh kalus dianalisis statistik
dengan menggunakan uji statistik non-parametrik Kruskal-Wallis dengan
menggunakan perangkat lunak SPSS 16.0.
Analisis data dengan menggunakan uji Kruskal-Wallis mengikuti langkahlangkah yang telah dirumuskan dan telah ada dalam perangkat lunak SPSS 16.0
sebagai berikut (Steel and Torrie 1980 dalam Aprilliana 2010):
1. Merumuskan H0 dan H1
2. Perangkingan (Pemberian Skor)
3. Membuat tabel rangking
4. Menghitung jumlah T(t-1)(t+1)
5. Menghitung faktor koreksi atau pembagi
Pembagi = 16. Menghitung H
H=
12
n(n+1)
∑Ri2
ni
- 3(n+1)
Menghitung H’
H’ =
Melihat X2 tabel dengan α: 0,05 db (v) = k-1
Jika x 2 hitung > tabel = tolak Ho = uji lanjut Dunn
Jika x 2 hitung < tabel = gagal tolak Ho
Keterangan :
T
: (t-1)(t+1)
Ni
: banyaknya pengamatan dalam perlakuan
Ri 2
: Jumlah rangking dalam perlakuan ke-i
T
: banyaknya pengamatan seri dalam kelompok
H’
: H terkoreksi
11
Jika hasil analisis data pada uji Kruskal-Wallis menunjukkan adanya
pengaruh yang nyata maka dilanjutkan dengan uji Dunn yang bertujuan untuk
mengetahui perlakuan mana saja yang memberikan pengaruh berbeda nyata
terhadap pertumbuhan kalus. Uji dilakukan dengan menghitung mengikuti rumus
sebagai berikut (Daniel 1990):
><Z α
k(k-1)
>Zα
jika
maka terdapat perbedaan yang nyata
k(k-1)
<Zα
jika
maka tidak terdapat perbedaan yang nyata
k(k-1)
Keterangan :
Ri : rata-rata ranking perlakuan ke-i
Rj : rata-rata ranking perlakuan ke-j
N : Banyaknya ulangan
k
: Banyaknya perlakuan
12