pengembangan kandidat senyawa obat turunan

0290: Firdayani dkk.
KO-35
PENGEMBANGAN KANDIDAT SENYAWA OBAT TURUNAN
NAFTOKUINON SEBAGAI INHIBITOR VIRUS HEPATITIS B
Firdayani1∗ , Rilianawati1 , Susi Kusumaningrum1 , Mutia Hardhiyuna1 , Siska Andrina Kusumastuti1 ,
Asep Saepudin1 , Pertamawati1 , Hasan1 , Kara Fabiola1 , Harry Noviardi1 , Didin Mujahidin2 ,
Rukman Hertadi2 , dan Muhammad Ali Zulfikar2
1
Pusat Teknologi Farmasi dan Medika, Dep.Bid TAB - BPPT
Gedung II BPPT Lantai 15 Jl. MH. Thamrin 8, Jakarta Pusat 10340
2
Departemen Kimia Institut teknologi Bandung
Jl. Ganeca 10 Bandung
∗
e-Mail: [email protected], telp: (021) 3169505
Disajikan 29-30 Nop 2012
ABSTRAK
Usaha penemuan dan pengembangan obat baru pada umumnya bersifat coba-coba (trial and error) sehingga dibutuhkan
biaya yang besar dan waktu yang lama. Untuk itu perlu terobosan dan inovasi agar pengembangan dan penemuan obat tetap
layak secara ekonomi antara lain dengan melakukan penelitian sejumlah kecil senyawa yang terpilih sebagai penuntun dan merancangnya dengan lebih baik. Cara rasional yang dapat dilakukan antara lain melakukan pendekatan pengembangansenyawa
yang telah ada, yang sudah diketahui struktur molekul dan aktivitas biologisnya, kemudian dilakukan modifikasi molekul atau
mensintesis sejumlah turunannya. Dengan berkembangnya teknologi komputer, rancangan obat rasional mempunyai prospek
yang cerah dalam pencarian obat baru. Dalam penelitian ini senyawa yang digunakan sebagai senyawa penuntun adalah
turunan naftokuinon yang dari beberapa publikasi diketahui mempunyai aktivitas menghambat virus hepatitis B. Penelitian
diawali dengan melakukan simulasi docking dan dinamika molekul senyawa-senyawa turunan naftokuinon menggunakan pemodelan molekuler untuk memprediksi interaksinya dengan reseptor yang bertanggungjawab dalam pertumbuhan dan replikasi
VHB. Berdasarkan hasil simulasi, dipilih derivat yang potensial untuk selanjutkan dilakukan semisintesis guna mendapatkan
senyawa tersebut. Setelah dilakukan pemurnian dan konfirmasi struktur hasil sintesis, derivat-derivat tersebut diujikan aktivitasnya membunuh atau menghambat replikasi VHB secara in vitro. Data-data yang diperoleh selanjutnya dianalisa hubungan
kuantitatif struktur aktivitasnya (HKSA) untuk memperoleh kepastian struktur senyawa terbaik sebagai kandidat senyawa
inhibitor virus hepatitis B baru dari derivat naftokuinon.
Kata Kunci: Kandidat obat, turunan naftokuinon, virus hepatitis B
I.
PENDAHULUAN
Hepatitis B merupakan masalah kesehatan global,
diperkirakan sekitar 2 miliar penduduk dunia pernah
terpapar virus hepatitis B (VHB). Angka prevalensi infeksi VHB di Asia Pasifik cukup tinggi yaitu melebihi
8% dan penularannya pada umumnya terjadi secara
vertikal (pada periode perinatal) dan horizontal (pada
masa anak-anak) oleh karena itu risiko menjadi kronis
cukup besar. Diperkirakan lebih dari 350 juta di antaranya menjadi kronis yang berisiko tinggi meninggal
dunia akibat penyakit hati kronis. Sekitar 75% pengidap hepatitis B kronis karier berada di Asia Pasifik.
Pada saat ini sekitar 1 juta kematian per tahun akibat
penyakit hati berhubungan dengan VHB. Sirosis hati,
gagal hati, atau kanker hati dapat terjadi pada 15 ∼40%
penderita dengan infeksi hepatitisB kronis. Di negara
berkembang orang dewasa sangat berisiko tinggi untuk
terkena hepatitis B. Terlebih di negara miskin dengan
endemis tinggi, hepatitis B cukup banyak ditemukan
pada anak-anak. Oleh sebab itu, tingginya morbiditas
dan mortalitas akibat hepatitis B, penyakit ini sangat
mengancam dunia.
Prevalensi infeksi HBV berbeda-beda di seluruh
dunia. Kategori daerah endemis terbagi menjadi rendah, sedang, dan tinggi. Indonesia masuk dalam
kelompok prevalensi sedang sampai tinggi. Data Organisasi Kesehatan Dunia, WHO, menyatakan virus
hepatitis B 50∼100 kali lebih menular daripada virus
yang menyerang sistem imunitas, HIV. Penularannya terjadi lewat darah dan cairan tubuh.Kelompok
berisiko tinggi adalah anak yang dilahirkan oleh ibu
dengan virus HbsAg, virus penanda adanya hepatitis
Prosiding InSINas 2012
KO-36
positif.[1]
Tujuan utama pengobatan hepatitis B kronis adalah
untuk mengeliminasi atau menekan secara permanen
proses replikasi virus yang akan mengurangi patogenitas serta infektivitas dan pada akhirnya dapat
menghentikan atau mengurangi keradangan hati sehingga progresivitas menjadi sirosis dan kanker hati dapat dicegah.
Obat-obatan yang dipakai untuk hepatitis B kronis
ada dua pilihan.Pilihan pertama yaitu obat yang dapat
menekan replikasi virus sekaligus untuk memodulasi
sistem imun penderita, yang dikenal dengan nama interferon. Yang sekarang dipakai adalah pegylated interferon yang memberikan hasil memuaskan. Keuntungan obat ini dapat menekan replikasi virus dalam
jumlah yang besar, lama pemakaian tertentu (6 bulan sampai1 tahun), relatif aman, dan ditoleransi baik
oleh pasien yang sudah mengalami sirosis khususnya
yang masih terkompensasi. Namun harga obat ini
masih cukup mahal. Pilihan kedua adalah dari golongan analog nukleosida yang dapat menekan replikasi
virus. Diantaranya adalah lamivudine, adefovir, entecavir dan masih dalam tahap ujicoba adalah telbivudine dan tenofovir. Pemakaian obat-obat ini relatif lebih
lama (lebih dari 1 tahun) dan dapat terjadi resistensi
virus hepatitis B terhadap obat tersebut, khususnya
lamivudine yang mencapai angka 70% setelah pemakaian 5 tahun.
Angka keberhasilan terapi hepatitis B kronis dengan
menggunakan obat-obatan golongan nukleosida yang
kini beredar masih di bawah 20%. Hingga kini belum
dipasarkan obat dari golongan nonnukleosida. Dengan
demikian, masih diperlukan usaha dan penelitian untuk mencari dan menemukan obat baru untuk mengatasi penyakit akibat virus hepatitis B ini.
Usaha penemuan dan pengembangan obat baru
pada umumnya bersifat coba-coba (trial and error)
sehingga dibutuhkan biaya yang besar dan waktu
yang lama.
Untuk itu perlu terobosan dan inovasi agar pengembangan dan penemuan obat tetap
layak secara ekonomi. Dalam upaya merancang dan
mengembangkan obat baru untuk penyakit infeksi
VHB ini, langkah awal yang dilakukan antara lain dengan mengembangkan kandidat obat yang telah ada,
yang sudah diketahui struktur molekul dan aktivitas biologisnya, untuk dijadikan sebagai senyawa penuntun atas dasar penalaran yang sistematik dan rasional dengan mengurangi faktor coba-coba seminimal mungkin. Teknik-teknik komputasional yang digunakan dalam desain obat berbasis struktur menjadi
teknik yang efisien untuk pengembangan dan optimasi
senyawa obat agar menghasilkan obat yang lebih poten.
Selain itu teknik ini dapat memberikan gambaran dan
prediksi yang lebih detail tentang mekanisme aksi
suatu obat dalam mengatasi suatu penyakit.
0290: Firdayani dkk.
Telah diketahui bahwa senyawa yang terkandung
dalam produk alami mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai obat. Dengan berkembangnya teknologi komputer, rancangan obat rasional mempunyai
prospek yang cerah dalam pencarian obat baru. Dengan
bantuan program pemodelan dan dinamika molekul,
dan telah diketahui sruktur molekul tiga dimensi enzim
sebagai reseptor target, akan dapat diketahui cara kerja
obat pada tingkat molekul dan peran berbagai kekuatan sifat fisika dan kimia pada proses interaksi obatreseptor.[7]
Dalam riset terapan ini dipilih senyawa 1,4nafokuinon sebagai senyawa penuntun untuk dikembangkan sebagai kandidat senyawa obat untuk infeksi
VHB. Berdasarkan literatur diketahui beberapa turunan
senyawa ini mempunyai aktivitas yang luas antara lain
sebagai antikanker, antifungal, antibakteri dan antiviral. Crosby et al.(2011) menemukan bahwa derivat
naftokuinon yang berbentuk trimer mempunyai aktivitas antivirus hepatitis B dengan EC50 sebesar 0,009
µM dan senyawa kecil monomernya juga menghambat
bahkan terhadap virus yang resistant terhadap analog
nukleosida golongan cytidine (3TC).[8]
Berbagai macam kemungkinan turunan naftokuinon
hasil modifikasi digambar dan diprediksi kemungkinannya sebagai inhibitor VHB secara in silico. Senyawa
naftokuinon dan turunannya ini kemudian disintesis
dan diuji aktivitas penghambatannya secara in vitro terhadap enzim glikohidrolase dan reverse-transkriptase
serta terhadap kultur sel hati yang telah terinfeksi
virus hepatitis B. Hasil pengujian selanjutnya dianalisa
hubungan kuantitatif struktur dengan aktivitas untuk
melihat sifat kimia fisika yang berperan, substituen atau
gugus yang memberikan aktivitas dan memprediksi
senyawa dengan struktur ”terbaik” sebagai kandidat
senyawa antivirus hepatitis B turunan naftokuinon. Dengan demikian kegiatan riset ini merupakan inovasi
dalam penemuan obat dimana dilakukan kombinasi antara kegiatan komputasi dengan laboratorium. Dalam
riset ini dikurangi faktor coba-coba untuk mendapatkan obat baru sebagai antivirus hepatitis B sehingga
menghemat biaya dan waktu yang biasa diperlukan untuk pengembangan obat.
TABEL 1: Afinitas ikatan ligan-reseptor hasil simulasi docking
Prosiding InSINas 2012
0290: Firdayani dkk.
II.
KO-37
METODOLOGI
• Simulasi dengan pemodelan molekular senyawasenyawa derivat naftokuinon dalam berinteraksi
dengan reseptor target secara komputasi dilakukan
menggunakan program Autodock vina dan Amber.
• Senyawa terpilih disintesis dalam beberapa tahap,
senyawa hasil sintesis dimurnikan dengan khromatografi atau rekristalisasi dan dianalisa sifat
fisikokimianya. Konfirmasi dan identifikasi struktur senyawa hasil sintesis dengan metoda khromatografi dan spektrofotometri antara lain dengan
GS-MS, LC-MS, FTIR dan NMR.
• Pengujian aktivitas menghambat enzim glikohidrolase dan reverse transcriptase dari
naftokuinon dan derivatnya menggunakan
metode spektrometri.
G AMBAR 1: Pola interaksi 2HNDIG dengan protein HBx
• Analisis hubungan kuantitatif struktur - aktivitas
untuk mengetahui sifat fisikokimia yang berperan
dan mekanisme aksi dalam aktivitas menghambat
replikasi virus hepatitis B serta menentukan struktur ideal turunan naftokuinon sebagai kandidat antivirus.
III.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Telah dilakukan simulasi docking dengan ligan
naftokuinon dan turunan-turunannya ke dalam
reseptor-reseptor target protein atau enzim yang
berperan dalam proses replikasi virus hepatitis B yaitu:
HBx, glikohidrolase dan reverse transcriptase. Hasil
simulasi docking ke dalam reseptor target antivirus
hepatitis B tertera pada TABEL 1.
Adapun pola interaksi antara senyawa 2HNDIG
dengan reseptor-reseptor tersebut dapat dilihat pada
G AMBAR 1, G AMBAR 2 dan G AMBAR 3.
Simulasi dinamika ligan 2HNDIG dalam enzim reverse transcriptase menunjukkan terjadinya pelemahan
ikatan yang diakibatkan respon reseptor.
Dari gambar di atas dapat terlihat bahwa interaksi
ligan-reseptor terdiri dari tiga ikatan hidrogen (dengan Lys350 dan Tyr336) dan interaksi hidrofobik dengan 3 residu asam amino (His96, Trp266, dan Lys353).
Sedangkan pola interaksi setelah simulasi dinamika
molekul ditunjukkan pada G AMBAR 5.
Hasil simulasi dinamika menunjukkan pengurangan
ikatan hidrogen dan penambahan jumlah residu-residu
yang berinteraksi hidrofobik. Pengurangan jumlah
ikatan hidrogen ini berperan dalam pelemahan interaksi ligan-reseptor. Senyawa terpilih selanjutnya disintesis dan dikonfirmasi strukturnya pada tiap-tiap tahap.
Pada tahun pertama ini sintesis yang telah dilakukan
belum sampai pada senyawa diharapkan, melainkan
baru diperoleh senyawa antara/ intermedietnya antara
G AMBAR 2: Pola interaksi 2HNDIG dengan enzim glukohidrolase
lain 2-hidroksi-3-bromo-1,4-naftokuinon yang dihasilkan dari reaksi brominasi 2-hidroksi-1,4-naftokuinon.
Untuk mengetahui hubungan kuantitatif strukturaktivitas, dilakukan uji aktivitas penghambatan beberapa senyawa turunan naftokuinon terhadap enzim yang berperan dalam replikasi virus menggunakan metode spektrofotometri UV/visual. Pada penelitian ini, dilakukan uji penghambatan virus hepatitis B terhadap enzim α dan β-glukosidase menggunakan senyawa turunan naftokuinon dengan metode
in vitro enzimatis. Uji ini didasarkan pada reaksi
substrat enzim yang akan menghasilkan produk pnitrophenyl. Produk ini akan menghasilkan warna
kekuningan yang kemudian diukur dengan spektrofotometri dengan panjang gelombang 400nm. Semakin bening suatu larutan maka semakin aktif sampel tersebut menghambat enzim α-glukosidase dan βglukosidase.
Prosiding InSINas 2012
KO-38
0290: Firdayani dkk.
G AMBAR 3: Pola interaksi 2HNDIG dengan enzim reverse transcriptase
G AMBAR 5: Pola interaksi senyawa 2HNDIG dengan reverse transcriptase setelah simulasi dinamik
TABEL 2: Nilai IC50 senyawa turunan naftokuinon terhadap enzim
α- dan β-glukosidase
G AMBAR 4: Pola interaksi senyawa 2HNDIG dengan reverse transkriptase sebelum simulasi dinamika
Berdasarkan data di atas, diketahui bahwa turunan
naftokuinon mempunyai potensi sebagai penghambat
enzim yang terlibat dalam replikasi virus antara lain
α-glukosidase dan β-glukosidase. Enzim-enzim ini
merupakan penyusun enzim glikohidrolase, yaitu en-
zim yang berperan dalam pembentukan amplop virusdan bertanggung jawab terhadap glikohidrolasi protein. Virus Hepatitis B merupakan salah satu virus beramplop yang terdiri dari membran lipid yang dibentuk dari sel inang yang terinfeksi. Penghambatan enzim glikohidrolase dapat menghambat pembentukan
amplop virus hepatitis B sehingga replikasi virus menjadi tidak sempurna dan pada akhirnya virus akan mati.
Dari data penghambatan enzim -glukosidase derivat
naftokuinon dilakukan analisis HKSA yang melibatkan
parameter-parameter fisika kimia yang diperoleh dari
perhitungan teoritis. Data-data tersebut diolah dengan
regresi linear dan non linear menggunakan program
Prosiding InSINas 2012
0290: Firdayani dkk.
KO-39
SPSS sehingga didapat persamaan HKSA yang akan
mengetahui parameter yang mempunyai hubungan dengan aktivitas. Beberapa persamaan diperoleh melibatkan sifat hidrofobik dan sterik dalam aktivitas antikanker turunan naftokuinon adalah sebagai berikut:
Log
1
IC50
= 0, 03M R − 2, 61
R2 = 0, 497 F = 4, 946 s = 0, 546
1
Log
= 0, 02M R − 1, 85
IC50
(1)
(2)
R2 = 0, 545 F = 5, 995 s = 0, 519
1
= −0, 58ClogP + 0, 01CM R −
IC50
2, 91
(3)
R2 = 0, 797 F = 7, 830 s = 0, 389
1
Log
= 0, 045logP 2 − 0.048logP −
IC50
1, 084
(4)
Log
R2 = 0, 436 F = 1, 548
Log
1
LC50
DAFTAR PUSTAKA
s = 0, 650
= −0, 079logP 2 −
0, 048logP − 1, 084
(5)
F = 1, 548 s = 0, 650 −
1
Log
= −0, 08ClogP 2
LC50
0, 373ClogP − 2, 365
(6)
R = 0, 677 F = 4, 189 s = 0, 490
1
= 0, 031logP 2 + 0, 222logP +
LC50
0, 032M R − 3, 155
(7)
2
R = 0, 436
2
Log
2
R = 0, 982
F = 55, 415 s = 0, 132
Berdasarkan hasil analisa hubungan kuantitatif
struktur-aktivitas tersebut terlihat bahwa parameter
hidrofobik logP dan sterik M R mempunyai peranan
dalam aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase pada turunan naftokuinon. Persamaan tersebut, terutama
P ERS . (7) yang memiliki parameter statistik optimal,
dapat digunakan untuk merancang struktur turunan
naftokuinon yang berpotensi antivirus dengan aktivitas
maksimal.
IV.
senyawa ini masih dalam tahap pengerjaan dan telah
dihasilkan beberapa senyawa intermediet Sementara
itu, untuk mengetahui hubungan struktur naftokuinon
dengan aktivitas antivirus telah dilakukan uji penghambatan terhadap enzim alfa dan beta glukosidase dengan metode spektrofotometri. Pada tahun berikutnya
disarankan untuk melanjutkan sintesis hingga diperoleh senyawa yang diinginkan dan dilakukan optimasi
kondisi-kondisi prosesnya. Senyawa yang dihasilkan
selanjutnya diuji aktivitas inhibisi virus secara in vitro
menggunakan sel yang telah ditransfeksi plasmid DNA
virus hepatitis B.
[1] World
Health
Organization,
Hepatitis
B.
World
Health
Organization Fact Sheet no. 2004. available at
http://who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en
[2] Lafanchy D., Hepatitis B Virus epidemiology, disease burden, treatment,and current and emerging
prevention and control measures, J. Viral Hepat.
2004;11:97-107.
[3] Lok A.S., Chronic Hepatitis B. N. Engl. J. Med.
2002;346:1682-3.Hou J, Liu Z, Gu F. Epidemiology
and Prevention of Hepatitis B Virus Infection, Int.
J. Med. Sci. 2005:2;50-57.
[4] PPHI, Konsensus Penatalaksanaan Hepatitis B
Kronik, 2003.
[5] Hernomo K., Perkembangan baru pengobatan
hepatitis virus B, Simposium Perkembangan Mutakhir di Bidang Gastro-hepatologi, Surabaya, 23
Oktober 1999.
[6] Hernomo K, Perkembangan baru dalam penatalaksanaan hepatitis virus B dan C, Pekan ilmiah
dalam Acara Peringatan 12 Tahun RS Pupuk
Kaltim, Bontang, Kaltim, 10 Agustus 2002. Dalam
website:http://www.pgh.or.id
[7] Siswandono, B. Soekardjo, Kimia Medisinal 1, Airlangga University Press, Surabaya
[8] Crosby, et al., Antiviral agents 3. Discovery of a
novel small molecule non-nucleoside inhibitor oh
Hepatitis B Virus (HBV), Bioorganic & Medicinal
Chemistry 21, 2011: 1644-1648
KESIMPULAN
Desain struktur senyawa hasil simulasi docking
dan dinamika dalam reseptor target memberi menunjukkan bahwa senyawa 2HNDIG memiliki potensi
menjadi kandidat obat turunan naftokuinon sebagai inhibitor virus hepatitis B. Hingga saat ini proses sintesis
Prosiding InSINas 2012