EKSTRAKSI DNA RUMPUT LAUT Kappaphycus

Marina Chimica Acta, Oktober 2001, hal.6-10
Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Hasanuddin
Vol. 2 No. 2
ISSN 1411-2132
EKSTRAKSI DNA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii
DENGAN METODE FENOL KLOROFORM*)
Andi Tenriulo, Emma Suryati, Andi Parenrengi, dan Rosmiat**)
ABSTRAK
Telah dilakukan ekstraksi genom DNA rumput laut Kappaphycus alvarezii dengan metode konvensional fenol
kloroform dengan modifikasi. Sampel yang digunakan berasal dari lokasi budidaya di Pinrang, Madura dan
Lombok. Hasil ekstraksi memperlihatkan pita genom DNA yang relatif bersih. Penambahan kalium asetat dapat
meningkatkan kemurnian genom DNA yang diekstraksi. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian genom DNA
dilakukan dengan menggunakan Spektrofotmeter UV-VIS, diperoleh konsentrasi DNA sekitar 180-240 ng/L
dengan tingkat kemurnian rata-rata 1,89. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa konsentrasi DNA 1.020 ng
cukup untuk memperlihatkan pita yang jelas.
Kata Kunci : Ekstraksi DNA, Kappaphycus alvarezii , Fenol kloroform
DNA EXTRACTION OF SEAWEED, Kappaphycus alvarezii
BY PHENOL CHLOROFORM METHOD
ABSTRACT
The extraction DNA of seaweed Kappaphycus alvarezii by modification of phenol chloroform conventional
method has been conducted. Samples were collected from culture area in Pinrang, Madura and Lombok. The
extraction result showed genomic DNA band which are clear. The addition of potassium acetate can increase the
purity of genomic DNA. The concentration and purity of genomic DNA measurement was done by using
spectrophotometer UV-VIS. The analysis exhibited that the concentration of genomic DNA was obtained 180-240
ng/L with the purity of 1,89. The electrophoresis result showed that the genomic DNA concentration of 1.020 ng
is suistainable for showing of the clear band.
Key word : DNA extraction, Kappaphycus alvarezii , Phenol Chloroform
budidaya rumput laut selanjutnya. Namun informasi
mengenai teknik ekstraksi dan isolasi DNA, serta
karakteristik genetik rumput laut khususnya K. alvarezii
belum cukup tersedia.
PENDAHULUAN
Budidaya rumput laut telah berkembang
demikian pesat, terutama dikawasan timur Indonesia dan
khususnya di Sulawesi Selatan telah dicanangkan menjadi
sentra rumput laut dunia, sehingga perlu dukungan
teknologi yang cukup untuk meningkatkan dan
mengendalikan kuantitas, kualitas, dan kontinuitas
produksi. Salah satu jenis rumput laut yang paling banyak
dibudidayakan antara lain Euchema cottoni yang secara
taksonomi berubah menjadi Kappaphycus
alvarezii
(Doty,2000) Jenis ini
termasuk alga merah
(Rhodophyceae) penghasil karaginan yang banyak
digunakan dalam industri makanan, farmasi, kosmetik
tekstil, dan cat.(Angka,S.L., dan M.T.Suhartono, 2000).
Metode ekstraksi DNA yang tepat merupakan
salah satu faktor keberhasilan dalam amplifikasi DNA
yang akan digunakan dalam analisis karakter genetika
selanjutnya. Isolat genom DNA yang kurang baik akan
mempengaruhi proses amplifikasi DNA. Untuk itu perlu
dilakukan kajian terhadap metode yang umum digunakan
pada pada tanaman dan hewan atau modifikasi dari
metode yang telah ada untuk mengetahui metode ektraksi
DNA yang sesuai untuk rumput laut K. alvarezii
BAHAN DAN METODE
Perbedaan kualitas produksi dan karakteristik
morfologi pada beberapa lokasi budidaya selain
dipengaruhi oleh faktor lingkungan juga dipengaruhi oleh
faktor genetik rumput laut itu sendiri. Untuk mengetahui
karakteristik genetik rumput laut diperlukan tehnik
ekstraksi dan isolasi DNA, kemudian dianalisis untuk
membedakan karakter dari masing-masing spesies rumput
laut yang kelak akan menjadi bibit untuk pengembangan
Koleksi Sampel
Rumput laut, K. alvarezii dikoleksi dari beberapa
lokasi budidaya di Pinrang, Madura dan Lombok,dibawa
dalam bentuk segar ke Laboratorium Bioteknologi Balai
Riset Perikanan Budidaya Air Payau, Maros.. Identifikasi
secara morfologi dilakukan sebagai dasar pengelompokan
6
Andi Tenriulo, Emma Suryati, dkk
Mar. Chim Acta
2401 PC Simatdzu. Sampel diukur dengan volume cuvet 3
mL dan faktor pengenceran 200. Untuk mendapatkan
konsentrasi DNA untai ganda digunakan rumus :
jenis rumput laut sebelum analisis genetika. Sampel ( 50
mg) dipreservasi dengan menggunakan 250 uL TNESUrea buffer (Asahida et al., 1996) dalam tabung
eppendorf 1,5 mL. Sampel disimpan dalam suhu ruangan
sampai dilakukan ekstraksi DNA.
Ekstraksi DNA
Konsentrasi DNA(цg/ml) = A260 x 50 x faktor pengenceran
Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat
kontaminasi protein dalam larutan. Kemurnian larutan
DNA tersebut dapat dilihat dengan membagi nilai A 260
dengan A280. Molekul DNA dikatakan murni jika rasio
kedua nilai tersebut berkisar antara 1,8 – 2,0. Jika nilai
rasio lebih kecil dari 1,8 maka masih ada kontaminasi
protein atau fenol di dalam larutan (Sulandari,S dan
M.S.A. Zein. 2003).
Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode
fenol-kloroform yang telah dikembangkan oleh
Parenrengi (2001) dengan sedikit modifikasi. Modifikasi
metode dilakukan yaitu dengan penambahan kalium asetat
dalam proses ektraksi.
Sampel yang sudah dipreservasi dengan TNESUrea buffer ditambahkan 500 цL lysis buffer (0,5 M
NaCl, 0,001 M EDTA, 1 % (w/v) SDS, 0,8 % (v/v) Triton
x-100, dan 0,1 M Tris-HCl pH 9,0) kemudian dimasukkan
ke tabung eppendorf dan ditambahkan 40 mL SDS 10 %
(w/v) dan 20 цL proteinase K (20 mg/mL larutan),
diinkubasi pada 550C selama 1–3 jam, kemudian
ditambahkan 12,5 цL RNAse (20 mg/mL larutan) dan
disimpan pada suhu ruangan selama 15-30 menit
Selanjutnya ditambahkan fenol : kloroform : isoamyl
alkohol (PCIA (25:24:1)) dan divortex secara perlahan
sampai homogen, disimpan pada suhu ruangan selama 10
menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.000
rpm selama
8 menit. Bagian lapisan atas cairan
dipindahkan ke tabung eppendorf baru volume 1,5 mL.
Penambahan PCIA ini diulangi sekali lagi seperti di atas.
Lapisan atas diambil dan ditambahkan larutan kloroform :
isoamyl alkohol (CIA (24:1)), disentrifugasi dengan
kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit. Lapisan atas
dipindahkan lagi ke tabung baru dan ditambahkan 0,1
volume kalium asetat 5 M, 0,25 volume etanol, dan 1 vol
CIA (24 : 1) disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm
selama 4 menit. Lapisan atas kemudian ditambahkan
etanol absolut dingin dan digoyang dengan pembalikan
secara perlahan beberapa saat. DNA yang mengendap
pada dasar tabung berupa pellet warna putih sesudah
sentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 30 menit
dicuci dengan 1 mL ethanol 70 % dan disentrifugasi
dengan kecepatan 6.000 rpm selama 15 menit. DNA
dikering-anginkan selama lebih kurang 24 jam pada suhu
ruangan dan ditambahkan 100 uL aquadest atau TE buffer
(10 mM Tris dan 1 mM EDTA, pH 8,0), disimpan pada
suhu –20oC untuk proses selanjutnya.
Untuk mengetahui keberhasilan metode ekstraksi
yang digunakan, campuran 7,5 цL genom DNA dan 2,5
цL Loading Dye dielektroforesis dalam 0,8 % gel agarose
dalam 1 x TBE (Tris-Boric acid-EDTA) pada tegangan
50 volt. Gel distaining dengan 0,5 цg/mL dalam larutan
ethidium bromida. Hind III marker digunakan sebagai
standar marker genom DNA yang diekstraksi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi DNA
Hasil ekstraksi DNA rumput laut menggunakan
metode konvensional
fenol-kloroform menghasilkan
fragmen tunggal genom yang relatif bersih. Hal ini
menunjukkan bahwa metode ekstraksi DNA yang telah
dikembangkan untuk ikan (hewan) atau tanaman dapat
diaplikasikan pada alga khususnya rumput laut K.
alvarezii
(Gambar 1.)
1
5
2
6
3
77
4
Gambar 1. Genom DNA rumput laut G. verrucosa yang dieksraksi
dengan Metode Fenol-Kloroform, 1=Marker Hind III; 2,3,4 =
Genom DNA
Pita genom DNA yang bersih tanpa latar
belakang mengindikasikakan tingkat kemurnian DNA
yang baik (DNA tidak terdegradasi dan terkontaminasi).
Kontaminasi oleh fenol dan bahan organik lainnya dapat
dilihat dengan munculnya latar belakang yang smear
disepanjang jalur pergerakan pita genom DNA.
terdegradasi dan kontaminasi RNA ditandai dengan
adanya pita yang kabur pada posisi berat molekul yang
rendah.
Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian
proses untuk memisahkan DNA dari komponenkomponen lainnya. Hasil ekstraksi tersebut merupakan
tahapan penting untuk langkah berikutnya dan harus
dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi
Pengukuran Tingkat Kemurnian dan Kuantitas DNA.
Kuantitas dan kualitas DNA diukur melalui
spektrofotometri
sinar
ultra-violet
dengan
alat
spektrofotometer UV-VIS Recording Spektrofotometer
7
Vol. 2 No. 2
Ekstraksi DNA Rumput laut …
Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan
dengan
memanfaatkan
senyawa
kimia
seperti
ethyllenediamine tetraacetic (EDTA), Sodium Dodecyl
Sulfate (SDS) dan Triton X-100. EDTA berfungsi
sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium
(ion ini berfungsi untuk mempertahankan aktifitas enzim
nuklease yang merusak asam nukleat). SDS dan Triton X100 merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak
membran sel dan menyebabkan pecahnya kromosom .
Enzim proteinase
K
dapat
digunakan
untuk
menghancurkan protein dan enzim RNAse digunakan
untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi
secara utuh (Muhammad,S.A., dan Praseno. 1991).
Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara
sentrifugasi. Kemudian molekul nukleotida (DNA dan
RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang
masih ada dengan menggunakan fenol. Dalam proses ini
sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan
kloroform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa
protein dan polisakarida dari larutan.Proses sentrifugasi
dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung
berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung
ependorf.
coklat (Kraan dan Guiry, 1998) dan metode yang
digunakan pada Rhodophyta (Wattier et al., 2000).
Konsentrasi dan kemurnian DNA
Selain dari hasil elektroforesis, keberhasilan
proses ektraksi dapat diketahui dari hasil pengukuran
absorban menggunakan spektrofotometer UV-VIS.
Dengan pengambilan sampel secara acak tanpa
penambahan kalium asetat didapatkan rata-rata jumlah
DNA = 372,0 ng/ цl dengan tingkat kemurnian DNA =
1,4. Pada penggunaan metode fenol kloroform dengan
penambahan kalium asetat dihasilkan rata-rata jumlah
DNA = 226,0 ng/ цl dengan tingkat kemurnian (purity) =
1,824. Hal ini menunjukkan bahwa penggunaan kalium
asetat dapat menanggulangi masalah tingginya kandungan
polisakarida pada rumput laut. Penambahan kalium asetat
sebanyak 10 % dari volume pengambilan larutan setelah
penggunaan kloroform isoamyl alkohol dapat mengurangi
kontaminasi polisakarida atau fenol di dalam larutan (
Kraan S. and Guiry M.D, 1998).
Banyaknya radiasi ultraviolet yang diserap oleh
larutan DNA berbanding lurus dengan banyaknya DNA
dalam sampel. Penyerapan sinar tersebut oleh nukleotida
secara maksimal dicapai pada  260 nm, sedangkan
penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada  280 nm.
Hasil pengukuran tingkat kemurnian dan kuantitas DNA
dapat dilihat pada tabel 1.
Parenrengi (2001) menggunakan metode fenolkloroform pada ekstraksi ikan Kerapu (Epinephelus spp)
dan menggunakan metode yang sama pada ekstraksi
rumput laut Gracilaria verrucosa. Metode fenolkloroform
yang dikembangkan oleh Parenrengi et
al.,(2007) pada G.verrucosa menunjukkan hasil yang
lebih baik dari metode CTAB yang digunakan pada alga
Tabel 1. Tingkat kemurnian dan kuantitas DNA (ng/ цL) pada beberapa sampel rumput laut K. alvarezii, yang diambil
secara acak.
Sampel
Tanpa Penambahan K asetat
Tingkat
Kuantitas
kemurnian
(ng/ цL)
(A260/A280)
Sampel
Penambahan K asetat
Tingkat
Kuantitas
kemurnian
(ng/ цL)
(A260/A280)
MH31
1,83
110
PH 72
1,92
230
PC 66
1,55
170
PH 73
1,83
220
MC 34
1,05
560
PC 79
1,85
240
500
PC 80
1,75
210
1,18
520
PC 82
1,77
230
1,36
372
Jumlah
1,824
226
LH 43
PH 58
Jumlah
1,19
8
Andi Tenriulo, Emma Suryati, dkk
Mar. Chim Acta
Hasil uji tingkat kemurnian DNA sampel PC66
adalah 1,55 nilai tersebut dihasilkan dengan membagi
nilai A260 dengan A280. Molekul DNA dikatakan murni
jika rasio kedua nilai tersebut berkisar antara 1,8 – 2,0.
Kontaminasi protein dan bahan organik lainnya ditandai
dengan rendahnya nilai rasio A260/A280 (<1,8), sebaliknya
kontaminasi fenol ditandai dengan tingginya nilai rasio
tersebut (>2,0). (Linacero et al., 1998 ).
1
2
3
4
5
6
7
Genom DNA dengan Volume dan Konsentrasi yang
berbeda.
Hasil isolasi DNA rumput laut yang dilakukan
dengan metode fenol-kloroform diuji kualitasnya dengan
elektroforesis gel agarose dan volume genom yang
digunakan adalah : 3 цL ; 6 цL; 9 цL; 12 цL; 15 цL; 18
цL.
Pengujian kuantitas DNA sampel PC-66 dengan
alat spektrofotometer menunjukkan hasil absorban atau
A260 = 0,017, sehingga diketahui konsentrasi DNA sampel
PC-66 adalah = 170 ng/ цL yaitu dengan menggunakan
rumus = A260 x faktor pengenceran x 50 = 170 ng/ цL
larutan DNA hasil isolasi. Pada sumur nomor 2 dengan
volume 3 цL berarti jumlah DNAnya adalah 3 x 170 ng/
цL = 510 ng, sumur 3 konsentrasi DNA = 1.020 ng, sumur
4 konsentrasi DNA = 1.530 ng, sumur 5 konsentrasi DNA
= 2.040 ng, sumur 6 konsentrasi DNA = 2.550 ng dan
sumur nomor 7 adalah 18 x 170 = 3.060 ng. Kualifikasi
beberapa volume DNA sampel dilihat pada gambar 2 :
Gambar 2. Hasil elektroforesis genom DNA rumput laut K. alvarezii
PC66 dengan konsentrasi yang berbeda. Ket: (Konsentrasi DNA =
170 ng/ цL. 1= marker Hind III; 2= genom DNA 3 цL; 3= genom
DNA 6 цL ; 4 = genom DNA 9 цL ; = 5 genom DNA 12 цL ; 6 =
genom DNA 15 цL ; Sumur 7 = genom DNA 18 цL).
KESIMPULAN
1. Ekstraksi DNA rumput laut K. alvarezii.dapat dilakukan
dengan metode konvensional fenol-kloroform dengan
sedikit modifikasi.
2. Penambahan kalium asetat pada metode fenolkloroform dapat meningkatkan tingkat kemurnian
DNA. Pada penggunaan metode fenol kloroform
dengan penambahan kalium asetat dihasilkan rata-rata
jumlah DNA = 226,0 ng/цL dengan tingkat kemurnian
(purity) = 1,824 tanpa penambahan kalium asetat
didapatkan rata-rata jumlah DNA = 372,0 ng/цL dengan
tingkat kemurnian DNA = 1,36
3. Semakin besar volume genom yang di loading pada
sumur gel, maka semakin tinggi konsentrasi DNA yang
terkandung di dalam larutan sampel tersebut dan
membentuk pita yang lebih tebal.
Uji kualitas DNA memperlihatkan bahwa genom
dengan konsentrasi yang lebih tinggi memperlihatkan
ketebalan pita yang lebih besar dibandingkan dengan
konsentrasi yang lebih rendah (Gambar.2). Pita yang
nampak pada sumur 2 (konsentrasi genom 510 ng) sangat
tipis dibandingkan dengan sumur lainnya yaitu 3 (1.020
ng), 4(1.530 ng), 5(2.040 ng), 6(2.550 ng),dan 7 (3.060
ng). Hal ini menunjukkan bahwa volume 6 uL
(konsentrasi DNA 1.020 ng) cukup untuk memperlihatkan
band yang jelas. Semakin besar volume genom yang di
loading pada sumur gel, maka semakin tinggi konsentrasi
DNA yang terkandung di dalam larutan sampel tersebut.
DAFTAR PUSTAKA
Angka,S.L., dan M.T.Suhartono, 2000. Bioteknologi Hasil Laut. Pusat Kajian Sumberdaya Pesisir dan Lautan Institut
Pertanian Bogor. hal 47
Asahida, T., T. Kabayashi, K. Saitoh, and I. Nakayama. 1996. Tissue preservation and total DNA extraction from fish store
at ambient temperature using buffer containing high concentration of urea. Fisheries Science 62(5):727-730.
Doty, 2000. The Production an Use Eucheuma Departement Of Botany University of Hawaii Honolulu, Hawai, p.45.
Kraan, S., dan M.D. Guiry, 1998. Strain selection in the edible brown seaweed Alaria esculenta: Genetic fingerprinting and
hybridization studies under laboratory conditions. Departement of Botany, Martin Ryan Science Institute, National
University of Ireland, Galway, Ireland, 30 pp.
9
Vol. 2 No. 2
Ekstraksi DNA Rumput laut …
Linacero, R., J. Rueda and A.M.Vazquez. 1998. Quantification of DNA. Pages 18-21 in Karp, A., P. G. Isaac, and D. S.
Ingram (Eds.) Molecular Tools for Screening Biodiversity: Plants and Animals. Chapman and Hall. London,
Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras.
Muhammad,S.A., dan Praseno (Eds.). 1991. Pengantar Kloning Gena. Yayasan Essentia Medica, Yogyakarta. Hal 31-33.
Parenrengi,A., Sulaeman, E. Suryati dan A.Tenriulo. 2007. Karakteristik Genetik Rumput Laut Gracillari verrucosa dari
Beberapa Sumber. Makalah telah disampaikan pada Konfrensi Masyarakat Akuakultur Indonesia tgl 5 – 7 Juli
2007 di Surabaya. 11 hal.
Parenrengi, A., 2001. Studies on genetic variability of groupers (Epinephelus spp.) from Indo-Malaysian waters using PCRRAPD analysis. Master thesis of Kolej University Terengganu, Universiti Putra Malaysia, Malayasia, 174 pp
Sulandari,S dan M.S.A. Zein. 2003. Panduan Praktis Laboratorium DNA. Bidang Zoologi Pusat Penelitian Biologi LIPI.hal
72-87
Wattier, R.A., P.A. Prodohl and C.A. Maggs., 2000. DNA isolation protocol for red seaweed (Rhodophyta). Plant
Molecular Biology Reporter 18:275-281.
10